Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو توصيف نموذج جديد للتنكس العصبي الزرق على أساس الكي الحراري 360 درجة للضفيرة الوعائية الحوفية ، مما يؤدي إلى ارتفاع ضغط الدم العيني تحت الحاد.

Abstract

الجلوكوما ، السبب الرئيسي الثاني للعمى في جميع أنحاء العالم ، هو مجموعة غير متجانسة من اضطرابات العين التي تتميز بتلف هيكلي في العصب البصري وتنكس خلايا العقدة الشبكية (RGC) ، مما يؤدي إلى خلل بصري عن طريق مقاطعة نقل المعلومات البصرية من العين إلى الدماغ. ارتفاع ضغط العين هو عامل الخطر الأكثر أهمية. وهكذا ، تم تطوير عدة نماذج من ارتفاع ضغط الدم في العين في القوارض إما من خلال الأساليب الجينية أو التجريبية للتحقيق في أسباب وآثار المرض. من بين هؤلاء ، تم الإبلاغ عن بعض القيود مثل الغزو الجراحي ، والتقييم الوظيفي غير الكافي ، ومتطلبات التدريب المكثف ، والامتداد المتغير للغاية لتلف الشبكية. يميز العمل الحالي طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة وفعالة للحث على ارتفاع ضغط الدم العيني في القوارض ، بناء على الكي في درجة حرارة منخفضة ودائرة كاملة للضفيرة الوعائية الحوفية ، وهو مكون رئيسي لتصريف الخلط المائي. يوفر النموذج الجديد ارتفاع ضغط الدم تحت الحاد سهل تقنيا وغير جراحي وقابل للتكرار ، ويرتبط ب RGC التدريجي وتنكس العصب البصري ، ومعدل استرداد سريري فريد بعد الجراحة يسمح بإجراء دراسات وظيفية في الجسم الحي من خلال كل من الطرق الفيزيولوجية الكهربية والسلوكية.

Introduction

تفهم الأدبيات الطبية الجلوكوما على أنها مجموعة غير متجانسة من اعتلالات الأعصاب البصرية التي تتميز بالتنكس التدريجي لخلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، والتشعبات ، والسوما ، والمحاور العصبية ، مما يؤدي إلى الحجامة الهيكلية (الحفر) للقرص البصري والتدهور الوظيفي للعصب البصري ، مما يؤدي إلى الإصابة في الحالات غير المنضبطة عن طريق مقاطعة نقل المعلومات البصرية من العين إلى الدماغ1. الجلوكوما هو حاليا السبب الأكثر شيوعا للعمى الذي لا رجعة فيه في جميع أنحاء العالم ، ومن المتوقع أن يصل إلى ما يقرب من 111.8 مليون شخص فيعام 2040 2 ، مما يؤثر بعمق على نوعية حياة المرضى (QoL) ويؤدي إلى مخاوف اجتماعية واقتصادية كبيرة3.

ارتفاع ضغط العين (IOP) هو واحد من أهم عوامل الخطر القابلة للتعديل والوحيدة لتطوير وتطور الجلوكوما. من بين الأنواع المتعددة من الجلوكوما ، ترتبط جميعها ، باستثناء الجلوكوما التوتر الطبيعي (NTG) ، بارتفاع IOP في وقت ما في التاريخ السريري للمرض. على الرغم من التقدم السريري والجراحي الملحوظ لاستهداف IOP وإبطاء أو إيقاف تطور المرض ، لا يزال المرضى يفقدون البصر بسبب الجلوكوما 4,5. لذلك ، فإن الفهم الشامل للفيزيولوجيا المرضية المعقدة والمتعددة العوامل لهذا المرض أمر حتمي لتطوير علاجات أكثر فعالية ، خاصة لتوفير الحماية العصبية ل RGCs.

من بين مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية لفهم آليات المرض ، تشبه النماذج الحيوانية القائمة على ارتفاع ضغط الدم العيني (OHT) إلى حد كبير الجلوكوما البشرية. تعتبر نماذج القوارض مفيدة بشكل خاص لأنها منخفضة التكلفة ، ويسهل التعامل معها ، ويمكن التلاعب بها وراثيا ، ولها عمر قصير ، وتقدم ميزات تشريحية وفسيولوجية للعين مماثلة للبشر ، مثل إنتاج الخلط المائي والصرف6،7،8،9،10،11،12،13. تشمل النماذج المستخدمة حاليا تصلب الشبكة التربيقية بعد حقن محلول ملحي مفرط التوتر في الأوردة فوق الصلبة14 ، والحقن داخل الغرفة للميكروبيدات 15 أو المواد اللزجةالمرنة 16 ، وكي الأوردة الدوامة 17 ، والتخثير الضوئي للشبكة التربيقية باستخدام ليزر الأرجون 18 ، والخيط المحيطي 19 ، واستخدام نموذج معدل وراثيا ل OHT المرتبط بالعمر (الفئران DBA / 2J) 8. ومع ذلك ، فإن الغزو ، وعتامة القرنية بعد الجراحة ، واضطراب الجزء الأمامي ، ومنحنيات التعلم الواسعة ، والمعدات باهظة الثمن ، و IOPs المتغيرة للغاية بعد العملية الجراحية ، هي من بين عدد قليل من المزالق المبلغ عنها المرتبطة بالنماذج الحالية ، مما يجعل تطوير نموذج بديل ل OHT طلبا للتغلب على هذه المشاكل20،21،22.

يضفي البروتوكول الحالي الطابع الرسمي على إجراء جراحي جديد للحث على OHT كوكيل للجلوكوما ، بناء على كي الضفيرة الحوفي (LPC) في القوارض23. هذا نموذج سهل وقابل للتكرار ويمكن الوصول إليه وغير جراحي يوفر كفاءة عالية وتقلبا منخفضا لارتفاع IOP ، ويرتبط بمعدل مرتفع بشكل فريد من التعافي السريري الكامل ، وبالتالي يوفر تقييما وظيفيا في الجسم الحي في عدد أقل من الحيوانات المستخدمة في كل تجربة. تحفز تقنية الجراحة OHT تحت الحاد مع العودة التدريجية إلى مستويات خط الأساس في غضون أيام قليلة ، والتي تمثل هجوم ارتفاع ضغط الدم الذي يظهر في الجلوكوما الحادة ذات الزاوية المغلقة. علاوة على ذلك ، يتبع انتعاش IOP في النموذج تنكس عصبي مستمر للزرق ، وهو أمر مفيد للدراسات الميكانيكية المستقبلية للانحطاط الثانوي ل RGCs ، والذي يحدث في العديد من حالات الجلوكوما البشرية على الرغم من التحكم الكافي في IOP.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لبيان استخدام الحيوانات في أبحاث العيون والبصرية من جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) ووافقت عليه لجنة الأخلاقيات حول استخدام الحيوانات في التجارب العلمية من مركز العلوم الصحية ، الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو (بروتوكول 083/17). في العمل الحالي ، تم استخدام فئران Lister Hooded من كلا الجنسين ، الذين تتراوح أعمارهم بين 2-3 أشهر ويزن 180-320 جم. ومع ذلك ، يمكن تكييف الإجراء في سلالات الفئران المختلفة من مختلف الفئات العمرية.

1. جراحة ارتفاع ضغط الدم في العين والمتابعة السريرية

  1. منزلية في بيئة درجة حرارة مضبوطة ودورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة (6 صباحا: إضاءة / 6 مساء: إطفاء الضوء) مع طعام قياسي مشع بأشعة غاما (Nuvilab® CR-1 ، Quimtia S / A ، البرازيل) والماء (مرشح ثلاثي ، مع فحم نشط غير سام) متاح حسب الحاجة.
  2. قم بإعداد خليط كوكتيل مخدر يتكون من ثلاثة أجزاء من 10٪ هيدروكلوريد الكيتامين وجزء واحد من 2٪ زيلازين هيدروكلوريد (مخفف: ماء معقم).
  3. كبح جماح الحيوان بلطف عن طريق إمساك الجلد الظهري والحث على التخدير عن طريق إعطاء 1 ميكرولتر / جم من وزن الجسم داخل الصفاق (الكيتامين: 75 مجم / كجم ؛ زيلازين: 5 مجم / كجم). تحقق من التخدير المناسب بعد حوالي 5 دقائق عن طريق إجراء استجابة قرصة إصبع القدم.
  4. تخدير موضعيا كلا سطحي العين عن طريق غرس قطرة العين بروكسي ميتاكايين هيدروكلوريد 0.5٪. انتظر لمدة 30-60 ثانية وقم بإزالة المحلول المتبقي من الجانب الأمامي من الكرة الأرضية ، عن طريق لمس الملتحمة البصلية الأنفية أو الجانبية برفق باستخدام قطعة قطن صغيرة معقمة.
  5. قم بقياس خط الأساس IOP لكل من عيون التحكم التجريبية والمقابلة عن طريق وضع الحيوان في وضع الاستلقاء البطني على سطح الطاولة بحيث يمكن الوصول بسهولة إلى سطح القرنية إلى طرف مقياس توتر العين.
  6. استخدم إما مقياس توتر العين المحمول باليد أو الارتداد (الشكل 1 أ). ضع طرف مقياس التوتر بحيث يلامس قليلا منطقة القرنية المركزية بشكل عمودي. الحصول على متوسط 3-5 متوسطات موثوقة تم إنشاؤها آليا. يتم حساب كل متوسط تلقائيا بواسطة الجهاز بعد ستة قياسات فردية ناجحة.
    1. قم بتحميل مقياس توتر العين المرتد بمسبار واضغط على زر القياس مرة واحدة لتشغيله ، مع وضع طرف الجهاز لأعلى ، لتجنب سقوط المسبار. بعد التشغيل ، ستظهر الشاشة 00 تشير إلى أن الجهاز جاهز للقياس.
    2. ضع الجهاز مع طرف المسبار على مسافة 1-4 مم من القرنية واحصل على القياسات عن طريق الضغط بسرعة وبعناية على زر القياس ، دون تحريك الجهاز. يتم تحديد كل مقياس ناجح من خلال صوت تنبيه قصير وبعد ست مرات ، يتم عرض المتوسط على شاشة الجهاز.
      ملاحظة: على الرغم من الخبرة الطويلة في مقياس توتر العين applanation ، لتحسين الإجراء بأكمله ، يوصي المؤلفون باستخدام مقياس توتر مرتد ، والذي يوفر سهولة الحصول على قياس IOP موثوق.
  7. ضع الحيوان في وضع استلقاء جانبي طفيف تحت مجهر ستيريو ، وخطط بعناية للجراحة عن طريق فحص العين التجريبية عند تكبير 40x. لا تنس الحفاظ على عين التحكم المقابلة مشحمة أثناء العملية عن طريق غرس قطرة من الصوديوم كارميلوز أو هيالورونات الصوديوم.
  8. بمساعدة الملقط المنحني ، ادفع مقلة العين التجريبية برفق للأمام لكشف الأوعية الدموية التي تحيط بزاوية 360 درجة من الحافة13. من ناحية أخرى ، قم بكي الأوعية برفق في جميع أنحاء القرنية باستخدام كي عيني منخفض الحرارة (1300 درجة فهرنهايت ؛ Bovie Medical ، الولايات المتحدة الأمريكية) (الشكل 1B-E).
    ملاحظة: يحتوي الكي المذكور على طرف مستدير يجب أن يلمس الأوعية الدموية الداكنة حول القزحية طوليا.
  9. احرص على عدم كي محيط القرنية ، لأن هذا قد يؤدي إلى عتامة القرنية بعد الجراحة ، مما يحول دون تقييم وظيفة الشبكية في الجسم الحي .
  10. لاحظ ظهور علامات دائرية صغيرة من الكي على الحافة الصلبة ، وطمس الأوعية الدموية القاحفية ، واتساع حدقة العين في العين التي خضعت للجراحة ، وهي علامات على نجاح العملية الجراحية.
    ملاحظة: نظرا لأن الأوعية الدموية الحوفية للجرذان والفئران متشابهة تشريحيا13،24 والكي المستخدم له طرف صغير لطيف ، يمكن أن يعمل هذا البروتوكول مع عين الفأر أيضا دون أي تكيف.
  11. بعد الجراحة ، تحقق من IOP بعد الجراحة مباشرة في كلتا العينين كما هو موضح في الخطوة 1.5.
  12. ضع قطرة من أسيتات بريدنيزولون العينية (1.2 مجم / مل) وحافظ على ملامستها للسطح الأمامي للعين التجريبية لمدة 40 ثانية تقريبا ، ثم استبدلها بمرهم عيني من المضادات الحيوية (أوكسي تتراسيكلين هيدروكلوريد 30 مجم / جم بالإضافة إلى بوليميكسين ب 10000 وحدة / جم ؛ أو سيبروفلوكساسين 3.5 مجم / جم). إجراء الحقن العضلي لترامادول هيدروكلوريد (جرعة واحدة؛ 2 ملغ/كغ) لمنع الألم بعد العملية.
  13. تابع عن كثب تعافي الحيوان من التخدير ، ويفضل في بيئة دافئة مثل وسادة التدفئة أو داخل قفص السكن مع الفراش المناسب. إيلاء الاهتمام لنمط الجهاز التنفسي.
  14. إجراء متابعة سريرية يومية للعين التجريبية باستخدام الأدوية الموضعية المكونة من دواء مضاد للالتهابات غير الستيرويدية (مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية ، على سبيل المثال ، كيتورولاك تروميتامول 0.5٪ قطرة للعين) ومرهم مضاد حيوي (يفضل أن يكون نفس الدواء المستخدم مباشرة بعد الجراحة).
    ملاحظة: يوصى باستخدام مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية بدلا من قطرات العين الستيرويدية المضادة للالتهابات لأن هذا الأخير قد يحفز OHT ويتم تطبيقه بانتظام على نماذج الجلوكوما التي يسببها الجلوكوكورتيكويد في القوارض.
    1. تحت التخدير الطفيف (الكيتامين: 18.75 ملغ/كغ؛ زيلازين: 1.25 ملغ/كغ)، قم بقياس IOP بشكل تفضيلي في نفس الفترة من اليوم، لتجنب التحيز بسبب تذبذب IOP الفسيولوجي في الساعة البيولوجية.
    2. أثناء فحص العين ، لاحظ التداخلات السريرية النادرة ، مثل hyphema أو تليف القرنية أو ترقق الصلبة المرتبط بهبوط العنبية. وذمة القرنية ، والتسمم الكيميائي ، واحتقان الملتحمة شائعة ولكنها مؤقتة.
    3. لاحظ الشفاء السريري الكامل في حوالي يوم ما بعد الجراحة 7. عادة ما تبدأ إعادة التوعي الحوفي في اليومين الأولين بعد الجراحة ، بما يتماشى مع عودة IOP التدريجية المتوقعة إلى خط الأساس.

2. تحليل الاستجابة الحركية البصرية (OMR)

ملاحظة: لهذا الإجراء ، تم استخدام نظام معين25.

  1. رتب أربع شاشات كمبيوتر في رباعي الزوايا ، تحدد ساحة مع منصة في المنتصف. على الشاشات ، اعرض صورة أسطوانة افتراضية ذات حواجز شبكية موجية جيبية موجهة رأسيا (خطوط سوداء وبيضاء بديلة) ، تدور حول المنصة بسرعة ثابتة (12 درجة / ثانية) وتباين (100٪).
  2. ضع كاميرا فيديو فوق المنصة ، مما يسمح للمجرب بمشاهدة حركات الحيوان. قم بإجراء الاختبار في ظروف التصوير الفوتوغرافي واضبط البرنامج بشكل تفضيلي على الوضع اليدوي / المنفصل من أجل تقييم كل عين على حدة.
  3. اسمح للحيوانات بالتعود لمدة 2 دقيقة تقريبا على المنصة. حافظ على مؤشر التقاطع الأحمر على إطار الفيديو بين عيني الحيوان الذي يتحرك بحرية ، لأنه يشير إلى مركز الأسطوانة الافتراضية (الشكل 1G)25.
  4. راقب OMR ، الذي يتكون من تتبع انعكاسي لرأس الحيوان ورقبته مستمدة من حواجز شبكية دوارة. اختبر المسارات المرئية اليمنى واليسرى عن طريق تدوير اتجاهات حواجز شبكية للموجة الجيبية في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة ، على التوالي.
    1. في البداية تقديم حافز بتردد مكاني منخفض (0.042 دورة / درجة). بعد ذلك ، قم بزيادة التردد تدريجيا حتى لا يتم ملاحظة حركة التتبع بعد الآن. أعلى تردد مكاني يتم فيه استنباط OMR واضح يتوافق مع عتبة التردد المكاني للعين التي تم تقييمها.
    2. إذا سقط الحيوان في النهاية من المنصة أثناء الامتحان ، فأعده على الفور إلى المنصة واستأنف الاختبار.

3. تسجيل مخطط كهربية الشبكية (PERG)

ملاحظة: تم تسجيل مخطط كهربية الشبكية باستخدام نظام محدد لمعالجة الإشارات والبرمجيات ذات الصلة لتخزين وتحليل الأشكال الموجية.

  1. تخدير الحيوانات تخديرا عميقا عن طريق الحقن العضلي لهيدروكلوريد الكيتامين وهيدروكلوريد الزيلازين (75 مغ/كغ و5 ملغ/كغ، على التوالي). يقلل التخدير العميق (المستوى الجراحي) من فرص حدوث القطع الأثرية عن طريق حركات العضلات اللاإرادية أو مصادر بديلة للضوضاء أثناء الفحص. تحقق من التخدير المناسب عن طريق إجراء استجابة قرصة إصبع القدم.
    ملاحظة: عوامل التخدير المذكورة لا تؤثر على سعة الاستجابة26. نظرا لاستخدام إبرة صغيرة يتم إدخالها في القرنية كقطب كهربائي نشط ، يفضل التخدير داخل العضلات بدلا من التخدير داخل الصفاق ، حيث يسهل إعادة الحقن في حالة احتياج الجرذ إلى جرعة معززة (1/2 من الجرعة الأولية) ، مع فرص أقل لتعديل موضع القطب وبالتالي يؤدي إلى المزيد من السجلات القابلة للتكرار خلال التجربة بأكملها ، والتي قد تستمر حتى 60 دقيقة.
  2. تخدير القرنية موضعيا بقطرة من بروكسي ميتاكايين هيدروكلوريد 0.5٪ ، والحفاظ على ترطيب العين بمواد تشحيم العيون.
  3. أدخل بعناية القطب النشط (إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ 0.25 مم × 15 مم) في المحيط الزمني للقرنية. بالإضافة إلى ذلك ، أدخل الأقطاب الكهربائية المرجعية والأرضية (إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ 0.4 مم × 37 مم) في الأنسجة تحت الجلد للكانثوس الصدغي المماثل وفي أحد الأطراف الخلفية ، على التوالي (الشكل 1I).
  4. بالنسبة ل PERG ، اضبط التحفيز على رقعة الشطرنج الاحتياطية بالأبيض والأسود ، بالتناوب عند 15 انعكاسا / ثانية بمتوسط إضاءة ثابت (250 شمعة / م 2). اضبط مرشح تمرير النطاق على 1 هرتز - 100 هرتز.
    ملاحظة: يولد التحفيز العكسي السريع PERG في الحالة المستقرة ، وهو جيب مستقر وقابل للتكرار يجمع مكون الموجة المرتبط على الأرجح بالاستجابة الكهربائية الحيوية RGC: انحراف NII ل PERG في الحالة العابرة.
  5. ضع الحيوان على بعد 20 سم من شاشة التحفيز (شاشة LCD 0.58 م ؛ الشكل 1I) ، ومراقبة خط الأساس للإشارة ، وبدء اكتساب PERG بالضغط على زر التحليل في نظام الاستحواذ.
  6. أثناء الإجراء ، حافظ على الحيوانات تتكيف مع الضوء البيئي (ضوء أبيض ~ 140 لوكس). هنا ، تم تقديم ستة ترددات مكانية متميزة (في دورات لكل درجة: 0.018 ، 0.037 ، 0.073 ، 0.146 ، 0.292 ، 0.585) في تسلسل عشوائي.
    ملاحظة: يقوم البرنامج المستخدم لمعالجة الإشارات تلقائيا بإجراء حساب متوسط. اعتبر متوسط 200-300 موجة فردية كافيا للتميز عن الضوضاء وتحليل سعة الموجة.

4. القياس الكمي لخلايا العقدة الشبكية

ملاحظة: الإجراء التالي هو للقياس الكمي ل RGC somas ، بناء على التلوين الكيميائي المناعي للحوامل المسطحة للشبكية مع جسم مضاد ضد بروتين المجال Homeobox / POU الخاص بالدماغ 3A (Brn3a).

  1. إخضاع التجارب للقتل الرحيم لخلع عنق الرحم ، يسبقه استنشاق ثاني أكسيد الكربون للحث على فقدان الوعي.
  2. مباشرة بعد القتل الرحيم ، تشريح كلتا العينين تحت المجهر ستيريو ، وذلك باستخدام ملقط مسنن ومقص منحني.
  3. قم بإجراء تشريح دقيق بحيث يظل كل من الجزء البعيد من عضلات العين الخارجية والجمرة مرتبطين بالكرة الأرضية ، حيث إنهما معلمان مهمان للتوجيه الطبوغرافي لشبكية العين (الموصوفة في الخطوة 4.5). حاول حفظ امتداد العصب البصري المتصل بالكرة الأرضية لأطول فترة ممكنة للتحليل في المستقبل.
  4. بعد الاستئصال ، ضع العينين في محلول 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (4٪ PFA) في محلول فوسفات 0.1 متر (PBS) واحتفظ به لمدة 24 ساعة للتثبيت الكيميائي المناسب.
  5. افصل الشبكية عن بقية أنسجة العين.
    1. تحت مجهر تشريح ، ضع مقلة العين في طبق بتري مغطى ب 1x PBS ، وانتبه إلى المعالم المهمة مثل جثة الأنف ، والشقوق المشيمية ، وبصمات الصلبة من الأوردة الدوامة للتوجيه الطبوغرافي المناسب27.
    2. اختراق الغرفة الأمامية من القرنية المركزية باستخدام ملقط مسنن ومقص منحني (ويستكوت). قم بعمل قطعتين شعاعيتين للجانب العلوي (الظهري) من الصلبة ، باتجاه الثقبة الصلبة للعصب البصري ، وذلك لتحديد الربع الظهري لمقلة العين.
    3. افصل القرنية عن بقية الكرة الأرضية من خلال قطع طولي بزاوية 360 درجة في الحافة الصلبة. قم بإزالة العدسة والقزحية وحدد ربع الشبكية الظهري باستخدام نفس الحدود الشعاعية الصلبة الموصوفة أعلاه (الخطوة 4.5.2).
    4. افصل أنسجة الشبكية بعناية عن المشيمية والصلبة ، وتجنب كل من التمزقات العشوائية في جميع أنحاء الأنسجة وفقدان الاتجاه الطبوغرافي في نهاية المطاف.
    5. افصل الجسم الهدبي عن الشبكية ora serrata. قم بإزالة الجسم الزجاجي المتبقي بعناية من كأس الشبكية باستخدام كل من الملقط المنحني غير المسنن بالإضافة إلى المقص المنحني (اسحب الجسم الزجاجي وقم بتشريحه بالقرب من الغشاء المحدد الداخلي) وفرشاة صغيرة.
      ملاحظة: تعد إزالة الفكاهة الزجاجية خطوة مهمة للحصول على إشارة كيميائية مناعية قوية ونظيفة.
  6. انقل شبكية العين المعزولة إلى لوحة استزراع مكونة من 24 بئرا (شبكية واحدة لكل بئر) تحتوي على 1 مل من 1x PBS وحافظ على شبكية العين الداخلية متجهة لأعلى.
  7. تتخلل الأنسجة عن طريق غسل 3x لمدة 10 دقائق مع السطحي غير الأيونية 0.5 ٪ مخففة في 1x PBS (0.3 مل). ثم حافظ على اهتزاز الأنسجة بلطف في 5٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في خافض للتوتر السطحي غير الأيوني 2٪ و 1x PBS (محلول مانع ؛ 0.25 مل) لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. خلال الخطوة 4.7 ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأولية Brn3a عن طريق تخفيف 1: 200 في خافض للتوتر السطحي غير الأيوني 0.5٪ و 1x PBS بالإضافة إلى 5٪ BSA ، وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  9. بعد 60 دقيقة من انسداد الأنسجة، احتضان شبكية العين في 0.2 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية لمدة 72 ساعة مع رج خفيف.
  10. اغسل المنديل 3x لمدة 10 دقائق باستخدام 1x PBS ، ثم احتضان الأنسجة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في 0.2 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوي المخفف 1: 750 في 1x PBS بالإضافة إلى 5٪ BSA.
  11. علاوة على ذلك ، احتضان الأنسجة لمدة 10 دقائق في محلول مضاد نووي لتلطيخ نوى الفلورسنت. اختتم الكيمياء الهيستولوجية المناعية بخطوة غسيل نهائية مع تكرار 1x PBS (0.3 mL) 3x.
  12. انقل شبكية العين بمساعدة فرشتين صغيرتين على شرائح مجهر زجاجية ، مع الحفاظ على الجانب الزجاجي لأعلى. ضع ربع الشبكية الظهري لأعلى على شرائح المجهر (المحددة مسبقا في الخطوة 4.5.3). قم بإجراء قطعتين شعاعيتين أخريين باتجاه رأس العصب البصري لتحديد الأرباع ال 3 الأخرى (الأنف والبطني والصدغي).
    ملاحظة: أبعاد القطع غير ثابتة. يجب ألا تكون قصيرة جدا مما يضعف التسطيح الفعال للشبكية على الشريحة ويجب ألا تكون طويلة جدا بحيث تصل إلى ثقبة العصب البصري وتفصل تماما ربع الشبكية المحدد عن بقية الأنسجة.
  13. أخيرا ، ضع 0.2 مل من وسط التثبيت المضاد للتلاشي على غطاء زجاجي وضعه على شبكية العين المثبتة بشكل مسطح للتحليل المجهري للأنسجة. لتقدير كثافة RGCs ، افحص الحوامل المسطحة تحت مجهر التألق متحد البؤر باستخدام هدف 40x / 1.3.
  14. لكل ربع من شبكية العين ، التقط ثماني صور: اثنتان من الشبكية المركزية (~ 0.9 مم من القرص البصري) ، وثلاثة من منتصف الشبكية (~ 2.0 مم من القرص البصري) ، وثلاثة من الشبكية المحيطية (~ 3.7 مم من القرص البصري) ، بإجمالي 32 صورة لكل شبكية. استخدم برنامج FIJI لحساب الخلايا الإيجابية Brn3a وتقدير متوسط كثافة الخلايا.

5. فحص العصب البصري

  1. بعد القتل الرحيم واستئصال مقلة العين (الخطوات 4.1-4.3) ، قم بإزالة الجزء القريب من الجزء داخل الحجاج من العصب البصري (1-2 مم) ، بما في ذلك جزء من الجزء داخل العين ، وضع العينات على الفور في قوارير / أنابيب تحتوي على 0.2-0.3 مل من المثبت البارد (2.5٪ محلول غلوتارالدهيد في 0.1 متر مخزن كاكوديلات الصوديوم (درجة الحموضة 7.4)) لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية لمعالجة العصب البصري في نفس القوارير / الأنابيب من الخطوة 5.1
  2. اغسل المادة 3 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم البارد 0.1 متر. بعد تثبيت الأنسجة لمدة ساعة واحدة تحت الاهتزاز اللطيف في محلول من 1.0٪ رابع أكسيد الأوزميوم في 0.8٪ فيروسيانيد البوتاسيوم و 5 نانومتر كلوريد الكالسيوم المخفف في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم العازلة عند 4 درجات مئوية (0.1-0.2 مل).
  3. اغسل شظايا العصب البصري 3x لمدة 5 دقائق مع مخزن كاكوديلات الصوديوم البارد 0.1 متر وبعد ذلك بالماء المقطر البارد ، 3x لمدة 1 دقيقة. احتفظ بالمادة طوال الليل تحت الرج اللطيف في محلول من 1.0٪ أسيتات اليورانيل في الماء المقطر للتلطيخ عند 4 درجات مئوية (0.1-0.2 مل). اغسل الشظايا 3x بالماء المقطر البارد.
  4. تجفيف الأنسجة تدريجيا بسلسلة أسيتون متدرجة (0.5 مل لكل منهما) ، مع بدائل لاحقة للتخفيفات التالية في الماء المقطر: حضانة 2 × 7 دقائق في 15٪ أسيتون بارد مثلج. 2 × 7 دقائق حضانة في 30٪ أسيتون بارد مثلج ؛ حضانة 2 × 7 دقائق في 50٪ أسيتون بارد ؛ 2 × 7 دقائق حضانة في 70٪ أسيتون بارد مثلج ؛ 2 × 7 دقائق حضانة في 80٪ أسيتون بارد مثلج ؛ حضانة 2 × 7 دقائق في 90٪ أسيتون بارد ؛ 2 × 15 دقيقة حضانة في 100٪ أسيتون في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. تنفيذ 3 خطوات تسلل / تضمين ، مع استبدال لاحق للحلول التالية: 1 جزء راتنجات الايبوكسي: 2 أجزاء الأسيتون (الحجم الكلي: 0.5 مل) ، في RT لمدة 12 ساعة ؛ 1 جزء راتنجات الايبوكسي: 1 جزء الأسيتون (الحجم الكلي: 0.5 مل) ، في RT لمدة 12 ساعة ؛ 2 أجزاء راتنجات الايبوكسي: 1 جزء الأسيتون (الحجم الكلي: 0.5 مل) ، في RT لمدة 12 ساعة. أخيرا ، تسلل الأنسجة في راتنجات الايبوكسي النقية في RT لمدة 24 ساعة.
  6. قم بإزالة العينات من حامل العينات ، وانقلها إلى قوالب التضمين ، واتركها تتبلمر لمدة 48 ساعة عند 60 درجة مئوية. قطع مقاطع شبه رقيقة مستعرضة (300-400 نانومتر) من شظايا العصب البصري باستخدام microtome ultramicrotome ، وجمعها ونقلها إلى شريحة زجاجية المجهر. قم بتلطيخ المقاطع باللون الأزرق التولويدين وصورة باستخدام المجهر البصري بتكبير 100x.
  7. لتحليل البنية الفائقة ، قم بإجراء مقاطع عرضية فائقة النحافة (70 نانومتر) ، وقم بجمعها على شبكات نحاسية ، وقم بتلطيخها بأسيتات اليورانيل وسترات الرصاص. افحص الأقسام الموجودة في المجهر الإلكتروني النافذ.

النتائج

يتم التعبير عن المتغيرات الكمية كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM). باستثناء مقارنة ديناميكيات IOP بين OHT والمجموعات الضابطة (الشكل 1F) ، تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنات المتعددة ل Sidak. واعتبرت القيمة الاحتمالية < 0.05 ذات دلالة إحصائي?...

Discussion

الكي الضفيرة القزحية (LPC) هو نموذج جديد لما بعد التربيق مع ميزة أنه يستهدف الهياكل الوعائية التي يمكن الوصول إليها بسهولة والتي لا تتطلب تشريح الملتحمة أو الوتر17,28. بشكل مختلف عن نموذج الكي في الأوردة الدوامة ، وهو نموذج OHT مشهور يعتمد على الضعف الجراحي للتصر...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نحن نعترف بفنيي المختبرات لدينا خوسيه. نيلسون دوس سانتوس ، دايان ماندرينو توريس ، خوسيه فرانسيسكو تيبورسيو ، جيلدو بريتو دي سوزا ، ولوتشيانو كافالكانتي فيريرا. تم تمويل هذا البحث من قبل FAPERJ و CNPq و CAPES.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneIsofar201Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinographyHansol Medical Co-Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
AnestalconNovartis Biociências S/AMS-1.0068.1087Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chlorideVetec560Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bxBovie Medical CorporationAA00Low-temperature ophthalmic cautery
CetaminSyntec do Brasil Ltda000200-3-000003Ketamine hydrochloride 10%
DAKODako North AmericaS3023Antifade mounting medium
DAPIThermo Fisher Scientific28718-90-3diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
EcofilmCristália Produtos Químicos Farmacêuticos LtdaMS-1.0298.0487Carmellose sodium 0.5%
EPON ResinPolysciences, Inc.-Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16110Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
HyabakUnião Química Farmacêutica Nacional S/AMS-8042140002Sodium hyaluronate 0.15%
Icare TonolabIcare Finland OyTV02 (model number)Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA31570Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inchesSamsung Electronics Co. Ltd.S23B550Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 MetaCarl Zeiss-Confocal epifluorescence microscope
MaxifloxCristália Produtos Químicos Farmacêuticos LtdaMS-1.0298.0489Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400KNihon Kohden Corporation-System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3aMilliporeSigmaMAB-1585Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33Nihon Kohden Corporation-Software for electroretinogram signal processing
OptomotryCerebralMechanics-System for optomotor response analysis
Osmium tetroxideElectron Microscopy Sciences19100Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanideElectron Microscopy Sciences20150Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinographyChalgren Enterprises110-63Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate bufferElectron Microscopy Sciences12300Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MDUnião Química Farmacêutica Nacional S/AMS-1.0497.1287Prednisolone acetate 0.12%
TerolacCristália Produtos Químicos Farmacêuticos LtdaMS-1.0497.1286Ketorolac trometamol 0.5%
TerramicinaLaboratórios Pfizer LtdaMS-1.0216.0024Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XLReichert Technologies230635Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3Thermo Fisher ScientificT3605Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5Non-ionic surfactant
Uranyl acetateElectron Microscopy Sciences22400Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
XilazinSyntec do Brasil Ltda7899Xylazine hydrochloride 2%
Carl Zeiss-Stereo microscope for surgery and retinal dissection

References

  1. Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
  2. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  3. Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
  4. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  5. Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1 (2015).
  6. Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).
  7. Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
  8. John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
  9. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
  10. Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
  11. vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
  12. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Aqueous humor dynamics in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5168-5173 (2003).
  13. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal microvasculature of the rat eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 751-756 (1995).
  14. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  15. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
  16. Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
  17. Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
  18. Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
  19. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
  20. Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
  21. Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13 (2018).
  22. Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
  23. Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).
  24. vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
  25. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  26. Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
  27. Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
  28. Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).
  29. Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , 139-157 (2008).
  30. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RGC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved