意识大鼠锁骨下静脉的重复血液采样

摘要

本协议描述了一种从大鼠锁骨下静脉收集血液的简单有效的方法。无需麻醉即可快速、及时且易于识别的采样，并通过重复样本采集获得高质量的血液。

摘要

大鼠广泛用于药代动力学（PK）和毒代动力学（TK）研究，这些研究需要在特定时间点收集一定量的血液以检测药物暴露。大鼠血液采样方法决定了血浆的质量，并进一步影响测试结果的精度。本协议中描述的锁骨下静脉采血方法在动物的意识状态下反复收集血液样本，以满足PK和TK测试的需要。约束处理的技巧和适当的针切口程序确保了采血的成功率。它易于操作，同时确保血浆的质量，同时满足动物福利。但是，这种方法需要熟练的操作，操作不当可能会导致动物虚弱，疼痛，跛行，甚至死亡。目前的方法已在测试设施中使用，对具有传统知识的Sprague Dawley（SD）大鼠进行为期4周的口服毒性研究。24小时内收集的最大血液量不超过动物总血液的20%。雄性和雌性动物的体重超过200克。数据显示，动物体重每周稳步增加，重复采集样本后临床观察结果正常。

引言

根据人用药品注册技术要求协调国际会议（ICH）指南¹ 和国家药品监督管理局（NMPA）指南²，毒代动力学（TK）研究中大鼠采血时间点的数量需要满足动态药物暴露评估的要求。大鼠的近似总血容量为55-70mL / kg体重³。采集时间点一般在给药后30 min内密集，之后减少，常规检测48 h内需采集100份以上血样⁴.例如，在口服药物的TK研究中，在12个时间点（0分钟，5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，45分钟，1小时，2小时，3小时，4小时，8小时和12小时）收集血液样本。研究人员必须在大鼠中反复收集 200-250 μL 的血液，以获得用于 TK 测试的高质量血浆⁵.

大鼠采血部位包括尾血管、眶后丛静脉、下颌下静脉、心脏、腹主动脉⁶等。其中，从大鼠尾静脉采集血液是一种常用的方法，需要经验丰富且技术娴熟的操作人员^7，8。从眶后丛静脉采集血液不太复杂;但是，不推荐使用此方法，因为它可能会损害大鼠的视力⁹，并且来自心脏和腹主动脉的血液仅适用于最终的血液采样¹⁰。另一种从有意识的大鼠下颌下静脉收集血液的方法已被证明会导致更多的并发症，并揭示血液样本质量不足¹¹。因此，研究人员可能会对动物进行麻醉，以降低采样的难度。尽管如此，麻醉也增加了实验的成本，更严重的是，它会影响大鼠的代谢状态¹²。本协议使用一种快速直接的方法在大鼠锁骨下静脉中收集血液而无需麻醉，允许准确定位和双侧交替采血，以及时和重复的方式获得高质量的样品。

研究方案

所描述的所有动物实验均由广东Lewwin药物研究所有限公司机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，雄性和雌性Sprague Dawley（SD）大鼠，~6-11周用于实验。按照实验动物的护理和使用指南饲养大鼠¹³。

1. 动物制备

注意:本研究中使用的所有SD大鼠都是清醒的，没有被麻醉/安乐死。需要通过抓住动物背部的皮肤来约束处理的技巧。

1. 找到大鼠颈部和前肢之间的锁骨下三角窝的最低点。向头部移动~2-3毫米，到达采血部位的针尖（图1）。使用电动剃须刀去除头发。
   注意:根据实验需要，可能需要血清或血浆。本协议以血浆为例，不会影响采血的操作。
2. 准备沾有75%酒精的棉签进行擦拭和消毒，并准备干燥的棉签进行擦拭。

2. 血液采样

注意:至少 2 人，都必须有采血和大鼠约束技术的经验，应执行以下步骤。

1. 用一只手抓住颈部后部的皮肤，使大鼠的头部，颈部和乳房保持直立并暴露注射部位（视频1）。拉直注射部位一侧的前肢以保持其水平。
2. 用另一只手保持注射器与大鼠头部平行，并将注射器向外倾斜5°-10°，使尖端向腹侧方向倾斜。
3. 将针头完全插入前腔。拉回注射器以保持管内的负压。
4. 慢慢地将针从深移动到浅，然后沿着相同的路径返回。当血液进入注射器针头时，固定针头的位置（视频2）。
   注意:然后将血液以恒定的速率填充在注射器中，如图 2A （前视图）和 图2B （侧视图）所示。
5. 根据该机构的动物护理和使用委员会制定的标准监测最大血量。这取决于动物的体重和健康状况。在没有其他要求的情况下，不要在24小时内去除超过动物总血量的20%，这需要~3周的恢复¹⁴。
6. 收集足够的血液样本后，立即取出注射器并准备血液治疗（步骤3）。
7. 对大鼠的注射部位加压~1-2分钟以止血。由于收集部位位于颈部下部，因此通过按压锁骨下静脉捏住皮肤以止血（图3）。
   注意:当需要重复采血时，可以从双侧锁骨下静脉交替采集血液。
8. 将老鼠放回笼子里，观察它的状况。

3. 处理血液样本

1. 从注射器中取出针头并将其丢弃在锋利的工具容器中。将血液从注射器缓慢转移到 1.5 mL 管中。将注射器按在墙上以避免形成气泡（如果有）。
   注意:由于压力可能导致红细胞破裂，请取下针头以防止溶血¹⁴.
2. 盖上微量离心管，轻轻轻弹，倒置至少五次，使血液与抗凝剂彻底混合。
3. 收集血浆后120分钟内在室温下以2000× g 离心全血样品~10-15分钟。
4. 使用移液器枪（参见 材料表）将上部血浆转移到空白微量离心管中。不要用下部全血触摸移液器头。处理或重新离心被红细胞污染的血浆。
5. 立即使用样品或将其储存在-30°C。
   注意:药物的特性决定了储存时间。从锁骨下静脉获得的血浆标本是半透明的，呈浅黄色。溶血可能使血浆变红。

结果

来自锁骨下静脉的良好血浆样品呈半透明的淡黄色（图4，左管）。不正确的血液采集或操作导致溶血（图4，右管）。

测试设施的数据显示，在对患有TK的SD大鼠滴眼液进行的为期4周的口服毒性研究中，在第一个（第1天）和最后一个给药日（第28天）之间的9个时间点（0小时，0.167小时，0.5小时，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时...

讨论

从锁骨下静脉采集血液有一定的好处。（1）由于采血部位容易解离，并且由于大鼠的姿势不同，静脉丛不规则，因此所述方法可以在保持大鼠稳定舒适的姿势的同时，轻松定位静脉丛的位置。（2）操作简便，有利于技术人员技能的快速发展，对动物的痛苦少。（3）使动物舒适的操作模式大大减少了躁动行为并防止血液飞溅。（4）是一种高速（20 s）、高效率、低成本、无麻醉的抽血方法，从动?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm)	Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China)	20210629
75% alcohol	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China)	210717
Animal source	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.	grade: SPF	laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847
Cotton swab	Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China)	20210301	Need to be sterilized.
Electric shaver	Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China)	CP-6800
EP tube, 1.5 mL	Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China)
Heparin sodium (2 mL:12500 IU)	Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China)	51200702	Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use.
Labtip (volume range 5-200 μL)	Thermo Fisher Scientific Oy	94300120
Low speed refrigerated centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China)	L535R
Pipette gun (20-200 μL)	BRAND	12N92305
Rats (SD)	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China)
Sharp tool container	Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China)
Eye drop			This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided.