Amostragem Repetitiva de Sangue da Veia Subclávia de Rato Consciente

Resumo

O presente protocolo descreve um método simples e eficiente de coleta de sangue da veia subclávia em ratos. Permite uma amostragem rápida, oportuna e facilmente identificável sem anestesia e obtém sangue de alta qualidade através da coleta repetitiva de amostras.

Resumo

Os ratos são amplamente utilizados em estudos de farmacocinética (PK) e toxicocinéticos (TK) que precisam coletar uma certa quantidade de sangue em pontos de tempo específicos para detectar a exposição a medicamentos. O método de amostragem de sangue de rato determina a qualidade do plasma e afeta ainda mais a precisão dos resultados dos testes. O método de coleta de sangue da veia subclávia descrito neste protocolo coleta amostras de sangue repetidamente no estado consciente dos animais para atender às necessidades dos testes PK e TK. As habilidades de manuseio de contenção e procedimento apropriado de incisão com agulha garantem a taxa de sucesso da coleta de sangue. É fácil de operar, garantindo a qualidade do plasma e, ao mesmo tempo, atendendo ao bem-estar animal. No entanto, este método requer operação qualificada, e um inadequado pode causar fraqueza animal, dor, claudicação e até mortalidade. O método atual foi utilizado na instalação de teste para um estudo de toxicidade oral de 4 semanas em ratos Sprague Dawley (SD) com TK. A quantidade máxima de sangue coletada em 24 h não excedeu 20% do sangue total do animal. O peso corporal dos animais foi superior a 200 g para machos e fêmeas. Os dados mostraram que o peso corporal dos animais aumentou de forma constante a cada semana, e a observação clínica foi normal após a coleta repetitiva de amostras.

Introdução

De acordo com as diretrizes¹ da Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos Técnicos para Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH) e as diretrizes² da Administração Nacional de Produtos Médicos (NMPA), o número de pontos de tempo de coleta de sangue de ratos no estudo toxicocinético (TK) precisa atender aos requisitos da avaliação dinâmica da exposição a medicamentos. O volume sanguíneo total aproximado de um rato é de 55-70 mL/kg de peso corporal³. Os pontos de coleta são geralmente intensivos dentro de 30 minutos após a dosagem e diminuem depois disso, e mais de dez amostras de sangue precisam ser coletadas dentro de 48 h em testes de rotina⁴. Por exemplo, amostras de sangue são coletadas em 12 pontos de tempo (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h e 12 h) no estudo TK de medicamentos administrados por via oral. Os pesquisadores devem coletar repetidamente 200-250 μL de sangue em ratos para obter plasma de alta qualidade para o teste TK⁵.

Os locais de coleta de sangue em ratos incluem vasos sanguíneos da cauda, veia do plexo retro-orbital, veia submandibular, coração, aorta abdominal⁶ e assim por diante. Dentre eles, a coleta de sangue da veia caudal de ratos é um método frequentemente utilizado, que requer operadores experientes e qualificados ^7,8. Coletar sangue da veia do plexo retroorbital é menos complicado; no entanto, esse método não é recomendado, pois pode danificar a visão dos ratos⁹, e o sangue do coração e da aorta abdominal só é apropriado para a coleta final de sangue¹⁰. Outro método de coleta de sangue da veia submandibular em um rato consciente demonstrou resultar em mais complicações e revelou qualidade insuficiente da amostra de sangue¹¹. Portanto, os pesquisadores podem anestesiar o animal para reduzir a dificuldade de amostragem. Ainda assim, a anestesia também aumenta o custo do experimento e, mais seriamente, afetará o estado metabólico dos ratos¹². O presente protocolo utiliza um método rápido e direto de coleta de sangue nas veias subclávias de ratos sem anestesia, permitindo posicionamento preciso e coleta de sangue bilateral alternada para obter amostras de alta qualidade de forma oportuna e repetida.

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Protocolo

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Ratos Sprague Dawley (SD) machos e fêmeas, ~ 6-11 semanas foram usados para os experimentos. Os ratos foram criados seguindo as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório¹³.

1. Preparação animal

NOTA: Todos os ratos SD utilizados neste estudo estavam acordados e não estavam anestesiados/eutanasiados. A habilidade de manuseio de contenção agarrando a pele nas costas do animal é necessária.

1. Encontre o ponto mais baixo da fossa triangular subclávia entre o pescoço e o membro anterior em um rato. Mova ~2-3 mm em direção à cabeça e alcance o ponto de agulha no local de coleta de sangue (Figura 1). Remova o cabelo usando um barbeador elétrico.
   NOTA: Dependendo das necessidades experimentais, o soro ou o plasma podem ser necessários. O plasma é tomado como um exemplo neste protocolo, e não afetará o funcionamento da coleta de sangue.
2. Prepare cotonetes manchados com álcool a 75% para limpar e desinfetar e cotonetes secos para limpar.

2. Colheita de amostras de sangue

NOTA: Pelo menos 2 pessoas, ambas as quais devem ter experiência em coleta de sangue e técnicas de contenção de ratos devem realizar estas etapas.

1. Segure a pele na parte de trás do pescoço com uma mão para manter a cabeça, o pescoço e o peito do rato eretos e expor o local da injeção (Vídeo 1). Endireitar o membro anterior no lado do local da injeção para manter o seu nível.
2. Mantenha a seringa paralela à cabeça do rato com a outra mão e incline a seringa para fora 5°-10° de modo a que a ponta fique inclinada para a direção ventral.
3. Insira a agulha totalmente na cavidade anterior. Retire a seringa para manter a pressão negativa dentro do tubo.
4. Mova lentamente a agulha de profunda para rasa e volte para o mesmo caminho. Quando o sangue tiver entrado na agulha da seringa, fixe a posição da agulha (Vídeo 2).
   NOTA: O sangue será então preenchido a uma taxa constante na seringa, como mostrado na Figura 2A (vista frontal) e na Figura 2B (vista lateral).
5. Monitorar a quantidade máxima de sangue de acordo com os padrões estabelecidos pelo comitê de cuidados e uso de animais da instituição. Isso depende do peso e da saúde do animal. Na ausência de outros requisitos, não remova mais de 20% do volume sanguíneo total do animal dentro de 24 h, o que requer ~3 semanas de recuperação¹⁴.
6. Quando for recolhida uma amostra de sangue suficiente, retire imediatamente a seringa e prepare-se para o tratamento com sangue (passo 3).
7. Pressurize o local de injeção do rato por ~1-2 min para parar o sangramento. Como o local de coleta está na parte inferior do pescoço, aperte a pele da veia subclávia para interromper o sangramento, pressionando-o (Figura 3).
   NOTA: O sangue pode ser coletado alternadamente da veia subclávia bilateral quando a coleta de sangue repetida é necessária.
8. Devolva o rato à gaiola e observe sua condição.

3. Processamento da amostra de sangue

1. Retire a agulha da seringa e elimine-a no recipiente de ferramentas afiado. Transfira lentamente o sangue da seringa para um tubo de 1,5 ml. Pressione a seringa contra a parede para evitar formações de bolhas, se houver.
   NOTA: Como a pressão pode causar a ruptura dos glóbulos vermelhos, remova a agulha para evitar a hemólise¹⁴.
2. Cubra o tubo de microcentrífuga, mexa-o suavemente e vire-o de cabeça para baixo pelo menos cinco vezes para misturar completamente o sangue com o anticoagulante.
3. Centrifugar a amostra de sangue total a 2000 x g durante ~10-15 min à temperatura ambiente dentro de 120 min após a recolha do plasma.
4. Use uma pistola de pipeta (consulte Tabela de materiais) para transferir o plasma superior para um tubo de microcentrífuga em branco. Não toque na cabeça da pipeta com o sangue total inferior. Descartar ou recentrifugar o plasma contaminado com os glóbulos vermelhos.
5. Utilizar as amostras imediatamente ou armazená-las a -30 °C.
   NOTA: As características da droga determinam o tempo de armazenamento. Os espécimes plasmáticos obtidos da veia subclávia são translúcidos e amarelos claros. A hemólise pode tornar o plasma vermelho.

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Resultados

Boas amostras de plasma da veia subclávia eram amarelo pálido translúcido (Figura 4, tubo esquerdo). A coleta ou manipulação inadequada de sangue resultou em hemólise (Figura 4, tubo direito).

Os dados da instalação de teste mostraram que, em um estudo de toxicidade oral de 4 semanas de um colírio em ratos SD com TK, amostras de sangue foram coletadas duas vezes em 9 pontos de tempo (0 h, 0,167 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 1...

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Discussão

Existem certos benefícios da coleta de sangue das veias subclávias. (1) Como o local da coleta de sangue é prontamente dissociado, e o plexo venoso não é regular devido às diferentes posturas dos ratos, o método descrito pode facilmente localizar a posição do plexo venoso, mantendo as posturas estáveis e confortáveis dos ratos. (2) A operação é fácil e favorável ao rápido desenvolvimento das habilidades dos técnicos e menos dor aos animais. (3) Um modo de operação para deixar o animal confortável red...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm)	Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China)	20210629
75% alcohol	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China)	210717
Animal source	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.	grade: SPF	laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847
Cotton swab	Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China)	20210301	Need to be sterilized.
Electric shaver	Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China)	CP-6800
EP tube, 1.5 mL	Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China)
Heparin sodium (2 mL:12500 IU)	Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China)	51200702	Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use.
Labtip (volume range 5-200 μL)	Thermo Fisher Scientific Oy	94300120
Low speed refrigerated centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China)	L535R
Pipette gun (20-200 μL)	BRAND	12N92305
Rats (SD)	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China)
Sharp tool container	Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China)
Eye drop			This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided.