JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

Abstract

רוב האנרגיה של התא מתקבלת באמצעות השפלה של גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו על ידי מסלולים שונים המתכנסים על מערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS), אשר מוסדר בתגובה לדרישות הסלולר. מולקולת השומנים קואנזים Q (CoQ) חיונית בתהליך זה על ידי העברת אלקטרונים ל- III מורכב בשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC) באמצעות מחזורי חמצון/הפחתה קבועים. מצב המיטוכונדריה, ובסופו של דבר, בריאות התא ניתן להעריך על ידי מדידת צריכת חמצן ETC באמצעות בדיקות respirometric. מחקרים אלה מבוצעים בדרך כלל בשורות תא מבוססות או ראשוניות אשר היו בתרבית במשך מספר ימים. בשני המקרים, הפרמטרים של הנשימה שהושגו עשויים לסטות ממצבים פיזיולוגיים רגילים בכל איבר או רקמה נתון.

בנוסף, המאפיינים המהותיים של סיבים בודדים מתורבתים המבודדים משרירי השלד מעכבים סוג זה של ניתוח. מאמר זה מציג פרוטוקול מעודכן ומפורט לניתוח נשימה במיטוכונדריה מבודדת טרייה משריר השלד של העכבר. אנו מספקים גם פתרונות לבעיות פוטנציאליות שעלולות להתעורר בכל שלב של התהליך. השיטה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת כדי להשוות את שיעורי צריכת החמצן במודלים שונים של עכבר מהונדס וללמוד את התגובה המיטוכונדריאלית לטיפולים תרופתיים או גורמים אחרים כגון הזדקנות או מין. זוהי שיטה אפשרית להגיב לשאלות מכריעות על חילוף החומרים והרגולציה הביו-אנרגטית המיטוכונדריאלית.

Introduction

המיטוכונדריה הם האברונים המטבוליים העיקריים בתא1. אברונים מיוחדים אלה סגורים ממברנה להשתמש במולקולות מזין כדי לייצר אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP) על ידי OXPHOS. תהליך זה מסתמך על העברת אלקטרונים ממולקולות תורמות בסדרה של תגובות redox ב ETC2. CoQ הוא השומנים הפעילים היחידים המיוצרים באופן אנדוגני בכל הקרומים התאיים וליפופרוטאינים במחזור שמראה תפקוד נוגד חמצון3. זהו מרכיב חיוני של ETC, העברת אלקטרונים מ NADH תלוי קומפלקס I ו FADH2 תלוי קומפלקס II מורכב מורכב III מורכב, אם כי צמצומים רבים אחרים יכולים להניע את ההפחתה של CoQ מיטוכונדריאלי ליוביקינול כצעד חובה במסלולים מטבוליים תאיים מרובים4,5.

לאורך כל התהליך, שיפוע פרוטונים אלקטרוכימי נוצר על פני הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית, אשר הופכת לאנרגיה פעילה ביולוגית על ידי V2 קומפלקס סינתאז ATP. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מוביל למספר עצום של מצבים פתולוגיים המשפיעים בעיקר על רקמות עם דרישות אנרגיה גבוהה - המוח, הלב, ושרירי השלד6,7. לכן, זה בסיסי לפתח שיטות לנתח במדויק ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית כדי לחקור את תפקידה בבריאות ובמחלות, במיוחד ברקמות אנרגטיות מאוד כגון שרירי השלד.

אלקטרודת חמצן מסוג קלארק שימשה באופן קלאסי במחקר של נשימה מיטוכונדריאלית8. עם זאת, מערכת זו נעקרה בהדרגה על ידי טכנולוגיות ברזולוציה גבוהה יותר, עם טכנולוגיות צריכת חמצן מבוססות מיקרופלט כגון מנתחי סוסון ים XF Agilent להיות פופולרי במיוחד9. בשדה שרירי השלד, מחקרים אלה מתנהלים בדרך כלל בתאים מתורבתים, בעיקר בקו התאים של העכבר המונצח C2C12 או בתרביות ראשוניות שמקורן בתאי לווין10,11. עם זאת, מחקרים אלה אינם מסכמים באופן מלא את המצב ב- vivo, במיוחד כאשר חוקרים ביולוגיה מיטוכונדריאלית ותפקוד ברמת הרקמה על עלבונות ספציפיים, התערבויות לא גנטיות או מניפולציות גנטיות.

יתר על כן, בדיקות נשימה בתאים מורכבות יותר בשל גורמים נוספים, כולל דרישה חוץ-מיטוכונדריאלית של ATP ומצעים לבדיקה או אירועי איתות, אשר עלול להטעות את הפרשנות של התוצאות. לחלופין, ניתן גם להשתמש יחיד או חבילות של myofibers מבודד טרי מן השרירים. עם זאת, שיטת הבידוד מאתגרת מבחינה טכנית ואפשרית רק עבור כמה סוגי שרירים. במקרה זה, flexor digitorum brevis (FDB) ו- extensor digitorum longus השרירים (EDL) משמשים בעיקר 10,12,13, אם כי כמה דיווחים מתארים את השימוש בסוגי שרירים אחרים, כמו גם 14,15.

פרופיל ביו-אנרגטי של מקטעי שרירי שלד דווח גם הוא16. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי שרירים שלמים ניתן ללמוד (המחברים מראים כי חיתוך דרך סיבים אינו מפריע לתוצאות בהשוואה myofibers מבודד). עם זאת, הגישה המיטוכונדריאלית למצעים ומעכבי בדיקה מוגבלת, ולכן, רק כמה פרמטרים ניתן למדוד16. לבסוף, מיטוכונדריה מבודדת יכולה להיות מועסקת גם 9,17,18,19. במקרה זה, המיטוכונדריה מאבדת את הסביבה הציטוטוסולית שלהם, מה שעלול להשפיע על תפקודם. לעומת זאת, שיטה זו מבטיחה גישה למצעים ומעכבים, מאפשרת ניתוח של שפע של סוגי מדגמים, ובדרך כלל דורשת פחות חומר.

מאמר זה מתאר שיטה לביצוע הפרופיל הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה המבודדת משריר השלד של העכבר באמצעות בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרופלסטיק (איור 1). בפרט, שלושה פרוטוקולים מפורטים: בדיקת צימוד, CA כדי להעריך את מידת הצימוד בין ETC ומכונות OXPHOS; אסאי זרימת האלקטרונים, EFA כדי למדוד את הפעילות של מתחמי ETC בודדים; ואת הבדיקה BOX כדי לקבוע את יכולת חמצון β מיטוכונדריאלי. ראוי לציין, רק כמויות קטנות של דגימות נדרשות בהשוואה לשיטות נשימה קונבנציונליות. פרוטוקול הבידוד המשמש כאן שונה מהשיטה שפורסמה במקום אחר18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

איסוף דיור ורקמות של עכברים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה פבלו דה אולביד (סביליה, ספרד; פרוטוקולים 24/04/2018/056 ו-12/03/2021/033) בהתאם לצו המלכותי הספרדי 53/2013, הוראה אירופית 2010/63/EU, והנחיות רלוונטיות אחרות.

1. הכנת מניות, חוצצים, ריאגנטים לבדיקות הנשימה

  1. הכן את פתרונות המלאי הבאים, אשר ניתן לאחסן בטמפרטורה שצוינה במשך חודשים. השתמש ב- H2O אולטרה-פורמט בכל המקרים.
    1. יש להמיס טבליות מלוחות עם אגירת פוספט (PBS) ב-H2O (טבליה אחת לכל 200 מ"ל של H2O) כדי להכין 1x PBS. יש לאתחלק אוטומטית את הפתרון ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).
    2. להמיס 2 גרם של כדורי NaOH ב 50 מ"ל של H2O כדי להכין 1 M NaOH.
    3. הכן מניות KOH של 0.1 M, 1 M, 5 M ו- 10 M KOH לכיול pH.
    4. הוסיפו 14.612 גרם של EDTA ל-70 מ"ל של H2O. הוסיפו כדורי NaOH עד שה-pH יגיע ל-8.0 כך ש-EDTA יתמוסס לחלוטין. הוסף את סאטיס הקוונטי H2O (QS) ל-100 מ"ל. סגור אוטומטית את פתרון 0.5 M EDTA (pH 8) המתקבל ואחסן אותו ב- RT.
    5. הוסיפו 19 גרם EGTA ל-70 מ"ל של H2O. הוסיפו כדורי NaOH עד שה-pH יגיע ל-8.0 כדי לאפשר ל-EGTA להתמוסס במלואו. הוסף H2O QS ל-100 מ"ל. סגור אוטומטית את פתרון 0.5 M EGTA (pH 8) המתקבל ואחסן אותו ב- RT.
    6. הוסף 2 מ"ל של 0.5 M EDTA ל-98 מ"ל של PBS. אחסן את פתרון EDTA/PBS של 10 מ"מ מ"מ ב- RT.
    7. יש להמיס 5.958 גרם HEPES ב-40 מ"ל H2O. התאימו את ה-pH ל-7.2 עם KOH ו-QS ל-50 מ"ל עם H2O. סננו את מאגר ה-HEPES של 0.5 מ"מ באמצעות רשת של 0.45 מיקרומטר ואחסנו אותו ב-RT.
    8. להמיס 3.402 גרם של KH2PO4 בעד 50 מ"ל של H2O. לסנן את הפתרון 0.5 M KH2PO4 וכתוצאה מכך באמצעות רשת 0.45 מיקרומטר ואחסן אותו ב RT.
    9. להמיס 9.521 גרם של MgCl2 נטול מים עד 100 מ"ל של H2O. Autoclave את הפתרון 1 M MgCl2 וכתוצאה מכך ולאחסן אותו ב RT.
      הערה: מכיוון שמדובר בתגובה אקסותרמית, המשיכו בזהירות והמיסו את ה-MgCl2 על הקרח.
  2. הכן פתרונות מלאי מצע ומעכבים (ראה טבלה 1). Aliquot ולאחסן אותם ב -20 °C (50 °F). הימנע מחזורי הקפאה-הפשרה. כחריג, תמיד להכין חומצה פירובית מיד לפני השימוש.
    1. הכנה ב- H2O אולטרה-פורה: 0.5 M תמצית, 0.5 M חומצה פירובית, 0.5 M חומצה מאלית, 100 mM ADP, 1 M חומצה אסקורבית, ו 50 מ "מ N, N, N ′,N′,N′-tetramethyl-para-פנילן-דיאמין (TMPD) (מוגן מפני אור).
    2. היכונו ב-100% דימתיל סולפוקסיד (DMSO): 50 מ"מ פלמיטויל-ל-קרניטין, רוטנון 4 מ"מ, 20 מ"מ קרבוניל ציאניד-פ-טריפלואורומאתוקסידרזון (FCCP), 4 מ"מ אוליגומיצין ו-5 מ"מ אנטימיצין A.
      הערה: אין לחרוג מריכוז DMSO סופי של 0.1% בבארות המיקרו-פלטה. לכן, להכין פתרונות מלאי מרוכזים מאוד להישאר מתחת למגבלה זו.
  3. הכן את המאגרים לבידוד המיטוכונדריה וכימות חלבונים טריים ביום הניסוי. השתמש ב- H2O אולטרה-פורמט בכל המקרים ולשמור את כל המאגרים על קרח אלא אם צוין אחרת.
    הערה: כדי לחסוך זמן, ניתן לשקול את כל הריאגנטים ולשמור אותם במיכלים המתאימים (למשל, צינורות 15 מ"ל) בטמפרטורה הנכונה ביום הקודם.
    1. להכנת 10% חומצות שומן חופשיות (FFA) BSA, יש להמיס ביסודיות 150 מ"ג FFA BSA ב-1.5 מ"ל של H2O על ידי גלגל היפוך/סיבובי. אין לערבב מערבולת כדי למנוע קצף.
    2. כדי להכין 1x ברדפורד ריאגנט, לדלל את פתרון מניות מסחרי 5x עם H2O ולשמור אותו בחושך ב RT.
    3. כדי להכין 8x מיטוכונדריה חוצץ (MB), להמיס 4.112 גרם של סוכרוז ו 763 מ"ג של HEPES ב 15 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2, להוסיף 1.6 מ"ל של 10% FFA BSA ו QS ל 20 מ"ל עם H2O.
    4. כדי להכין 20 מ"ל של מאגר בידוד 1 (IB1) (4 מ"ל בשימוש לדגימה), להמיס 400 μL של 0.5 M EDTA, 784 מ"ג של D-מניטול, ו 2.5 מ"ל של 8x MB ב 15 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2 ו QS עם H2O.
    5. כדי להכין 5 מ"ל של מאגר בידוד 2 (IB2) (500 μL בשימוש לכל מדגם), להמיס 30 μL של 0.5 M EGTA, 196 מ"ג של D-מניטול, ו 625 μL של 8x MB ב 4 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2 ו QS עם H2O.
    6. כדי להכין 5 מ"ל של מאגר Resuspension (RB) (200 μL בשימוש לכל מדגם), להמיס 120 מ"ג של סוכרוז, 191.3 מ"ג של D-מניטול, 50 μL של 0.5 M HEPES, ו 10 μL של 0.5 M EGTA ב 4 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2 ו- QS עם H2O.
    7. כדי להכין 2x פתרון אסאיט מיטוכונדריאלי-1 (MAS-1), להמיס 1.199 גרם סוכרוז, 2.8 גרם מניטול, 1 מ"ל של 0.5 M KH2PO4, 250 μL של 1 M MgCl2, 200 μL של 0.5 M HEPES, ו 100 μL של 0.5 M EGTA ב 20 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2 ו QS ל 25 מ"ל עם H2O. שמור בקרח לתקופות קצרות. לתקופות ארוכות יותר, לשמור אותו ב 4 °C (65 °F) כדי למנוע משקעים.
    8. כדי להכין 1x צימוד Asay בינוני (CAM), להכין שני מאגרים שונים מבוססי MAS-1: 1) CAM + BSA עבור CA לבדוק כראוי, ו 2) CAM-BSA להכנת מעכבי הבדיקה. תמיד לשמור על יחס פירובט:מלאטה ב 10:1.
      הערה: כמו BSA יכול לסתום את יציאות ההזרקה, לדלל את המעכבים ב- מצלמת ללא BSA.
      1. כדי להכין CAM + BSA, לדלל 300 μL של 0.5 M חומצה פירובית, 30 μL של 0.5 M חומצה מאלית, ו 7.5 מ"ל של 2x MAS-1 ב 6 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2. הוסף 300 μL של 10% FFA BSA ו- QS ל 15 מ"ל עם H2O.
      2. כדי להכין CAM-BSA, לדלל 120 μL של 0.5 M חומצה פירובית, 12 μL של 0.5 M חומצה מאלית, ו 3 מ"ל של 2x MAS-1 ב 2 מ"ל של H2O. כוונן את ה- pH ל- 7.2 ו- QS ל- 6 מ"ל עם H2O.
    9. כדי להכין 1x אלקטרון זרימת אסאיט מדיום (EFAM), הכן הן מאגרי EFAM המכילים BSA והן מאגרי EFAM ללא BSA.
      1. כדי להכין EFAM + BSA, לדלל 300 μL של 0.5 M חומצה פירובית, 60 μL של 0.5 M חומצה מאלית, 3 μL של 20 mM FCCP, ו 7.5 מ"ל של 2x MAS-1 ב 6 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2. הוסף 300 μL של 10% FFA BSA ו- QS ל 15 מ"ל עם H2O.
      2. כדי להכין EFAM-BSA, לדלל 120 μL של 0.5 M חומצה פירובית, 24 μL של 0.5 M חומצה מאלית, 1.2 μL של 20 mM FCCP, ו 3 מ"ל של 2x MAS-1 ב 2 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2 ו QS ל 6 מ"ל עם H2O.
    10. כדי להכין 1x β-חמצון בינוני (BOXM), להכין פתרונות BOXM המכילים BSA וללא BSA.
      1. להכנת BOXM + BSA, לדלל 12 μL של 50 mM פלמיטויל-L-קרניטין, 30 μL של 0.5 M חומצה מאלית, ו 7.5 מ"ל של 2x MAS-1 ב 7 מ"ל של H2O. להתאים את ה- pH ל 7.2. הוסף 300 μL של 10% FFA BSA ו- QS ל 15 מ"ל עם H2O.
      2. כדי להכין BOXM-BSA, לדלל 4.8 μL של 50 mM palmitoyl-L-קרניטין, 12 μL של 0.5 M חומצה מאלית, ו 3 מ"ל של 2x MAS-1 ב 2 מ"ל של H2O. כוונן את ה- pH ל-7.2 ו- QS ל- 6 מ"ל עם H2O.

2. ניתוח שרירים, הומוגניזציה ובידוד מיטוכונדריאלי

  1. מניחים את כל החומרים והמאגרים על הקרח. ודא שכל החומרים קרים כקרח במהלך כל ההליך כדי להגן על המיטוכונדריה מפני נזק.
  2. מניחים שלוש כוסות 50 מ"ל לכל מדגם על קרח, ולהוסיף את הפתרונות הבאים: 10 מ"ל של PBS בכוס 1, 10 מ"ל של 10 מ"ל EDTA / PBS בכוס 2, ו 4 מ"ל של IB1 בכוס 3.
  3. המתת חסד לעכבר על ידי פריקת צוואר הרחם. הימנע המתת חסד CO2 כמו שרירי השלד יכול להיות היפוקסי, מפריע ניתוחי נשימה.
  4. יש לרסס את החלק האחורי הימני ב-70% אתנול כדי למנוע מהפרווה להשיל, והדביקו את הגפה ללוח הניתוחים של הפקק. תדביק גם את השמאל הקדמי.
  5. בצע חתך עם אזמל חד פעמי סטרילי דרך העור מכף רגל ועד ראש.
  6. לאחוז את העור עם מלקחיים שיניים בגובה הקרסול לחתוך אותו עם מספריים עדינים סביב הקרסול.
  7. הקל את העור הרחק מהשרירים שמתחתיו עם פינצטה עדינה ביד אחת תוך משיכתו למעלה עם מלקחיים בעלי שיניים ביד השנייה.
  8. ניתח את כל שרירי השלד מהקרסול ועד הברך (איור 2).
    1. הסר את כל רקמת החיבור מעל השריר הקדמי tibialis (TA) כדי להקל על מיצוי שרירים באמצעות פינצטה עדינה ומספריים.
    2. מצא את ארבעת הגידים הדיסטליים של שריר ה- EDL וחתך אותם קרוב להכנסות שלהם בבהונות. אתר את גיד ת"א דיסטלי וחתוך אותו קרוב להכנסתו, תמיד מתחת לקרסול.
    3. בזהירות למשוך את גידי ת"א ו- EDL מעל הקרסול כדי לשחרר את הקצוות הפתוחים.
    4. לאחוז את הקצוות הרופפים של הגידים ולהקל על השרירים הרחק משאר השרירים והעצמות על ידי משיכתם למעלה. השתמש פינצטה עדינה או מספריים כדי להקל על התהליך. המשך בזהירות כדי למנוע התכווצות מיופייבר.
    5. חותכים את הגיד הפרוקסימלי של EDL ושריר ת"א קרוב ככל האפשר לפיקת הברך.
    6. הפוך את העכבר כדי להמשיך עם גסטרוקנימוס (GA) ומיצוי שריר סולוס.
    7. לאחוז בכיס שנוצר בין שרירי הזרוע ואת GA עם מלקחיים שיניים. השתמש במספריים עדינות כדי להפריד את השרירים האלה ולדמיין את גיד GA הפרוקסימלי.
    8. אוחזים בגיד אכילס במלקחיים עדינים וחותכים אותו בזהירות במספריים עדינות. שחררו את שרירי ה-GA והסוליה מהעצם הבסיסית על ידי משיכתם דרך הגידים שלהם. חותכים את גיד GA הפרוקסימלי משחרר אותו יחד עם הסוליה הבסיסית.
    9. בזהירות לנתח את השרירים הנותרים מן הגיד לגיד לאחר אותו הליך עד רק עצמות להישאר.
    10. הצמד מחדש את העכבר במצב ההתחלתי כדי לנתח את שריר הארבע ראשי.
    11. להשליך את רקמת השומן מעל quadriceps בצד הפרוקסימלי באמצעות מלקחיים שיניים ומספריים עדינים.
    12. הכנס פינצטה עדינה בין הארבע ראשי לעצם הירך והזז אותם בשני הכיוונים לאורך ציר עצם הירך כדי להפריד את השריר מהעצם.
    13. אוחזים בגידי השרירים הדיסטליים עם מלקחיים בעלי שיניים וחותכים את הגיד במספריים עדינות קרוב ככל האפשר לפיקת הברך.
    14. משכו את שריר הארבע ראשי למעלה ושחררו אותו בהכנסה הפרוקסימלית עם מספריים עדינות.
  9. חזור על שלבים 4-8 ממקטע זה עם האחורי השמאלי.
  10. יש לשטוף תחילה את כל השרירים בכוס 1 ולאחר מכן בכוס 2.
  11. מעבירים את כל השרירים לכוס 3 וטחונים דק את כל השרירים עם מספריים חדים על הקרח.
  12. מעבירים את ההשעיה לצינור C (מכסה סגול), תמיד שומרים אותו בקרח.
  13. סגור בחוזקה את צינור C ולחבר אותו הפוך על השרוול של homogenizer. ודא כי החומר לדוגמה נמצא באזור של המסובב / סטטור. בחר את התוכנית של דקה אחת הנקראת m_mito_tissue_01.
  14. מחלקים את ההומוגנט לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגות 2 מ"ל וצנטריפוגה ב-700 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחנית.
  15. העבר את supernatants לצינורות חדשים 2 מ"ל prechilled, בזהירות הימנעות שומן ורקמות לא הומוגניות. אחסן את הכדורים בטמפרטורה של מינוס 80 °C לקביעת טוהר פיצול (שבר N) (איור 3).
  16. צנטריפוגה supernatants ב 10,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F).
  17. העבר את supernatants לצינורות חדשים 2 מ"ל prechilled ולתייג אותם כמו Supernatant מספר 1 (SN1). אחסנו אותם בטמפרטורה של מינוס 80 °C לקביעת טוהר הפיצול (איור 3).
  18. Resuspend ולשלב את שני הכדורים בנפח כולל של 500 μL של IB2 בקרח.
  19. צנטריפוגה ב 10,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4°C.
  20. מעבירים את הסופר-נרטיב לצינור חדש עם 2 מ"ל מראש ומתייגים אותו כמספר 2 סופר-נרטיבי (SN2). אחסן אותו בטמפרטורה של 80 °C (80 °C) לקביעת טוהר הפיצול (איור 3).
  21. Resuspend גלולה המיטוכונדריאלית הסופית ב 200 μL של RB. הקצו במהירות 10 μL לכימות חלבונים והוסיפו מיד 10 μL של 10% FFA BSA למתלה המיטוכונדריאלי הנותר כדי למנוע נזק.
  22. קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת ברדפורד.
    1. עבור העקומה הסטנדרטית, להכין 30 μL של דילול סדרתי של ריכוז ידוע של חלבון במאגר RB. לדוגמה, יש להשתמש ב-1 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ג/מ"ל, 0.25 מ"ג/מ"ל, 0.125 מ"ג/מ"ל, 0.0625 מ"ג/מ"ל ו-0 מ"ג/מ"ל של BSA.
    2. הכן 1:3 ו 1:6 דילולים סדרתיים של דגימות המיטוכונדריה במאגר RB.
    3. בצלחת שטוחה-תחתון 96 היטב, טען תחילה 2.5 μL של מדגם / סטנדרטי לבאר. הבא, להוסיף 10 μL של 1 M NaOH לכל מדגם, ולבסוף, 200 μL של 1x ברדפורד ריאגנט. מערבבים היטב, הימנעות בועות אוויר. בדוק חזותית שצבע הדגימות נמצא בתוך קו הכיול. תמיד לבצע את הניתוח בשלושה עותקים.
    4. לדגור על הצלחות במשך 5 דקות ב RT בחושך, ולקרוא את הספיגה ב 595 ננומטר בספקטרופוטומטר microplate.
    5. חשב את העקומה הסטנדרטית על-ידי התוויית ערכי הספיגה (ציר y) לעומת ריכוז החלבון המתאים של הדילולים שהוכנו בשלב 22.1 בסעיף זה (ציר x).
    6. חשב את הכמות הכוללת של חלבון בדגימות המיטוכונדריה על ידי אקסטרפולציה עם העקומה הסטנדרטית.

3. הכנת בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרופלט

  1. העניק לחות לחיישן הבדיקה השופעת לפחות 12 שעות לפני הניסוי עם 1 מ"ל של חיץ כיול לבאר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (ללא CO2).
    הערה: ניתן להשתמש בחיישנים עם לחות למשך עד 72 שעות. יש לטפל במחסנית בזהירות במהלך שלב זה: אם משהו נוגע בחיישנים, רגישות המדידה עלולה להיות מושפעת.
  2. Prechill צנטריפוגה הכנה עם רוטור מיקרופלט דלי מתנדנד ומתאמי microplate המתאים ב 4 °C (60 °F).
  3. הפעל את המחשב, פתח את תוכנת הניתוח ובחר את הפרוטוקול הרצוי.
    הערה: קליק נשמע כאשר התוכנה מתחברת למכשיר מדידת צריכת החמצן. חיישן החימום צריך להיות ירוק ב 37 °C (50 °F) לפני תחילת הניסוי.
  4. הכן את פתרונות המעכבים מהמניות המצוינות בסעיף 1, שלב 2 על פי הבדיקה שתבוצע. הכן מספיק אמצעי אחסון עבור כל פתרון. עיין בטבלה 1 ובטבלה 2 לעיון.
  5. הוסף את הנפח המתאים של כל מעכב בכל יציאה, הכנס את המחסנית למכשיר מדידת צריכת החמצן והתחל בכיול.
    הערה: הוספת מעכב למחסנית והכנסת המחסנית למכשיר אורכת 15-20 דקות. ודא שרכיבי המחסנית הנכונים מוצגים. ניתן להשליך את מכסה המחסנית ואת המאיץ ההידרו בזמן שיש צורך במחסנית חיישן ומקום השירות.
  6. צנטריפוגה ההשעיה המיטוכונדריאלית המרוכזת של סעיף 2, שלב 21 ב 10,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F).
  7. Resuspend גלולה מיטוכונדריאלי ב 100 μL של 1x CAM + BSA, 1x EFAM + BSA, או 1x BOXM + BSA, בהתאם לפרוטוקול להתבצע.
  8. לדלל עוד יותר את המדגם המיטוכונדריאלי מרוכז לריכוז סופי 0.2 מיקרוגרם / μL במדיום הבדיקה המקביל.
  9. זרע 50 μL של ההשעיה (סה"כ 10 מיקרוגרם של חלבון) לבאר במיקרוגל 24-welled מראש על קרח. אין להוסיף מיטוכונדריה בבארות תיקון הרקע; הוסף רק את מדיום הבדיקה המתאים. אחסן את ההשעיה המיטוכונדריאלית הנותרת בטמפרטורה של מינוס 80 °C לקביעת טוהר הפיצול (איור 3).
  10. לסובב את המיקרופלט בצנטריפוגה הכנה prechilled ב 2,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (4 °F). משקל נגד לאיזון בהתאם.
  11. מחממים את המדיום הנותר ב 37 °C (50 °F) במהלך צנטריפוגה microplate.
  12. לאחר צנטריפוגה, להשאיר את המיקרופלט על הספסל במשך 5 דקות כדי שיווי משקל. הוסף 450 μL של מדיום בדיקה חמה עבור נפח סופי של 500 μL לבאר ב RT. לעשות את זה לאט ובזהירות, הוספת המדיום לקיר הבארות, כדי למנוע ניתוק המיטוכונדריה.
  13. מניחים את המיקרופלט מיד במכשיר מדידת צריכת החמצן ללא המכסה, ומתחילים את הפרוטוקול (טבלה 3). ודא כי הצעד הראשון הוא דגירה של 10 דקות כדי לאפשר למיקרופלט להתחמם.
  14. לאחר סיום הניסוי, הסר את המחסנית ואת המיקרו-לוחית, כבה את המכשיר והתחל את הניתוח.

4. ניתוח התוצאות

  1. במקרה של בדיקות CA ו- BOX, בצע את הניתוחים הבאים:
    1. שיא צריכת O2 nonmitochondrial, אשר תואם את הממוצע של הערכים שהושגו לאחר אנטימיצין A והזרקת רוטנון.
      הערה: אנטימיצין A ורוטנון הם מעכבי III ו- I מורכבים, בהתאמה.
    2. חשב נשימה בסיסית על-ידי חיסור צריכת O2 לא מיטוכונדריאלית מערכי בסיס (נקודות מדידה 1 ו- 2).
    3. הפחת צריכת O2 לא מיטוכונדריאלית מהערכים לאחר הזרקת מצע V המורכב ADP (הזרקה A) כדי לקבוע מצב מיטוכונדריאלי III.
    4. להפחית צריכת O2 nonmitochondrial מן ערכי הנשימה לאחר הזרקה של מוליגומיצין מעכב V מורכב (הזרקה B) כדי לקבל מצב מיטוכונדריאלי IVo.
    5. חשב מצב מיטוכונדריאלי IIIu על ידי ניכוי צריכת O2 לא מיטוכונדריאלית מהזרקת FCCP לאחר נשימה (הזרקה C).
      הערה: FCCP הוא זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי רב עוצמה uncoupylation. סינתזת ATP נעקפת בנוכחותה, ו- ETC משיגה פעילות מקסימלית.
    6. להפחית ערכי נשימה בסיסית מן המדינה המיטוכונדריאלית IIIu ערכים כדי להשיג קיבולת חילוף מיטוכונדריאלי, המהווה את היכולת לייצר ATP נוסף במקרה של ביקוש אנרגיה מוגברת.
    7. חלוקת מצב מיטוכונדריאלי IIIu לפי ערכי IVo של המדינה כדי לקבל את יחס בקרת הנשימה (RCR).
      הערה: ערכי RCR שליליים או ריקים מציינים כי צימוד מיטוכונדריאלי מושפע.
  2. בהתייחס ל- EFA, בצע את החישובים הבאים:
    1. להשיג פעילות שיורית על ידי חישוב הערך הממוצע לאחר רוטנון ו אנטימיצין A הזרקה (זריקות A ו- C).
    2. חשב פעילות מורכבת I ל- IV (CI-CIV) על-ידי חיסור פעילות שיורית מערכי הבסיס (נקודות מדידה 1 ו- 2).
    3. לחסר את הפעילות השיורית מן הערכים לאחר הזרקה של תמצית מצע CII (הזרקה B) כדי להשיג פעילות CII-CIII-CIV.
    4. חשב פעילות אזרחית על ידי ניכוי הפעילות השיורית מהערכים שהושגו לאחר הזרקת הסוכנים להפחתת ציטוכרום c, חומצה אסקורבית ו- TMPD (הזרקה D).
  3. ייצגו את כל התוצאות באמצעות התוויות עמודות, כמו באיור 4, כדי לחלץ מסקנות מתאימות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר ניתוח in vivo של נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות בידוד של המיטוכונדריה משריר שלד העכבר. חלוקה לרמות של השיטה מוצגת באיור 1. לאחר ניתוח שרירי השלד מההינדלימבים (איור 2), הרקמות הומוגניות והמיטוכונדריה מטוהרת, בתנאים איזוטוניים, באמצ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

לכל השיטות המשמשות לחקר הנשימה המיטוכונדריאלית יש מגבלות; לפיכך, חשוב לבחור את השיטה המתאימה ביותר לשאלה ניסיונית ספציפית. עבודה זו מספקת פרוטוקול מעודכן ומפורט כדי לבודד את המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר כדי לבצע בדיקות נשימה שונות כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה. ואכן, המחקר של ביו-א?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

אנו רוצים להודות לחואן ג'יי טנה על השימוש בהומוגניזר ובמתקני הפרוטאומיקה של CABD וגידול בעלי חיים על תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, התרבות והספורט הספרדי באמצעות מלגה FPU16/03264 ל- J.D.H.C., האגודה Française contre les Myopathies (AFM) באמצעות מענק מלגה #22450 ל- C.V.-G., מענק מוסדי MDM-2016-0687 (יחידת המצוינות מריה דה מאזטו, המחלקה לרגולציה גנטית ומורפוגנזה ב- CABD) ו- BFU2017-83150-P ל- J.J.C. מענק החונטה דה אנדלוסיה P18-RT-4572, תוכנית המימון של FEDER מהאיחוד האירופי, ומשרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי מעניקים RED2018-102576-T ל- P.N.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ADPSigmaA5285Stock at -20 °C
AKT antibodyCell Signaling TechnologyC67E7Rabbit (Host species)
anti-Goat HRPSigma401504Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRPCell Signaling#7076Horse (Host species)
Antimycin ASigmaA8674Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRPCell Signaling#7074Goat (Host species)
Ascorbic acidSigmaA5960Stock at RT
Bactin antibodySigmaMBS4-48085Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit IIBio-Rad5000002It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-FreeCalbiochem126575Stock at 4 °C
C tubeMiltenyi Biotec130-093-237Purple lid
Calnexin antibodyThermoFisherMA3-027Mouse (Host species)
D-mannitolSigmaM4125Stock at RT
EDTABDH280254DStock at 4 °C
EGTASigmaE-4378Stock at RT
FCCPSigmaC2920Stock at -20 °C
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235Homogenizer
HEPESSigmaH3375Stock at RT
HSP70 antibodyProteintech10995-1-APRabbit (Host species)
LDH-A antibodySanta Cruz BiotechnologySC27230Goat (Host species)
Magnesium chlorideChemCruzsc-255260AStock at RT
Malic acidSigmaP1645Stock at RT
Microplate spectrophotometerBMG LABTECH GmbHPOLARstar OMEGA S/N 415-0292Stock at RT
Milli-Q waterMillipore systemF7HA17757AUltrapure water
mtTFA antibodySanta Cruz BiotechnologySC23588Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibodyNovus BiologicalsNB300-14755Mouse (Host species)
OligomycinSigmaO4876Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitineSigmaP1645Stock at -20 °C
PBS tabletsSigmaP4417-100TAB1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphateChemCruzsc-203211Stock at RT
Potassium hydroxideSigma60377Stock at RT
Pyruvic acidSigma107360Stock at 4 °C
RotenoneSigmaR8875Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzerAgilent Technologies420179XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak miniAgilent Technologies102342-100The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
SuccinateSigmaS7626Stock at RT
SucroseSigmaS9378Stock at RT
TIMM23 antibodyAbcamab230253Rabbit (Host species)
TMPDSigmaT7394Stock at -20 °C
TOMM20 antibodyAbcamab56783Mouse (Host species)
VDAC antibodyAbcamab15895Rabbit (Host species)

References

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  3. Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
  4. Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
  5. Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
  6. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080(2016).
  7. Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
  8. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  9. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746(2011).
  10. Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977(2018).
  11. Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
  12. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  13. Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
  14. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
  15. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
  16. Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
  17. Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350(2015).
  18. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452(2011).
  19. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  20. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  21. Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
  22. Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42(2016).
  23. Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
  24. Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217(2015).
  25. Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
  26. Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved