דגימת דם חוזרת מהווריד הסובקלבי של חולדה מודעת

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה לאיסוף דם מהווריד הסובקלאבי בחולדות. הוא מאפשר דגימה מהירה, מהירה וקלה לזיהוי ללא הרדמה ומשיג דם איכותי באמצעות איסוף דגימות חוזר.

Abstract

חולדות נמצאות בשימוש נרחב במחקרים פרמקוקינטיים (PK) וטוקסיקוקינטיים (TK) שצריכים לאסוף כמות מסוימת של דם בנקודות זמן ספציפיות כדי לזהות חשיפה לסמים. שיטת דגימת הדם של חולדות קובעת את איכות הפלזמה ומשפיעה עוד יותר על דיוק תוצאות הבדיקה. שיטת איסוף הדם של הוורידים הסובקלאביים המתוארת בפרוטוקול זה אוספת דגימות דם שוב ושוב במצב המודע של בעלי חיים כדי לענות על הצרכים של בדיקות PK ו- TK. מיומנויות הטיפול בריסון וההליך המתאים של חתך המחט מבטיחים את שיעור ההצלחה של איסוף הדם. זה קל לתפעול תוך הבטחת איכות הפלזמה ובו זמנית קייטרינג רווחת בעלי חיים. עם זאת, שיטה זו דורשת הפעלה מיומנת, ושיטה לא נכונה עלולה לגרום לחולשה של בעלי חיים, כאבים, צליעה ואף תמותה. השיטה הנוכחית שימשה במתקן הבדיקה למחקר רעילות אוראלית בן 4 שבועות בחולדות Sprague Dawley (SD) עם TK. כמות הדם המקסימלית שנאספה תוך 24 שעות לא עלתה על 20% מכלל הדם של החיה. משקל גופם של בעלי החיים היה יותר מ-200 גרם לזכרים ולנקבות. הנתונים הראו כי משקל גופם של בעלי החיים עלה בהתמדה מדי שבוע, והתצפית הקלינית הייתה תקינה לאחר איסוף דגימות חוזר.

Introduction

על פי הנחיות 1 של הוועידה הבינלאומית להרמוניזציה של דרישות טכניות לרישום תרופות לשימוש אנושי (ICH)^{והנחיות 2} של מנהל המוצרים הרפואיים הלאומי (NMPA), מספר נקודות הזמן לאיסוף הדם של חולדות במחקר הטוקסיקוקינטי (TK) צריך לעמוד בדרישות של הערכת החשיפה הדינמית לתרופות. נפח הדם הכולל המשוער של חולדה הוא 55-70 מ"ל/ק"ג משקל גוף³. נקודות זמן האיסוף הן בדרך כלל אינטנסיביות תוך 30 דקות לאחר המינון ויורדות לאחר מכן, ויש לאסוף יותר מעשר דגימות דם תוך 48 שעות בבדיקות שגרתיות⁴. לדוגמה, דגימות דם נאספות ב -12 נקודות זמן (0 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 45 דקות, 1 שעות, 2 שעות, 3 שעות, 4 שעות, 8 שעות ו -12 שעות) במחקר TK של תרופות הניתנות דרך הפה. חוקרים חייבים לאסוף שוב ושוב 200-250 μL של דם בחולדות כדי לקבל פלזמה באיכות גבוהה עבור בדיקת TK⁵.

אתרי איסוף הדם בחולדות כוללים כלי דם זנב, וריד מקלעת רטרו-אורביטלי, וריד תת-לסתני, לב, אבי עורקים בטני⁶ וכן הלאה. ביניהם, איסוף דם מן הווריד הקאודלי של חולדות היא שיטה נפוצה, אשר דורש מפעילים מנוסים ומיומנים ^7,8. כדי לאסוף דם מן הווריד מקלעת רטרו מסלולית הוא פחות מסובך; עם זאת, שיטה זו אינה מומלצת מכיוון שהיא עלולה לפגוע בראייה של החולדות⁹, ודם מהלב ומאבי העורקים הבטני מתאים רק לדגימת דם סופית¹⁰. שיטה נוספת לאיסוף דם מהווריד התת-לסתי בחולדה מודעת הוכחה כגורמת לסיבוכים רבים יותר וחשפה איכות דגימת דם לא מספקת¹¹. לכן, החוקרים עשויים להרדים את בעל החיים כדי להפחית את הקושי בדגימה. עם זאת, ההרדמה גם מייקרת את עלות הניסוי, וחמור מכך, היא תשפיע על המצב המטבולי של חולדות¹². הפרוטוקול הנוכחי משתמש בשיטה מהירה ופשוטה של איסוף דם בוורידים התת-צלביים של חולדות ללא הרדמה, ומאפשר מיקום מדויק ואיסוף דם לסירוגין דו-צדדי כדי לקבל דגימות באיכות גבוהה בזמן ובאופן חוזר.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של גואנגדונג Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. חולדות זכרים ונקבות Sprague Dawley (SD), ~ 6-11 שבועות שימשו לניסויים. החולדות גודלו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה¹³.

1. הכנת בעלי חיים

הערה: כל חולדות האס-די ששימשו במחקר זה היו ערות ולא הורדמו/הורדמו. יש צורך במיומנות של טיפול בריסון על ידי אחיזת העור בגבו של בעל החיים.

1. מצא את הנקודה הנמוכה ביותר של פוסה משולש subclavian בין הצוואר ואת הגפה הקדמית בחולדה. זוזו ~2-3 מ"מ לכיוון הראש והגיעו לנקודת המחט באתר איסוף הדם (איור 1). הסירו את השיער באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
   הערה: בהתאם לצרכי הניסוי, ייתכן שיהיה צורך בסרום או בפלזמה. פלזמה נלקחת כדוגמה בפרוטוקול זה, וזה לא ישפיע על הפעולה של איסוף הדם.
2. הכינו צמר גפן מוכתמים ב-75% אלכוהול לניגוב וחיטוי וצמר גפן יבש לניגוב.

2. דגימת דם

הערה: לפחות 2 אנשים, שניהם חייבים להיות מנוסים באיסוף דם וטכניקות ריסון חולדות צריכים לבצע את השלבים הבאים.

1. אחזו בעור העורף ביד אחת כדי לשמור על הראש, הצוואר והשד של החולדה זקופים וחשפו את אזור ההזרקה (סרטון 1). יישרו את הגפה הקדמית בצד אתר ההזרקה כדי לשמור על רמתה.
2. החזיקו את המזרק במקביל לראש החולדה ביד השנייה והטו את המזרק כלפי חוץ ב-5°-10°, כך שהקצה יהיה מוטה לכיוון הגחון.
3. הכנס את המחט במלואה לחלל הקדמי. משוך לאחור את המזרק כדי לשמור על לחץ שלילי בתוך הצינור.
4. הזיזו באיטיות את המחט מעומק לרדוד וחזרו באותו נתיב. כאשר הדם נכנס למחט המזרק, תקן את מיקום המחט (וידאו 2).
   הערה: הדם יתמלא בקצב קבוע במזרק, כפי שמוצג באיור 2A (מבט קדמי) ובאיור 2B (מבט מהצד).
5. יש לעקוב אחר כמות הדם המרבית בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים במוסד. זה תלוי במשקל ובבריאות של החיה. בהיעדר דרישות אחרות, אין להסיר יותר מ -20% מנפח הדם הכולל של בעל החיים תוך 24 שעות, מה שדורש ~ 3 שבועות של התאוששות¹⁴.
6. כאשר דגימת דם מספקת נאספת, מיד למשוך את המזרק ולהתכונן לטיפול בדם (שלב 3).
7. יש ללחוץ על אתר ההזרקה של החולדה למשך ~1-2 דקות כדי לעצור את הדימום. מאחר שאתר האיסוף נמצא בחלק התחתון של הצוואר, צבטו את העור של הווריד התת-קלאבי כדי לעצור את הדימום על-ידי לחיצה עליו (איור 3).
   הערה: ניתן לאסוף דם לסירוגין מהווריד התת-קלאבי הדו-צדדי כאשר יש צורך באיסוף דם חוזר.
8. החזירו את החולדה לכלוב והתבוננו במצבה.

3. עיבוד דגימת הדם

1. הסר את המחט מהמזרק והשלך אותה במיכל הכלים החד. לאט להעביר את הדם מן המזרק לצינור 1.5 מ"ל. לחץ את המזרק על הקיר כדי למנוע היווצרות בועות, אם בכלל.
   הערה: מכיוון שלחץ עלול לגרום לתאי דם אדומים להיקרע, הסר את המחט כדי למנוע המוליזה¹⁴.
2. כסו את צינור המיקרוצנטריפוגה, העבירו אותו בעדינות והפכו אותו לפחות חמש פעמים כדי לערבב היטב את הדם עם נוגד הקרישה.
3. צנטריפוגה את כל דגימת הדם ב 2000 x גרם במשך ~ 10-15 דקות בטמפרטורת החדר בתוך 120 דקות לאחר איסוף הפלזמה.
4. השתמש באקדח פיפטה (ראה טבלת חומרים) כדי להעביר את הפלזמה העליונה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ריק. אין לגעת בראש פיפטה עם הדם השלם התחתון. יש להיפטר או לבצע צנטריפוגה מחדש של הפלזמה המזוהמת בכדוריות הדם האדומות.
5. השתמש בדגימות באופן מיידי או אחסן אותן ב -30 ° C.
   הערה: המאפיינים של התרופה קובעים את זמן האחסון. דגימות הפלזמה המתקבלות מהווריד הסובקלבי שקופות וצהובות בהירות. המוליזה עלולה להפוך את הפלזמה לאדומה.

תוצאות

דגימות פלזמה טובות מהווריד הסובקלבי היו שקופות בצבע צהוב בהיר (איור 4, הצינור השמאלי). איסוף דם לא תקין או מניפולציה לא נכונה גרמו להמוליזה (איור 4, הצינור הימני).

הנתונים של מתקן הבדיקה הראו כי במחקר רעילות אוראלית בן 4 שבועות של טיפת עיניים בחו...

Discussion

ישנם יתרונות מסוימים של איסוף דם מן הוורידים subclavian. (1) מכיוון שאתר איסוף הדם מנותק בקלות, ומקלעת הוורידים אינה סדירה בשל התנוחות השונות של החולדות, השיטה המתוארת יכולה בקלות למקם את מיקום המקלעת הוורידית תוך שמירה על התנוחות היציבות והנוחות של החולדות. (2) הניתוח קל ונוח לפיתוח מהיר של כישו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm)	Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China)	20210629
75% alcohol	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China)	210717
Animal source	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.	grade: SPF	laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847
Cotton swab	Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China)	20210301	Need to be sterilized.
Electric shaver	Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China)	CP-6800
EP tube, 1.5 mL	Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China)
Heparin sodium (2 mL:12500 IU)	Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China)	51200702	Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use.
Labtip (volume range 5-200 μL)	Thermo Fisher Scientific Oy	94300120
Low speed refrigerated centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China)	L535R
Pipette gun (20-200 μL)	BRAND	12N92305
Rats (SD)	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China)
Sharp tool container	Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China)
Eye drop			This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided.