Campionamento ripetitivo di sangue dalla vena succlavia del ratto cosciente

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo semplice ed efficiente per raccogliere il sangue dalla vena succlavia nei ratti. Consente un campionamento rapido, tempestivo e facilmente identificabile senza anestesia e ottiene sangue di alta qualità attraverso la raccolta ripetitiva dei campioni.

Abstract

I ratti sono ampiamente utilizzati negli studi di farmacocinetica (PK) e tossicocinetica (TK) che devono raccogliere una certa quantità di sangue in punti temporali specifici per rilevare l'esposizione al farmaco. Il metodo di prelievo del sangue di ratto determina la qualità del plasma e influisce ulteriormente sulla precisione dei risultati del test. Il metodo di raccolta del sangue della vena succlavia descritto in questo protocollo raccoglie ripetutamente campioni di sangue nello stato di coscienza degli animali per soddisfare le esigenze dei test PK e TK. Le abilità di gestione della contenzione e la procedura appropriata di incisione dell'ago assicurano il tasso di successo della raccolta del sangue. È facile da usare, garantendo allo stesso tempo la qualità del plasma e allo stesso tempo il benessere degli animali. Tuttavia, questo metodo richiede un'operazione esperta e uno improprio può causare debolezza, dolore, zoppia e persino mortalità degli animali. L'attuale metodo è stato utilizzato nella struttura di test per uno studio di tossicità orale di 4 settimane in ratti Sprague Dawley (SD) con TK. La quantità massima di sangue raccolta entro 24 ore non ha superato il 20% del sangue totale dell'animale. Il peso corporeo degli animali era superiore a 200 g per maschi e femmine. I dati hanno mostrato che il peso corporeo degli animali aumentava costantemente ogni settimana e l'osservazione clinica era normale dopo la raccolta ripetitiva dei campioni.

Introduzione

Secondo le linee guida 1 della Conferenza internazionale sull'armonizzazione dei requisiti tecnici per la registrazione dei prodotti farmaceutici per uso umano (ICH)^{e le linee guida} 2 della National Medical Products Administration (NMPA), il numero di punti temporali di raccolta del sangue dei ratti nello studio tossicocinetico (TK) deve soddisfare i requisiti della valutazione dinamica dell'esposizione ai farmaci. Il volume totale approssimativo del sangue di un ratto è 55-70 ml / kg di peso corporeo³. I punti temporali di raccolta sono generalmente intensi entro 30 minuti dopo la somministrazione e diminuiscono dopo, e più di dieci campioni di sangue devono essere raccolti entro 48 ore nei test di routine⁴. Ad esempio, i campioni di sangue vengono raccolti in 12 punti temporali (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h e 12 h) nello studio TK di farmaci somministrati per via orale. I ricercatori devono raccogliere ripetutamente 200-250 μL di sangue nei ratti per ottenere plasma di alta qualità per il test TK⁵.

I siti di raccolta del sangue nei ratti includono vasi sanguigni della coda, vena del plesso retro-orbitale, vena sottomandibolare, cuore, aorta addominale⁶ e così via. Tra questi, la raccolta del sangue dalla vena caudale dei ratti è un metodo frequentemente usato, che richiede operatori esperti e qualificati ^7,8. Raccogliere il sangue dalla vena del plesso retro-orbitale è meno complicato; Tuttavia, questo metodo non è raccomandato in quanto può danneggiare la vista dei ratti⁹ e il sangue dal cuore e dall'aorta addominale è appropriato solo per il prelievo di sangue finale¹⁰. Un altro metodo di raccolta del sangue dalla vena sottomandibolare in un ratto cosciente ha dimostrato di provocare più complicazioni e ha rivelato una qualità del campione di sangue insufficiente¹¹. Pertanto, i ricercatori possono anestetizzare l'animale per ridurre la difficoltà di campionamento. Tuttavia, l'anestesia aumenta anche il costo dell'esperimento e, cosa più grave, influenzerà lo stato metabolico dei ratti¹². Il presente protocollo utilizza un metodo rapido e semplice di raccolta del sangue nelle vene succlavia dei ratti senza anestesia, consentendo un posizionamento accurato e una raccolta bilaterale alternata del sangue per ottenere campioni di alta qualità in modo tempestivo e ripetuto.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Per gli esperimenti sono stati utilizzati ratti maschi e femmine di Sprague Dawley (SD), ~ 6-11 settimane. I ratti sono stati allevati seguendo le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio¹³.

1. Preparazione degli animali

NOTA: Tutti i ratti SD utilizzati in questo studio erano svegli e non sono stati anestetizzati / eutanasiati. È necessaria l'abilità di gestire la contenzione afferrando la pelle sul dorso dell'animale.

1. Trova il punto più basso della fossa triangolare succlavia tra il collo e l'arto anteriore in un ratto. Spostarsi ~2-3 mm verso la testa e raggiungere il punto dell'ago nel sito di raccolta del sangue (Figura 1). Rimuovere i capelli usando un rasoio elettrico.
   NOTA: A seconda delle esigenze sperimentali, possono essere necessari siero o plasma. Il plasma è preso come esempio in questo protocollo e non influenzerà l'operazione di raccolta del sangue.
2. Preparare tamponi di cotone macchiati con alcool al 75% per pulire e disinfettare e tamponi di cotone asciutti per pulire.

2. Prelievo di sangue

NOTA: Almeno 2 persone, entrambe esperte nella raccolta del sangue e nelle tecniche di contenzione dei ratti, devono eseguire questi passaggi.

1. Afferrare la pelle sulla parte posteriore del collo con una mano per mantenere la testa, il collo e il seno del ratto in posizione verticale ed esporre il sito di iniezione (Video 1). Raddrizzare l'arto anteriore sul lato del sito di iniezione per mantenere il suo livello.
2. Tenere la siringa parallela alla testa del ratto con l'altra mano e inclinare la siringa verso l'esterno di 5°-10° in modo che la punta sia inclinata verso la direzione ventrale.
3. Inserire l'ago completamente nella cavità anteriore. Tirare indietro la siringa per mantenere la pressione negativa all'interno del tubo.
4. Spostare lentamente l'ago da profondo a poco profondo e risalire lo stesso percorso. Quando il sangue è entrato nell'ago della siringa, fissare la posizione dell'ago (Video 2).
   NOTA: Il sangue verrà quindi riempito a velocità costante nella siringa, come mostrato nella Figura 2A (vista frontale) e nella Figura 2B (vista laterale).
5. Monitorare la quantità massima di sangue in conformità con gli standard stabiliti dal comitato per la cura e l'uso degli animali dell'istituzione. Questo dipende dal peso e dalla salute dell'animale. In assenza di altri requisiti, non rimuovere più del 20% del volume totale del sangue dell'animale entro 24 ore, il che richiede ~ 3 settimane di recupero¹⁴.
6. Quando viene raccolto un campione di sangue sufficiente, prelevare immediatamente la siringa e prepararsi per il trattamento del sangue (fase 3).
7. Pressurizzare il sito di iniezione del ratto per ~ 1-2 minuti per fermare l'emorragia. Poiché il sito di raccolta si trova nella parte inferiore del collo, pizzicare la pelle della vena succlavia per fermare l'emorragia premendo su di essa (Figura 3).
   NOTA: Il sangue può essere raccolto alternativamente dalla vena succlavia bilaterale quando è necessaria una raccolta ripetuta del sangue.
8. Riporta il topo nella gabbia e osserva le sue condizioni.

3. Elaborazione del campione di sangue

1. Rimuovere l'ago dalla siringa e gettarlo nel contenitore per utensili affilato. Trasferire lentamente il sangue dalla siringa a un tubo da 1,5 ml. Premere la siringa contro il muro per evitare la formazione di bolle, se presenti.
   NOTA: Poiché la pressione può causare la rottura dei globuli rossi, rimuovere l'ago per prevenire l'emolisi¹⁴.
2. Coprire il tubo della microcentrifuga, sfiorarlo delicatamente e capovolgerlo almeno cinque volte per mescolare accuratamente il sangue con l'anticoagulante.
3. Centrifugare l'intero campione di sangue a 2000 x g per ~10-15 minuti a temperatura ambiente entro 120 minuti dopo aver raccolto il plasma.
4. Utilizzare una pistola per pipette (vedere la tabella dei materiali) per trasferire il plasma superiore in una provetta vuota per microcentrifuga. Non toccare la testina della pipetta con il sangue intero inferiore. Smaltire o centrifugare nuovamente il plasma contaminato dai globuli rossi.
5. Utilizzare immediatamente i campioni o conservarli a -30 °C.
   NOTA: Le caratteristiche del farmaco determinano il tempo di conservazione. I campioni di plasma ottenuti dalla vena succlavia sono traslucidi e giallo chiaro. L'emolisi può trasformare il plasma in rosso.

Risultati

I buoni campioni di plasma della vena succlavia erano traslucidi di colore giallo pallido (Figura 4, il tubo sinistro). La raccolta o la manipolazione impropria del sangue ha provocato l'emolisi (Figura 4, il tubo destro).

I dati della struttura di test hanno mostrato che in uno studio di tossicità orale di 4 settimane di un collirio in ratti SD con TK, i campioni di sangue sono stati raccolti due volte in 9 punti temporali (0 h, 0,1...

Discussione

Ci sono alcuni benefici della raccolta di sangue dalle vene succlavia. (1) Poiché il sito della raccolta del sangue è facilmente dissociato e il plesso venoso non è regolare a causa delle diverse posture dei ratti, il metodo descritto può facilmente localizzare la posizione del plesso venoso mantenendo le posture stabili e confortevoli dei ratti. (2) L'operazione è facile e favorevole al rapido sviluppo delle capacità dei tecnici e meno dolore per gli animali. (3) Una modalità operativa per rendere l'animale confo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm)	Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China)	20210629
75% alcohol	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China)	210717
Animal source	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.	grade: SPF	laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847
Cotton swab	Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China)	20210301	Need to be sterilized.
Electric shaver	Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China)	CP-6800
EP tube, 1.5 mL	Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China)
Heparin sodium (2 mL:12500 IU)	Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China)	51200702	Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use.
Labtip (volume range 5-200 μL)	Thermo Fisher Scientific Oy	94300120
Low speed refrigerated centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China)	L535R
Pipette gun (20-200 μL)	BRAND	12N92305
Rats (SD)	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China)
Sharp tool container	Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China)
Eye drop			This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided.