Повторяющийся забор крови из подключичной вены сознательной крысы

Резюме

Настоящий протокол описывает простой и эффективный метод сбора крови из подключичной вены у крыс. Он обеспечивает быстрый, своевременный и легко идентифицируемый отбор проб без анестезии и получение высококачественной крови путем повторного отбора образцов.

Аннотация

Крысы широко используются в фармакокинетических (ПК) и токсикокинетических (ТЗ) исследованиях, которые должны собирать определенное количество крови в определенные моменты времени для обнаружения воздействия лекарств. Метод забора крови крыс определяет качество плазмы и дополнительно влияет на точность результатов теста. Метод сбора крови в подключичных вен, описанный в этом протоколе, многократно собирает образцы крови в сознательном состоянии животных для удовлетворения потребностей тестов на ПК и ТЗ. Навыки удерживающего обращения и соответствующая процедура разреза иглы обеспечивают успешность забора крови. Он прост в эксплуатации, обеспечивая при этом качество плазмы и в то же время заботясь о благополучии животных. Однако этот метод требует квалифицированной операции, а неправильный может вызвать у животных слабость, боль, хромоту и даже смертность. Текущий метод был использован в испытательном центре для 4-недельного исследования пероральной токсичности на крысах Sprague Dawley (SD) с ТЗ. Максимальное количество крови, собранной в течение 24 ч, не превышало 20% от общей крови животного. Масса тела животных составляла более 200 г у самцов и самок. Данные показали, что масса тела животных неуклонно увеличивалась каждую неделю, и клиническое наблюдение было нормальным после повторяющегося сбора образцов.

Введение

В соответствии с руководящими принципами¹ Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для использования человеком (ICH) и руководящими^{принципами 2} Национального управления по медицинским изделиям (NMPA), количество временных точек сбора крови крыс в токсикокинетическом (TK) исследовании должно соответствовать требованиям динамической оценки воздействия лекарственных средств. Приблизительный общий объем крови крысы составляет 55-70 мл/кг массы тела³. Точки времени сбора, как правило, интенсивны в течение 30 минут после дозирования и уменьшаются после этого, и более десяти образцов крови должны быть собраны в течение 48 часов в обычном тестировании⁴. Например, образцы крови собирают в 12-ти временных точках (0 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4 ч, 8 ч и 12 ч) при исследовании ТЗ перорально вводимых препаратов. Исследователи должны неоднократно собирать 200-250 мкл крови у крыс, чтобы получить высококачественную плазму для тестирования ТЗ⁵.

Участки сбора крови у крыс включают хвостовые кровеносные сосуды, ретроорбитальную сплетение, подчелюстную вену, сердце, брюшную аорту⁶ и так далее. Среди них сбор крови из каудальной вены крыс является часто используемым методом, который требует опытных и квалифицированных операторов ^7,8. Собрать кровь из ретроорбитального сплетения вены менее сложно; однако этот метод не рекомендуется, так как он может повредить зрение крыс⁹, а кровь из сердца и брюшной аорты подходит только для окончательного забора крови¹⁰. Было показано, что другой метод сбора крови из подчелюстной вены у сознательной крысы приводит к большему количеству осложнений и выявил недостаточное качество образца крови¹¹. Поэтому исследователи могут обезболить животное, чтобы уменьшить сложность отбора проб. Тем не менее, анестезия также увеличивает стоимость эксперимента, и что более серьезно, это повлияет на метаболическое состояние крыс¹². Настоящий протокол использует быстрый и простой метод сбора крови в подключичных венах крыс без анестезии, что позволяет точно позиционировать и двусторонний переменный сбор крови для получения высококачественных образцов своевременным и повторным образом.

протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Для экспериментов использовались самцы и самки крыс Sprague Dawley (SD), ~ 6-11 недель. Крысы были выращены в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных¹³.

1. Подготовка животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Все крысы SD, используемые в этом исследовании, бодрствовали и не были обезболены / усыплены. Необходимо умение удерживать обращение, хватаясь за кожу на спине животного.

1. Найдите самую нижнюю точку подключичной треугольной ямки между шеей и передней конечностью у крысы. Переместите ~2-3 мм в сторону головы и дойдите до точки иглы в месте сбора крови (рисунок 1). Удалите волосы с помощью электробритвы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальных потребностей может потребоваться сыворотка или плазма. Плазма берется в качестве примера в этом протоколе, и это не повлияет на операцию забора крови.
2. Подготовьте ватные палочки, окрашенные 75% спиртом для протирания и дезинфекции и сухие ватные палочки для протирания.

2. Забор крови

ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, 2 человека, оба из которых должны иметь опыт в сборе крови и методах сдерживания крыс, должны выполнить эти шаги.

1. Захватите кожу на задней части шеи одной рукой, чтобы держать голову, шею и грудь крысы в вертикальном положении и обнажите место инъекции (видео 1). Выпрямите переднюю конечность со стороны места инъекции для поддержания ее уровня.
2. Держите шприц параллельно голове крысы другой рукой и наклоните шприц наружу на 5°-10° так, чтобы кончик был наклонен в вентральное направление.
3. Вставьте иглу полностью в переднюю полость. Оттяните шприц назад, чтобы поддерживать отрицательное давление внутри трубки.
4. Медленно переместите иглу с глубины на мелководье и вернитесь вверх по тому же пути. Когда кровь попала в шприц-иглу, зафиксируйте положение иглы (Видео 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Затем кровь будет заполнена с постоянной скоростью в шприце, как показано на рисунке 2A (вид спереди) и рисунке 2B (вид сбоку).
5. Контролировать максимальное количество крови в соответствии со стандартами, установленными комитетом по уходу и использованию животных учреждения. Это зависит от веса и здоровья животного. При отсутствии других требований не удаляйте более 20% от общего объема крови животного в течение 24 ч, что требует ~3 недель восстановления¹⁴.
6. Когда будет собран достаточный образец крови, немедленно извлеките шприц и подготовьтесь к лечению крови (шаг 3).
7. Давление на место инъекции крысы в течение ~ 1-2 мин, чтобы остановить кровотечение. Поскольку место сбора находится в нижней части шеи, защемите кожу подключичной вены, чтобы остановить кровотечение, надавливая на нее (рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь может быть собрана поочередно из двусторонней подключичной вены, когда необходим повторный забор крови.
8. Верните крысу в клетку и понаблюдайте за ее состоянием.

3. Обработка образца крови

1. Извлеките иглу из шприца и выбросьте ее в острый контейнер для инструмента. Медленно перенесите кровь из шприца в пробирку объемом 1,5 мл. Прижмите шприц к стенке, чтобы избежать образования пузырьков, если таковые имеются.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку давление может привести к разрыву эритроцитов, удалите иглу, чтобы предотвратить гемолиз¹⁴.
2. Накройте трубку микроцентрифуги, осторожно проведите ею и переверните вверх дном не менее пяти раз, чтобы тщательно смешать кровь с антикоагулянтом.
3. Центрифугируют образец цельной крови при 2000 х г в течение ~10-15 мин при комнатной температуре в течение 120 мин после сбора плазмы.
4. Используйте пипетку (см. Таблицу материалов) для переноса верхней плазмы в пустую микроцентрифужную трубку. Не прикасайтесь к головке пипетки с нижней цельной кровью. Утилизируйте или повторно центрифугируйте плазму, загрязненную эритроцитами.
5. Используйте образцы немедленно или храните их при -30 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристики препарата определяют время хранения. Образцы плазмы, полученные из подключичной вены, полупрозрачные и светло-желтые. Гемолиз может превратить плазму в красный цвет.

Результаты

Хорошие образцы плазмы из подключичной жилы были полупрозрачными бледно-желтыми (рисунок 4, левая трубка). Неправильный забор крови или манипуляции привели к гемолизу (рисунок 4, правая трубка).

Данные испытательного центра показали, что в 4...

Обсуждение

Существуют определенные преимущества сбора крови из подключичных вен. (1) Поскольку место сбора крови легко диссоциируется, а венозное сплетение не является регулярным из-за различных поз крыс, описанный метод может легко локализовать положение венозного сплетения при сохранении стаб...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm)	Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China)	20210629
75% alcohol	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China)	210717
Animal source	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.	grade: SPF	laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847
Cotton swab	Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China)	20210301	Need to be sterilized.
Electric shaver	Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China)	CP-6800
EP tube, 1.5 mL	Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China)
Heparin sodium (2 mL:12500 IU)	Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China)	51200702	Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use.
Labtip (volume range 5-200 μL)	Thermo Fisher Scientific Oy	94300120
Low speed refrigerated centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China)	L535R
Pipette gun (20-200 μL)	BRAND	12N92305
Rats (SD)	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China)
Sharp tool container	Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China)
Eye drop			This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided.