意識性ラットの鎖骨下静脈からの反復採血

要約

本プロトコルは、ラットにおける鎖骨下静脈から血液を採取するための簡便かつ効率的な方法を記載する。麻酔なしで迅速、タイムリー、簡単に識別できるサンプリングを可能にし、繰り返しのサンプル収集を通じて高品質の血液を取得します。

要約

ラットは、薬物曝露を検出するために特定の時点で一定量の血液を採取する必要がある薬物動態(PK)およびトキシコキネティクス(TK)研究で広く使用されています。ラット採血法は血漿の質を決定し、さらに試験結果の精度に影響を与えます。このプロトコルに記載されている鎖骨下静脈採血方法は、PKおよびTKテストのニーズを満たすために、動物の意識状態で血液サンプルを繰り返し収集します。拘束操作のスキルと針切開の適切な手順により、採血の成功率が保証されます。プラズマの品質を確保しながら操作が簡単で、同時に動物福祉にも対応しています。ただし、この方法には熟練した操作が必要であり、不適切な方法は動物の脱力感、痛み、跛行、さらには死亡率を引き起こす可能性があります。現在の方法は、TKのSprague Dawley(SD)ラットを対象とした4週間の経口毒性試験の試験施設で使用されています。24時間以内に収集された血液の最大量は、動物の総血液の20%を超えませんでした。.動物の体重は雄と雌で200 g以上でした。データは、動物の体重が毎週着実に増加し、反復サンプル収集後の臨床観察は正常であることを示しました。

概要

ヒト用医薬品の登録に関する技術要件の調和に関する国際会議(ICH)ガイドライン¹ および国家医療製品局(NMPA)ガイドライン²によると、トキシコキネティック(TK)研究におけるラットの採血時点の数は、動的薬物曝露評価の要件を満たす必要があります。ラットのおおよその総血液量は55-70 mL / kg体重^です3。収集時間ポイントは通常、投与後30分以内に集中し、その後減少し、定期検査では48時間以内に10を超える血液サンプルを収集する必要があります⁴。例えば、血液サンプルは、経口投与薬物のTK研究において、12時点(0分、5分、10分、15分、30分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間、8時間、および12時間)で収集される。研究者は、TK^テスト5用の高品質の血漿を得るために、ラットで200〜250μLの血液を繰り返し採取する必要があります。

ラットの採血部位には、尾血管、眼窩後神経叢静脈、顎下静脈、心臓、腹部大動脈⁶などがあります。その中で、ラットの尾静脈からの採血は頻繁に使用される方法であり、これは経験豊富で熟練したオペレータを必要とする^7,8。眼窩後神経叢静脈から血液を採取することはそれほど複雑ではありません。ただし、この方法はラットの視力を損なう可能性があり⁹、心臓と腹部大動脈からの血液は最終的な採血にのみ適しているため、推奨されません¹⁰。意識のあるラットの顎下静脈から血液を採取する別の方法は、より多くの合併症を引き起こすことが示されており、不十分な血液サンプルの質を明らかにしました¹¹。したがって、研究者はサンプリングの難しさを減らすために動物に麻酔をかけるかもしれません。それでも、麻酔はまた、実験のコストを増加させ、より深刻なことに、それはラット¹²の代謝状態に影響を及ぼすであろう。本プロトコルは、麻酔なしでラットの鎖骨下静脈で採血する迅速かつ簡単な方法を使用しており、正確な位置決めと両側交互採血を可能にし、タイムリーかつ繰り返し高品質のサンプルを取得します。

プロトコル

記載された全ての動物実験は、広東省ルーウィン製薬研究所株式会社の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認された雄および雌のSprague Dawley(SD)ラットを、~6〜11週間実験に使用した。ラットは、実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って飼育されました¹³。

1.動物の準備

注:この研究で使用されたすべてのSDラットは覚醒しており、麻酔/安楽死されていませんでした。動物の背中の皮膚をつかんで拘束するスキルが必要です。

1. ラットの首と前肢の間の鎖骨下三角窩の最下点を見つけます。頭部に向かって~2〜3 mm移動し、採血部位の針先に到達します(図1)。電気かみそりを使用して髪を取り除きます。
   注:実験のニーズに応じて、血清または血漿が必要になる場合があります。血漿はこのプロトコルの例として取り上げられており、採血の操作には影響しません。
2. 拭き取りと消毒には75%アルコールで染色した綿棒を用意し、拭き取りには乾いた綿棒を用意します。

2.採血

注:採血とラット拘束技術の経験が必要な少なくとも2人がこれらの手順を実行する必要があります。

1. 片手で首の後ろの皮膚をつかみ、ラットの頭、首、胸を直立させ、注射部位を露出させます(ビデオ1)。注射部位の側面の前肢をまっすぐにして、そのレベルを維持します。
2. もう一方の手で注射器をラットの頭と平行に保ち、先端が腹側に傾くように注射器を外側に5°〜10°傾けます。
3. 針を前腔に完全に挿入します。シリンジを引き戻して、チューブ内の負圧を維持します。
4. 針をゆっくりと深いものから浅いところに動かし、同じ経路に戻ります。血液が注射針に入ったら、針の位置を固定します(ビデオ2)。
   注意: 図 2A (正面図)および 図2B (側面図)に示すように、血液はシリンジ内で一定の速度で充填されます。
5. 施設の動物管理および使用委員会によって設定された基準に従って、最大血液量を監視します。これは動物の体重と健康状態によって異なります。他の要件がない場合は、24時間以内に動物の総血液量の20%以上を除去しないでください、これは~3週間の回復を必要とします¹⁴。
6. 十分な血液サンプルが採取されたら、すぐにシリンジを引き出し、血液治療の準備をします(ステップ3)。
7. ラットの注射部位を~1〜2分間加圧して、出血を止めます。採取部位は首の下部にあるため、鎖骨下静脈の皮膚をつまんで押して出血を止めます(図3)。
   注:繰り返し採血が必要な場合は、両側鎖骨下静脈から交互に採血することができます。
8. ラットをケージに戻し、その状態を観察します。

3.血液サンプルの処理

1. 注射器から針を取り外し、鋭利な道具容器に捨てます。シリンジから1.5mLチューブに血液をゆっくりと移します。シリンジを壁に押し付けて、気泡の形成を防ぎます。
   注意: 圧力によって赤血球が破裂する可能性があるため、溶血を防ぐために針を外してください¹⁴。
2. 微量遠心チューブを覆い、そっとフリックし、少なくとも5回逆さまにして、血液と抗凝固剤を完全に混合します。
3. 血漿を収集してから120分以内に、全血サンプルを室温で2000 x g で~10〜15分間遠心分離します。
4. ピペットガン( 材料表を参照)を使用して、上部プラズマを空のマイクロ遠心チューブに移します。下部の全血でピペットヘッドに触れないでください。赤血球で汚染された血漿を廃棄または再遠心分離します。.
5. サンプルはすぐに使用するか、-30°Cで保管してください。
   注:薬の特性が貯蔵時間を決定します。鎖骨下静脈から得られた血漿標本は半透明で淡黄色である。溶血は血漿を赤くすることがあります。

結果

鎖骨下静脈からの良好な血漿サンプルは、半透明の淡黄色であった(図4、左管)。不適切な採血または操作により溶血を引き起こしました(図4、右管)。

試験施設のデータによると、TKのSDラットの点眼薬の4週間の経口毒性試験では、血液サンプルが最初(1日目)と最後の投与日(28日目)の間の9つの時点(0時間、0.167時間、0.5時間、1?...

ディスカッション

鎖骨下静脈から血液を採取することには一定の利点があります。(1)採血部位は容易に解離し、ラットの姿勢が異なるために静脈叢が規則的ではないため、記載された方法は、ラットの安定した快適な姿勢を維持しながら静脈叢の位置を容易に局在化することができる。(2)操作が簡単で、技術者のスキルの急速な発達に有利であり、動物への苦痛が少ない。(3)動物を快適にするための動作モー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm)	Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China)	20210629
75% alcohol	Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China)	210717
Animal source	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.	grade: SPF	laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847
Cotton swab	Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China)	20210301	Need to be sterilized.
Electric shaver	Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China)	CP-6800
EP tube, 1.5 mL	Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China)
Heparin sodium (2 mL:12500 IU)	Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China)	51200702	Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use.
Labtip (volume range 5-200 μL)	Thermo Fisher Scientific Oy	94300120
Low speed refrigerated centrifuge	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China)	L535R
Pipette gun (20-200 μL)	BRAND	12N92305
Rats (SD)	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China)
Sharp tool container	Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China)
Eye drop			This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided.