의식 쥐의 쇄골 하 정맥에서 반복적 인 혈액 샘플링

요약

본 프로토콜은 쥐의 쇄골 하 정맥으로부터 혈액을 수집하는 간단하고 효율적인 방법을 기술한다. 마취 없이 빠르고 시기적절하며 쉽게 식별할 수 있는 샘플링이 가능하며 반복적인 샘플 수집을 통해 고품질 혈액을 얻을 수 있습니다.

초록

쥐는 약물 노출을 감지하기 위해 특정 시점에 일정량의 혈액을 수집해야하는 약동학 (PK) 및 독성 동태 학 (TK) 연구에 널리 사용됩니다. 쥐 혈액 샘플링 방법은 혈장의 품질을 결정하고 테스트 결과의 정밀도에 더 영향을 미칩니다. 이 프로토콜에 설명 된 쇄골 하 정맥 혈액 수집 방법은 PK 및 TK 검사의 요구를 충족시키기 위해 동물의 의식 상태에서 반복적으로 혈액 샘플을 수집합니다. 구속 처리 기술과 바늘 절개의 적절한 절차는 채혈 성공률을 보장합니다. 플라즈마의 품질을 보장하면서 동시에 동물 복지를 제공하면서 작동하기 쉽습니다. 그러나이 방법은 숙련 된 작업이 필요하며 부적절한 방법은 동물의 약점, 통증, 절름발이 및 심지어 사망을 유발할 수 있습니다. 현재 방법은 TK를 가진 Sprague Dawley (SD) 쥐에서 4 주간의 경구 독성 연구를 위해 테스트 시설에서 사용되었습니다. 24 시간 이내에 수집 된 혈액의 최대량은 동물의 총 혈액의 20 %를 초과하지 않았습니다. 동물의 체중은 수컷과 암컷의 경우 200g 이상이었습니다. 데이터는 동물의 체중이 매주 꾸준히 증가한 것으로 나타 났으며 반복적 인 샘플 수집 후 임상 관찰은 정상이었습니다.

서문

인체 사용 의약품 등록을위한 기술 요구 사항의 조화에 관한 국제 회의 지침¹ 및 국가 의약품 관리국 (NMPA) 지침²에 따르면, 독성 동태 학 (TK) 연구에서 쥐의 채혈 시점 수는 동적 약물 노출 평가의 요구 사항을 충족해야합니다. 쥐의 대략적인 총 혈액량은 체중 kg 당 55-70 mL / kg입니다³. 수집 시점은 일반적으로 투여 후 30분 이내에 집중적이고 그 이후에는 감소하며,^{일상적인 검사에서} 48시간 이내에 10개 이상의 혈액 샘플을 수집해야 합니다4. 예를 들어, 혈액 샘플은 경구 투여 약물의 TK 연구에서 12 시간 (0 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 8 시간 및 12 시간)에서 수집됩니다. 연구원은 TK^{테스트를 위한} 고품질 혈장을 얻기 위해 쥐에서 200-250μL의 혈액을 반복적으로 수집해야 합니다5.

쥐의 혈액 수집 부위에는 꼬리 혈관, 역안와 신경총 정맥, 턱밑 정맥, 심장, 복부 대동맥⁶ 등이 포함됩니다. 그 중 쥐의 꼬리 정맥에서 채혈하는 것은 자주 사용되는 방법이며 숙련되고 숙련 된 작업자 ^7,8이 필요합니다. 후 안와 신경총 정맥에서 혈액을 수집하는 것은 덜 복잡합니다. 그러나 이 방법은 쥐의 시력을 손상시킬 수 있으므로⁹ 권장되지 않으며 심장 및 복부 대동맥의 혈액은 최종 혈액 샘플링¹⁰에만 적합합니다. 의식이 있는 쥐의 턱밑 정맥에서 혈액을 수집하는 또 다른 방법은 더 많은 합병증을 유발하는 것으로 나타났으며 혈액^{샘플 품질이 충분하지} 않은 것으로 나타났습니다11. 따라서 연구자들은 샘플링의 어려움을 줄이기 위해 동물을 마취시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 마취는 또한 실험 비용을 증가시키고 더 심각하게는 쥐¹²의 대사 상태에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 마취없이 쥐의 쇄골 하 정맥에서 혈액을 수집하는 빠르고 간단한 방법을 사용하여 정확한 위치 지정 및 양측 교대 혈액 수집을 가능하게하여시기 적절하고 반복적 인 방식으로 고품질 샘플을 얻을 수 있습니다.

프로토콜

기재된 모든 동물 실험은 광동 루윈 제약 연구소 유한 회사의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었으며, 수컷 및 암컷 Sprague Dawley(SD) 래트, ~6-11주 동안 실험에 사용되었다. 랫트는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 사육되었습니다¹³.

1. 동물 준비

참고: 이 연구에 사용된 모든 SD 쥐는 깨어 있었고 마취/안락사되지 않았습니다. 동물의 뒤쪽에있는 피부를 움켜 쥐는 구속 처리 기술이 필요합니다.

1. 쥐의 목과 앞다리 사이의 쇄골 하 삼각형 포사의 가장 낮은 지점을 찾으십시오. 머리쪽으로 ~ 2-3mm 이동하여 혈액 수집 부위의 바늘 지점에 도달합니다 (그림 1). 전기 면도기를 사용하여 머리카락을 제거하십시오.
   알림: 실험 요구 사항에 따라 혈청 또는 혈장이 필요할 수 있습니다. 혈장은이 프로토콜의 예로 간주되며 혈액 수집 작업에 영향을 미치지 않습니다.
2. 닦고 소독하기 위해 75 % 알코올로 얼룩진 면봉을 준비하고 닦기 위해 마른 면봉을 준비하십시오.

2. 혈액 샘플링

알림: 혈액 수집 및 쥐 억제 기술에 경험이 있어야 하는 최소 2명이 이 단계를 수행해야 합니다.

1. 한 손으로 목 뒤쪽의 피부를 잡고 쥐의 머리, 목, 가슴을 똑바로 세우고 주사 부위를 노출시킵니다 (비디오 1). 주사 부위의 앞다리를 곧게 펴서 수평을 유지하십시오.
2. 다른 손으로 주사기를 쥐의 머리와 평행하게 유지하고 팁이 복부 방향으로 기울어 지도록 주사기를 바깥쪽으로 5 ° -10 ° 기울입니다.
3. 바늘을 전방에 완전히 삽입하십시오. 튜브 내에서 음압을 유지하기 위해 주사기를 뒤로 당깁니다.
4. 바늘을 깊은 곳에서 얕은 곳으로 천천히 옮기고 같은 경로를 백업하십시오. 혈액이 주사기 바늘에 들어가면 바늘의 위치를 고정하십시오 (비디오 2).
   알림: 그런 다음 혈액은 그림 2A (전면 보기) 및 그림 2B (측면도)와 같이 주사기에 일정한 속도로 채워집니다.
5. 기관의 동물 관리 및 사용위원회가 정한 기준에 따라 최대 혈액량을 모니터링하십시오. 이것은 동물의 체중과 건강에 달려 있습니다. 다른 요구 사항이 없는 경우 ~3주의 회복이 필요한 24시간 이내에 동물의 총 혈액량의 20% 이상을 제거하지 마십시오¹⁴.
6. 충분한 혈액 샘플이 수집되면 즉시 주사기를 꺼내 혈액 치료를 준비합니다 (3 단계).
7. 출혈을 멈추기 위해 쥐의 주사 부위에 ~1-2분 동안 압력을 가합니다. 수집 부위가 목 아래 부분에 있기 때문에 쇄골 하 정맥의 피부를 꼬집어 출혈을 멈추십시오 (그림 3).
   알림: 반복적인 혈액 수집이 필요한 경우 양측 쇄골하 정맥에서 혈액을 교대로 수집할 수 있습니다.
8. 쥐를 새장으로 돌려 보내고 그 상태를 관찰하십시오.

3. 혈액 샘플 처리

1. 주사기에서 바늘을 제거하고 날카로운 도구 용기에 버립니다. 주사기에서 1.5mL 튜브로 혈액을 천천히 옮깁니다. 기포 형성을 피하기 위해 주사기를 벽에 대고 누르십시오.
   참고: 압력으로 적혈구가 파열될 수 있으므로 용혈을 방지하기 위해 바늘을 제거하십시오¹⁴.
2. 미세 원심 분리기 튜브를 덮고 부드럽게 튕긴 다음 거꾸로 5 번 이상 뒤집어 혈액과 항응고제를 완전히 혼합하십시오.
3. 혈장을 수집 한 후 120 분 이내에 실온에서 ~ 10-15 분 동안 2000 x g 에서 전혈 샘플을 원심 분리합니다.
4. 피펫 건( 재료 표 참조)을 사용하여 상부 플라즈마를 빈 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 피펫 헤드를 더 낮은 전혈로 만지지 마십시오. 적혈구로 오염된 혈장을 폐기하거나 다시 원심분리하십시오.
5. 샘플을 즉시 사용하거나 -30 ° C에서 보관하십시오.
   참고 : 약물의 특성에 따라 보관 시간이 결정됩니다. 쇄골 하 정맥에서 얻은 혈장 표본은 반투명하고 밝은 노란색입니다. 용혈은 혈장을 빨갛게 만들 수 있습니다.

결과

쇄골하 정맥으로부터의 양호한 혈장 샘플은 반투명 옅은 황색이었다(도 4, 좌측 튜브). 부적절한 채혈 또는 조작으로 인해 용혈이 발생했습니다(그림 4, 오른쪽 튜브).

테스트 시설의 데이터에 따르면 TK가 있는 SD 쥐의 점안액에 대한 4주간의 경구 독성 연구에서 혈액 샘플은 첫 번째 투약일(Day 1)과 마지막 투여일(Day 28) 사이에 9-시점...

토론

쇄골 하 정맥에서 혈액을 수집하는 데에는 몇 가지 이점이 있습니다. (1) 채혈 부위가 쉽게 해리되고 쥐의 자세가 다르기 때문에 정맥 신경총이 규칙적이지 않기 때문에 설명 된 방법은 쥐의 안정적이고 편안한 자세를 유지하면서 정맥 신경총의 위치를 쉽게 국소화 할 수 있습니다. (2) 수술이 쉽고 기술자의 기술이 빠르게 발전하고 동물에게 고통이 적습니다. (3) 동물을 편안하게 해주는 작동 모드...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm)	Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China)	20210629
75% alcohol	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China)	210717
Animal source	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.	grade: SPF	laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847
Cotton swab	Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China)	20210301	Need to be sterilized.
Electric shaver	Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China)	CP-6800
EP tube, 1.5 mL	Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China)
Heparin sodium (2 mL:12500 IU)	Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China)	51200702	Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use.
Labtip (volume range 5-200 μL)	Thermo Fisher Scientific Oy	94300120
Low speed refrigerated centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China)	L535R
Pipette gun (20-200 μL)	BRAND	12N92305
Rats (SD)	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China)
Sharp tool container	Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China)
Eye drop			This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided.