Wiederholte Blutentnahme aus der Vena subclavia einer bewussten Ratte

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Blutentnahme aus der Vena subclavia bei Ratten. Es ermöglicht eine schnelle, zeitnahe und leicht identifizierbare Probenahme ohne Anästhesie und erhält qualitativ hochwertiges Blut durch wiederholte Probenentnahme.

Zusammenfassung

Ratten werden häufig in pharmakokinetischen (PK) und toxikokinetischen (TK) Studien verwendet, bei denen zu bestimmten Zeitpunkten eine bestimmte Menge Blut gesammelt werden muss, um die Arzneimittelexposition nachzuweisen. Die Rattenblutentnahmemethode bestimmt die Qualität des Plasmas und beeinflusst darüber hinaus die Genauigkeit der Testergebnisse. Die in diesem Protokoll beschriebene Blutentnahmemethode der Subclavia-Vene sammelt wiederholt Blutproben im Bewusstseinszustand von Tieren, um die Anforderungen von PK- und TK-Tests zu erfüllen. Die Fähigkeiten der zurückhaltenden Handhabung und das geeignete Verfahren der Nadelstiche gewährleisten die Erfolgsrate der Blutentnahme. Es ist einfach zu bedienen und gewährleistet gleichzeitig die Qualität des Plasmas und trägt gleichzeitig dem Tierwohl Rechnung. Diese Methode erfordert jedoch eine fachmännische Bedienung, und eine unsachgemäße Methode kann Tierschwäche, Schmerzen, Lahmheit und sogar Sterblichkeit verursachen. Die aktuelle Methode wurde in der Testeinrichtung für eine 4-wöchige orale Toxizitätsstudie an Sprague Dawley (SD) Ratten mit TK angewendet. Die maximale Blutmenge, die innerhalb von 24 Stunden entnommen wurde, überstieg 20 % des Gesamtblutes des Tieres nicht. Das Körpergewicht der Tiere betrug mehr als 200 g bei Männchen und Weibchen. Die Daten zeigten, dass das Körpergewicht der Tiere jede Woche stetig zunahm und die klinische Beobachtung nach wiederholter Probenentnahme normal war.

Einleitung

Gemäß den Richtlinien der Internationalen Konferenz zur Harmonisierung der technischen Anforderungen für die Registrierung von Humanarzneimitteln (ICH)¹ und den Richtlinien der National Medical Products Administration (NMPA)² muss die Anzahl der Blutentnahmezeitpunkte von Ratten in der toxikokinetischen Studie (TK) den Anforderungen der dynamischen Arzneimittelexpositionsbewertung entsprechen. Das ungefähre Gesamtblutvolumen einer Ratte beträgt 55-70 ml/kg Körpergewicht³. Die Entnahmezeitpunkte sind in der Regel innerhalb von 30 Minuten nach der Verabreichung intensiv und nehmen danach ab, und mehr als zehn Blutproben müssen innerhalb von 48 Stunden in Routinetests^{entnommen werden 4}. Zum Beispiel werden Blutproben zu 12 Zeitpunkten (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h und 12 h) in der TK-Studie von oral verabreichten Medikamenten gesammelt. Forscher müssen wiederholt 200-250 μL Blut bei Ratten sammeln, um qualitativ hochwertiges Plasma für den TK-Test^{zu erhalten 5}.

Die Blutentnahmestellen bei Ratten umfassen Schwanzblutgefäße, retroorbitale Plexusvene, submandibuläre Vene, Herz, Bauchaorta⁶ und so weiter. Unter ihnen ist die Blutentnahme aus der Schwanzvene von Ratten eine häufig verwendete Methode, die erfahrene und erfahrene Bediener erfordert ^7,8. Blut aus der retroorbitalen Plexusvene zu sammeln ist weniger kompliziert; Diese Methode wird jedoch nicht empfohlen, da sie das Sehvermögen der Ratten^{schädigen kann 9} und Blut aus dem Herzen und der Bauchaorta nur für die endgültige Blutentnahme¹⁰ geeignet ist. Es hat sich gezeigt, dass eine andere Methode zur Blutentnahme aus der Vena submandibularis bei einer bewussten Ratte zu mehr Komplikationen führt und eine unzureichende Blutprobenqualität aufzeigt¹¹. Daher können Forscher das Tier betäuben, um die Schwierigkeit der Probenahme zu reduzieren. Dennoch erhöht die Anästhesie auch die Kosten des Experiments, und noch schlimmer ist, dass sie den Stoffwechselzustand von Ratten beeinflusst¹². Das vorliegende Protokoll verwendet eine schnelle und unkomplizierte Methode zur Blutentnahme in den Subclavia-Venen von Ratten ohne Anästhesie, die eine genaue Positionierung und eine bilaterale alternierende Blutentnahme ermöglicht, um rechtzeitig und wiederholt qualitativ hochwertige Proben zu erhalten.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. genehmigt. Männliche und weibliche Sprague Dawley (SD) Ratten, ~6-11 Wochen wurden für die Experimente verwendet. Die Ratten wurden nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren^{aufgezogen 13}.

1. Zubereitung von Tieren

HINWEIS: Alle SD-Ratten, die in dieser Studie verwendet wurden, waren wach und wurden nicht anästhesiert/eingeschläfert. Die Geschicklichkeit des Rückgriffs durch Greifen der Haut auf dem Rücken des Tieres ist erforderlich.

1. Finden Sie den tiefsten Punkt der dreieckigen Fossa subclavia zwischen Hals und Vorderbein bei einer Ratte. Bewegen Sie ~2-3 mm in Richtung Kopf und erreichen Sie die Nadelspitze an der Blutentnahmestelle (Abbildung 1). Entfernen Sie die Haare mit einem elektrischen Rasierer.
   HINWEIS: Abhängig von den experimentellen Anforderungen kann Serum oder Plasma erforderlich sein. Plasma wird in diesem Protokoll als Beispiel genommen und hat keinen Einfluss auf den Betrieb der Blutentnahme.
2. Bereiten Sie Wattestäbchen, die mit 75% Alkohol gefärbt sind, zum Abwischen und Desinfizieren und trocknende Wattestäbchen zum Abwischen vor.

2. Blutentnahme

HINWEIS: Mindestens 2 Personen, die beide Erfahrung in der Blutentnahme und in Rattenrückhaltetechniken haben müssen, sollten diese Schritte durchführen.

1. Fassen Sie die Haut im Nacken mit einer Hand an, um den Kopf, den Hals und die Brust der Ratte aufrecht zu halten und die Injektionsstelle freizulegen (Video 1). Begradigen Sie die Vordergliedmaßen an der Seite der Injektionsstelle, um ihre Höhe zu halten.
2. Halten Sie die Spritze mit der anderen Hand parallel zum Kopf der Ratte und neigen Sie die Spritze um 5°-10° nach außen, so dass die Spitze in die ventrale Richtung geneigt ist.
3. Führen Sie die Nadel vollständig in die vordere Höhle ein. Ziehen Sie die Spritze zurück, um den Unterdruck im Röhrchen aufrechtzuerhalten.
4. Bewegen Sie die Nadel langsam von tief nach flach und gehen Sie den gleichen Weg zurück. Wenn Blut in die Spritzennadel eingedrungen ist, fixieren Sie die Position der Nadel (Video 2).
   HINWEIS: Das Blut wird dann mit einer konstanten Geschwindigkeit in die Spritze gefüllt, wie in Abbildung 2A (Vorderansicht) und Abbildung 2B (Seitenansicht) gezeigt.
5. Überwachen Sie die maximale Blutmenge in Übereinstimmung mit den Standards, die von der Tierpflege- und -verwendungskommission der Einrichtung festgelegt wurden. Dies hängt vom Gewicht und der Gesundheit des Tieres ab. In Ermangelung anderer Anforderungen dürfen innerhalb von 24 Stunden nicht mehr als 20% des Gesamtblutvolumens des Tieres entnommen werden, was ~3 Wochen Erholung erfordert¹⁴.
6. Wenn eine ausreichende Blutprobe entnommen ist, ziehen Sie die Spritze sofort heraus und bereiten Sie sich auf die Blutbehandlung vor (Schritt 3).
7. Setzen Sie die Injektionsstelle der Ratte für ~ 1-2 Minuten unter Druck, um die Blutung zu stoppen. Da sich die Entnahmestelle im unteren Teil des Halses befindet, drücken Sie die Haut der Vena subclavia zusammen, um die Blutung zu stoppen, indem Sie darauf drücken (Abbildung 3).
   HINWEIS: Blut kann abwechselnd aus der bilateralen Vena subclavia entnommen werden, wenn eine wiederholte Blutentnahme erforderlich ist.
8. Bringen Sie die Ratte in den Käfig zurück und beobachten Sie ihren Zustand.

3. Aufbereitung der Blutprobe

1. Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze und entsorgen Sie sie in den scharfen Werkzeugbehälter. Übertragen Sie das Blut langsam aus der Spritze in ein 1,5-ml-Röhrchen. Drücken Sie die Spritze gegen die Wand, um Blasenbildungen zu vermeiden.
   HINWEIS: Da Druck dazu führen kann, dass rote Blutkörperchen reißen, entfernen Sie die Nadel, um eine Hämolyse^{zu verhindern 14}.
2. Decken Sie das Mikrozentrifugenröhrchen ab, schnippen Sie es vorsichtig und drehen Sie es mindestens fünfmal auf den Kopf, um das Blut gründlich mit dem Antikoagulans zu vermischen.
3. Zentrifugieren Sie die Vollblutprobe bei 2000 x g für ~10-15 min bei Raumtemperatur innerhalb von 120 min nach dem Sammeln des Plasmas.
4. Verwenden Sie eine Pipettenpistole (siehe Materialtabelle), um das obere Plasma in ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Berühren Sie den Pipettenkopf nicht mit dem unteren Vollblut. Entsorgen oder zentrifugieren Sie das mit den roten Blutkörperchen kontaminierte Plasma.
5. Verwenden Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie bei -30 °C.
   HINWEIS: Die Eigenschaften des Arzneimittels bestimmen die Lagerzeit. Die aus der Vena subclavia gewonnenen Plasmaproben sind durchscheinend und hellgelb. Hämolyse kann das Plasma rot färben.

Ergebnisse

Gute Plasmaproben aus der Vena subclavia waren durchscheinend hellgelb (Abbildung 4, linkes Röhrchen). Eine unsachgemäße Blutentnahme oder -manipulation führte zu einer Hämolyse (Abbildung 4, rechter Schlauch).

Die Daten der Testeinrichtung zeigten, dass in einer 4-wöchigen oralen Toxizitätsstudie eines Augentropfens bei SD-Ratten mit TK zweimal Blutproben zu 9 Zeitpunkten (0 h, 0,167 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h und 24 h...

Diskussion

Es gibt bestimmte Vorteile der Blutentnahme aus den Venen subclavia. (1) Da der Ort der Blutentnahme leicht dissoziiert ist und der Venenplexus aufgrund der unterschiedlichen Körperhaltungen der Ratten nicht regelmäßig ist, kann die beschriebene Methode die Position des Venenplexus leicht lokalisieren, während die stabilen und bequemen Körperhaltungen der Ratten beibehalten werden. (2) Die Operation ist einfach und günstig für die schnelle Entwicklung der Fähigkeiten der Techniker und weniger Schmerzen für Tiere...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm)	Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China)	20210629
75% alcohol	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China)	210717
Animal source	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.	grade: SPF	laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847
Cotton swab	Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China)	20210301	Need to be sterilized.
Electric shaver	Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China)	CP-6800
EP tube, 1.5 mL	Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China)
Heparin sodium (2 mL:12500 IU)	Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China)	51200702	Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use.
Labtip (volume range 5-200 μL)	Thermo Fisher Scientific Oy	94300120
Low speed refrigerated centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China)	L535R
Pipette gun (20-200 μL)	BRAND	12N92305
Rats (SD)	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China)
Sharp tool container	Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China)
Eye drop			This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided.