أخذ عينات الدم المتكررة من الوريد تحت الترقوة للفأر الواعي

Summary

يصف البروتوكول الحالي طريقة بسيطة وفعالة لجمع الدم من الوريد تحت الترقوة في الفئران. إنه يتيح أخذ عينات سريعة وفي الوقت المناسب ويمكن التعرف عليها بسهولة دون تخدير ويحصل على دم عالي الجودة من خلال جمع العينات المتكررة.

Abstract

تستخدم الفئران على نطاق واسع في دراسات الحرائك الدوائية (PK) ودراسات الحركية السمية (TK) التي تحتاج إلى جمع كمية معينة من الدم في نقاط زمنية محددة للكشف عن التعرض للمخدرات. تحدد طريقة أخذ عينات دم الفئران جودة البلازما وتؤثر بشكل أكبر على دقة نتائج الاختبار. تقوم طريقة جمع دم الوريد تحت الترقوة الموصوفة في هذا البروتوكول بجمع عينات الدم بشكل متكرر في الحالة الواعية للحيوانات لتلبية احتياجات اختبارات PK و TK. تضمن مهارات التعامل مع ضبط النفس والإجراء المناسب لشق الإبرة معدل نجاح جمع الدم. إنه سهل التشغيل مع ضمان جودة البلازما وفي نفس الوقت تلبية رعاية الحيوان. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة عملية ماهرة ، وقد تتسبب الطريقة غير المناسبة في ضعف الحيوانات والألم والعرج وحتى الوفيات. تم استخدام الطريقة الحالية في مرفق الاختبار لدراسة السمية الفموية لمدة 4 أسابيع في فئران Sprague Dawley (SD) مع TK. لم يتجاوز الحد الأقصى لكمية الدم التي تم جمعها خلال 24 ساعة 20٪ من إجمالي دم الحيوان. كان وزن جسم الحيوانات أكثر من 200 غرام للذكور والإناث. أظهرت البيانات أن وزن جسم الحيوانات يزداد بشكل مطرد كل أسبوع ، وكانت الملاحظة السريرية طبيعية بعد جمع العينات المتكررة.

Introduction

وفقا للمبادئ التوجيهية¹ للمؤتمر الدولي المعني بتنسيق المتطلبات التقنية لتسجيل المستحضرات الصيدلانية للاستخدام البشري (ICH) والمبادئ التوجيهية² للإدارة الوطنية للمنتجات الطبية (NMPA) ، يجب أن يفي عدد النقاط الزمنية لجمع الدم للفئران في دراسة الحركية السمية (TK) بمتطلبات التقييم الديناميكي للتعرض للأدوية. إجمالي حجم الدم التقريبي للفأر هو 55-70 مل / كجم من وزن الجسم³. تكون النقاط الزمنية للجمع مكثفة بشكل عام في غضون 30 دقيقة بعد الجرعات وتنخفض بعد ذلك ، ويجب جمع أكثر من عشر عينات دم في غضون 48 ساعة في الاختبار الروتيني⁴. على سبيل المثال ، يتم جمع عينات الدم في 12 نقطة زمنية (0 دقيقة ، 5 دقائق ، 10 دقائق ، 15 دقيقة ، 30 دقيقة ، 45 دقيقة ، 1 ساعة ، 2 ساعة ، 3 ساعات ، 4 ساعات ، 8 ساعات ، و 12 ساعة) في دراسة المعارف التقليدية للعقاقير التي يتم تناولها عن طريق الفم. يجب على الباحثين جمع 200-250 ميكرولتر من الدم بشكل متكرر في الفئران للحصول على بلازما عالية الجودة لاختبار المعارف التقليدية⁵.

تشمل مواقع جمع الدم في الفئران الأوعية الدموية للذيل ، وريد الضفيرة المدارية ، والوريد تحت الفك السفلي ، والقلب ، والشريان الأورطي^{البطني 6} ، وما إلى ذلك. من بينها ، جمع الدم من الوريد الذيلي للفئران هو طريقة مستخدمة بشكل متكرر ، والتي تتطلب مشغلين ذوي خبرة ومهارة ^7,8. لجمع الدم من الوريد الضفيرة المدارية الرجعية أقل تعقيدا. ومع ذلك ، لا ينصح بهذه الطريقة لأنها قد تلحق الضرر ببصر الفئران⁹ ، والدم من القلب والشريان الأورطي البطني مناسب فقط لأخذ عينات الدم النهائية¹⁰. هناك طريقة أخرى لجمع الدم من الوريد تحت الفك السفلي في الفئران الواعية التي أدت إلى المزيد من المضاعفات وكشفت عن عدم كفاية جودة عينة الدم¹¹. لذلك ، قد يقوم الباحثون بتخدير الحيوان لتقليل صعوبة أخذ العينات. ومع ذلك ، فإن التخدير يزيد أيضا من تكلفة التجربة ، والأخطر من ذلك ، أنه سيؤثر على الحالة الأيضية للفئران¹². يستخدم البروتوكول الحالي طريقة سريعة ومباشرة لجمع الدم في الأوردة تحت الترقوة للفئران دون تخدير ، مما يسمح بتحديد المواقع بدقة وجمع الدم بالتناوب الثنائي للحصول على عينات عالية الجودة في الوقت المناسب وبطريقة متكررة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لشركة Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co.، Ltd. تم استخدام ذكور وإناث فئران Sprague Dawley (SD) ، ~ 6-11 أسبوعا للتجارب. تمت تربية الفئران باتباع الإرشادات الخاصة برعاية واستخدام المختبر¹³.

1. إعداد الحيوانات

ملاحظة: كانت جميع فئران SD المستخدمة في هذه الدراسة مستيقظة ولم يتم تخديرها / القتل الرحيم. هناك حاجة إلى مهارة التعامل مع ضبط النفس عن طريق الإمساك بالجلد على ظهر الحيوان.

1. العثور على أدنى نقطة من الحفرة المثلثة تحت الترقوة بين الرقبة والمقدمة في الفئران. تحرك ~ 2-3 مم باتجاه الرأس والوصول إلى نقطة الإبرة في موقع جمع الدم (الشكل 1). قم بإزالة الشعر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
   ملاحظة: اعتمادا على الاحتياجات التجريبية ، قد تكون هناك حاجة إلى مصل أو بلازما. تؤخذ البلازما كمثال في هذا البروتوكول ، ولن تؤثر على عملية جمع الدم.
2. تحضير مسحات القطن الملطخة بالكحول بنسبة 75 ٪ للمسح والتطهير ومسحات القطن الجافة للمسح.

2. أخذ عينات من الدم

ملاحظة: يجب على الأقل 2 من الأشخاص ، وكلاهما يجب أن يكون من ذوي الخبرة في جمع الدم وتقنيات ضبط الفئران تنفيذ هذه الخطوات.

1. أمسك الجلد الموجود على الجزء الخلفي من الرقبة بيد واحدة للحفاظ على رأس الجرذ ورقبته وثديه في وضع مستقيم وكشف موقع الحقن (فيديو 1). قم بتصويب الطرف الأمامي على جانب موقع الحقن للحفاظ على مستواه.
2. حافظ على المحقنة موازية لرأس الجرذ باليد الأخرى وقم بإمالة المحقنة للخارج 5 درجات -10 درجات بحيث يميل الطرف نحو الاتجاه البطني.
3. أدخل الإبرة بالكامل في التجويف الأمامي. اسحب المحقنة للخلف للحفاظ على الضغط السلبي داخل الأنبوب.
4. حرك الإبرة ببطء من العمق إلى الضحلة وقم بعمل نسخة احتياطية من نفس المسار. عندما يدخل الدم إلى إبرة المحقنة ، ثبت موضع الإبرة (فيديو 2).
   ملاحظة: سيتم بعد ذلك ملء الدم بمعدل ثابت في المحقنة ، كما هو موضح في الشكل 2A (منظر أمامي) والشكل 2B (منظر جانبي).
5. مراقبة الحد الأقصى لكمية الدم وفقا للمعايير التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام الحيوان في المؤسسة. هذا يعتمد على وزن وصحة الحيوان. في حالة عدم وجود متطلبات أخرى ، لا تقم بإزالة أكثر من 20 ٪ من إجمالي حجم الدم للحيوان في غضون 24 ساعة ، الأمر الذي يتطلب ~ 3 أسابيع من الاستجمام¹⁴.
6. عندما يتم جمع عينة دم كافية ، اسحب المحقنة على الفور واستعد لعلاج الدم (الخطوة 3).
7. اضغط على موقع حقن الفئران لمدة ~ 1-2 دقيقة لوقف النزيف. نظرا لأن موقع التجميع يقع في الجزء السفلي من الرقبة ، قم بقرص جلد الوريد تحت الترقوة لوقف النزيف بالضغط عليه (الشكل 3).
   ملاحظة: يمكن جمع الدم بالتناوب من الوريد تحت الترقوة الثنائي عند الحاجة إلى جمع الدم بشكل متكرر.
8. أعد الفئران إلى القفص ولاحظ حالتها.

3. معالجة عينة الدم

1. أخرج الإبرة من المحقنة وتخلص منها في حاوية الأدوات الحادة. انقل الدم ببطء من المحقنة إلى أنبوب سعة 1.5 مل. اضغط على المحقنة على الحائط لتجنب تكوين الفقاعات ، إن وجدت.
   ملاحظة: بما أن الضغط قد يتسبب في تمزق خلايا الدم الحمراء ، قم بإزالة الإبرة لمنع انحلال الدم¹⁴.
2. قم بتغطية أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، ونفضه برفق ، وقم بقلبه رأسا على عقب خمس مرات على الأقل لخلط الدم تماما مع مضاد التخثر.
3. الطرد المركزي عينة الدم الكاملة في 2000 × ز لمدة ~ 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غضون 120 دقيقة بعد جمع البلازما.
4. استخدم مسدس ماصة (انظر جدول المواد) لنقل البلازما العلوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ. لا تلمس رأس الماصة بالدم الكامل السفلي. تخلص من البلازما الملوثة بخلايا الدم الحمراء أو أعد جهاز الطرد المركزي.
5. استخدم العينات على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة -30 درجة مئوية.
   ملاحظة: تحدد خصائص الدواء وقت التخزين. عينات البلازما التي تم الحصول عليها من الوريد تحت الترقوة شفافة وصفراء فاتحة. انحلال الدم قد يحول البلازما إلى اللون الأحمر.

النتائج

كانت عينات البلازما الجيدة من الوريد تحت الترقوة صفراء شاحبة شفافة (الشكل 4 ، الأنبوب الأيسر). أدى جمع الدم أو التلاعب به بشكل غير صحيح إلى انحلال الدم (الشكل 4 ، الأنبوب الأيمن).

أظهرت بيانات مرفق الاختبار أنه في دراسة سمية فموية لمدة 4 أسابيع ل...

Discussion

هناك فوائد معينة لجمع الدم من الأوردة تحت الترقوة. (1) نظرا لأن موقع جمع الدم ينفصل بسهولة ، والضفيرة الوريدية ليست منتظمة بسبب المواقف المختلفة للفئران ، يمكن للطريقة الموصوفة بسهولة تحديد موضع الضفيرة الوريدية مع الحفاظ على المواقف المستقرة والمريحة للفئران. (2) العملية سهلة ومواتية للتط...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm)	Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China)	20210629
75% alcohol	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China)	210717
Animal source	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.	grade: SPF	laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847
Cotton swab	Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China)	20210301	Need to be sterilized.
Electric shaver	Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China)	CP-6800
EP tube, 1.5 mL	Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China)
Heparin sodium (2 mL:12500 IU)	Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China)	51200702	Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use.
Labtip (volume range 5-200 μL)	Thermo Fisher Scientific Oy	94300120
Low speed refrigerated centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China)	L535R
Pipette gun (20-200 μL)	BRAND	12N92305
Rats (SD)	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China)
Sharp tool container	Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China)
Eye drop			This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided.