Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Resumo

O objetivo deste protocolo é caracterizar um novo modelo de neurodegeneração glaucomatosa baseado na cauterização térmica 360° do plexo vascular limbal, induzindo hipertensão ocular subaguda.

Resumo

O glaucoma, segunda causa de cegueira no mundo, é um grupo heterogêneo de doenças oculares caracterizadas por danos estruturais ao nervo óptico e degeneração das células ganglionares da retina (CGR), resultando em disfunção visual pela interrupção da transmissão de informações visuais do olho para o cérebro. A pressão intraocular elevada é o fator de risco mais importante; Assim, vários modelos de hipertensão ocular têm sido desenvolvidos em roedores por abordagens genéticas ou experimentais para investigar as causas e efeitos da doença. Dentre essas, algumas limitações têm sido relatadas, como invasividade cirúrgica, avaliação funcional inadequada, exigência de treinamento extensivo e extensão altamente variável do dano retiniano. O presente trabalho caracteriza um método simples, de baixo custo e eficiente para induzir hipertensão ocular em roedores, baseado na cauterização em círculo completo do plexo limbal a baixa temperatura, um dos principais componentes da drenagem aquosa do humor. O novo modelo proporciona uma hipertensão ocular subaguda tecnicamente fácil, não invasiva e reprodutível, associada à degeneração progressiva do CGR e do nervo óptico, e uma taxa de recuperação clínica pós-operatória única que permite estudos funcionais in vivo por métodos eletrofisiológicos e comportamentais.

Introdução

A literatura médica entende o glaucoma como um grupo heterogêneo de neuropatias ópticas caracterizadas por degeneração progressiva das células ganglionares da retina (CGRs), dendritos, soma e axônios, resultando em escavação estrutural (escavação) do disco óptico e deterioração funcional do nervo óptico, levando à amaurose em casos não controlados pela interrupção da transmissão de informações visuais do olho para o^cérebro1. Atualmente, o glaucoma é a causa mais comum de cegueira irreversível em todo o mundo, com previsão de atingir aproximadamente 111,8 milhões de pessoas em 2040², afetando profundamente a qualidade de vida (QV) dos pacientes e levando a importantes preocupações socioeconômicas³.

A pressão intraocular (PIO) elevada é um dos mais importantes e o único fator de risco modificável para o desenvolvimento e progressão do glaucoma. Dentre os múltiplos tipos de glaucoma, todos, exceto o glaucoma de tensão normal (GNT), estão associados à PIO elevada em algum momento da história clínica da doença. Apesar dos notáveis avanços clínicos e cirúrgicos para atingir a PIO e retardar ou interromper a progressão da doença, os pacientes ainda perdem a visão devido ao glaucoma ^4,5. Portanto, o conhecimento aprofundado da fisiopatologia complexa e multifatorial dessa doença é imperativo para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes, especialmente para fornecer neuroproteção aos CGRs.

Entre uma variedade de abordagens experimentais para a compreensão dos mecanismos da doença, os modelos animais baseados em hipertensão ocular (OHT) mais se assemelham ao glaucoma humano. Os modelos de roedores são particularmente úteis por serem de baixo custo, fácil manuseio, manipulação genética, vida útil curta e características anatômicas e fisiológicas oculares comparáveis aos humanos, como produção e drenagem do humor aquoso 6,7,8,9,10,11,12,13 . Os modelos atualmente utilizados incluem esclerose da malha trabecular após injeção de solução salina hipertônica em veias episclerais 14, injeção intracameral de microesferas¹⁵ ou substâncias viscoelásticas 16, cauterização de veias vórtices 17, fotocoagulação da tela trabecular com laser de argônio¹⁸, sutura circunlimbal ¹⁹ e uso de um modelo transgênico de OHT relacionada à idade (camundongos DBA/2J)8. No entanto, invasividade, opacificação pós-operatória da córnea, ruptura do segmento anterior, curvas de aprendizado extensas, equipamentos caros e PIO pós-operatória altamente variável estão entre algumas das armadilhas relatadas associadas aos modelos atuais, tornando o desenvolvimento de um modelo alternativo de ESB uma demanda para superar esses problemas^20,21,22.

O presente protocolo formaliza um novo procedimento cirúrgico para induzir OHT como substituto do glaucoma, baseado na cauterização do plexo limbal (LPC) em^roedores23. Trata-se de um modelo fácil, reprodutível, acessível e não invasivo, que proporciona alta eficiência e baixa variabilidade de elevação da PIO, associado a uma taxa excepcionalmente alta de recuperação clínica completa, proporcionando avaliação funcional in vivo em um número reduzido de animais utilizados em cada experimento. A técnica cirúrgica induz OHT subaguda com retorno gradual aos níveis basais em poucos dias, o que modela o ataque hipertensivo observado no glaucoma agudo de ângulo fechado. Além disso, a recuperação da PIO no modelo é seguida por neurodegeneração glaucomatosa contínua, o que é útil para futuros estudos mecanísticos da degeneração secundária dos CGRs, que ocorre em vários casos de glaucoma humano apesar do controle adequado da PIO.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) e aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Experimentação Científica do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro (protocolo 083/17). No presente trabalho, foram utilizados ratos Lister Hooded, de ambos os sexos, com idade entre 2-3 meses e peso de 180-320 g. No entanto, o procedimento pode ser adaptado em diferentes linhagens de ratos de várias faixas etárias.

1. Cirurgia de hipertensão ocular e seguimento clínico

1. Animais domésticos em ambiente de temperatura controlada e ciclo claro/escuro de 12 h (6h: luz acesa/ 18h: luz apagada) com alimento padrão peletizado irradiado por radiação gama (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brasil) e água (filtro triplo, com carvão ativado atóxico) disponível ad libitum.
2. Preparar uma calda de coquetel anestésico composta por três partes de cloridrato de cetamina a 10% e uma parte de cloridrato de xilazina a 2% (diluente: água estéril).
3. Conter suavemente o animal segurando a pele dorsal e induzir anestesia pela administração intraperitoneal de 1 μL/g de peso corporal da mistura (cetamina: 75 mg/kg; xilazina: 5 mg/kg). Verifique se há anestesia adequada após aproximadamente 5 min, realizando uma resposta de pinça do dedo.
4. Anestesiar topicamente ambas as superfícies oculares instilando colírio de proximetacaína a 0,5%. Aguarde 30-60 s e remova a solução restante da face anterior do globo, tocando suavemente a conjuntiva bulbar nasal ou lateral com um pequeno cotonete estéril.
5. Medir a PIO basal dos olhos controles experimentais e contralaterais colocando o animal em decúbito ventral na bancada, de modo que a superfície corneana seja facilmente acessível à ponta do tonômetro.
6. Use o tonômetro portátil de aplanação ou rebote (Figura 1A). Posicione a ponta do tonômetro de forma que ela toque levemente a zona corneana central perpendicularmente. Adquira e faça uma média de 3 a 5 médias confiáveis geradas por máquinas. Cada média é calculada automaticamente pelo aparelho após seis medições individuais bem-sucedidas.
   1. Carregue o tonômetro de rebote com uma sonda e pressione o botão de medição uma vez para ligá-lo, enquanto coloca a ponta do dispositivo para cima, a fim de evitar que a sonda caia. Após ligar, o visor mostrará 00 indicando que o equipamento está pronto para medir.
   2. Posicione o aparelho com a ponta da sonda a uma distância de 1-4 mm da córnea e adquira as medidas pressionando rápida e cuidadosamente o botão de medição, sem movimentar o equipamento. Cada medida bem-sucedida é identificada por um bipe curto e, após seis vezes, a média é exibida na tela do dispositivo.
      NOTA: Apesar da longa experiência com tonômetro de aplanação, para otimizar todo o procedimento os autores recomendam o uso de um tonômetro de rebote, que facilita a obtenção de medidas confiáveis da PIO.
7. Colocar o animal em decúbito lateral leve sob estereomicroscópio e planejar cuidadosamente a cirurgia inspecionando o olho experimental em aumento de 40x. Não se esqueça de manter o olho de controle contralateral lubrificado durante o procedimento, instilando uma gota de carmelose sódica ou hialuronato de sódio.
8. Com o auxílio de pinças curvas, empurre suavemente o globo ocular experimental de modo a expor a vasculatura que envolve 360° do limbo¹³. Com a outra mão, cauterizar suavemente os vasos ao redor da córnea com um cautério oftálmico de baixa temperatura (1.300 °F; Bovie Medical, EUA) (Figura 1B-E).
   OBS: O referido cautério possui ponta arredondada que deve tocar longitudinalmente a vasculatura do limbo.
9. Cuidado para não cauterizar a periferia corneana, pois isso pode resultar em opacificação corneana pós-operatória, o que impossibilita a avaliação in vivo da função retiniana.
10. Observar o surgimento de pequenas marcas circulares de cauterização no limbo escleral, a obliteração da vasculatura limbal e a dilatação pupilar no olho operado, sinais de sucesso do procedimento cirúrgico.
    OBS: Como a vasculatura limbal de ratos e camundongos é anatomicamente semelhante^13,24 e o cautério utilizado possui ponta pequena e suave^, este protocolo pode funcionar também para o olho de camundongo sem qualquer adaptação.
11. Após a cirurgia, verificar a PIO pós-operatória imediata em ambos os olhos, como descrito no passo 1.5.
12. Aplicar uma gota de acetato de prednisolona oftálmica (1,2 mg/mL) e mantê-la em contato com a superfície anterior do olho experimental por cerca de 40 s, substituindo-a por uma pomada oftálmica de antibióticos (cloridrato de oxitetraciclina 30 mg/g mais polimixina B 10.000 U/g; ou ciprofloxacina 3,5 mg/g). Realizar injeção intramuscular de cloridrato de tramadol (dose única; 2 mg/kg) para prevenir dor após o procedimento.
13. Acompanhe de perto a recuperação do animal da anestesia, preferencialmente em um ambiente quente, como uma almofada de aquecimento ou dentro de sua gaiola de alojamento com cama adequada. Preste atenção ao padrão respiratório.
14. Realizar acompanhamento clínico diário do olho experimental com medicações tópicas compostas por anti-inflamatório não esteroidal (AINE, por exemplo, colírio cetorolaco trometamol 0,5%) e pomada antibiótica (preferencialmente a mesma utilizada imediatamente após a cirurgia).
    NOTA: O uso de AINEs em vez de colírios anti-inflamatórios esteroidais é recomendado porque este último pode induzir OHT e é regularmente aplicado para modelos de glaucoma induzido por glicocorticoides em roedores.
    1. Sob sedação leve (cetamina: 18,75 mg/kg; xilazina: 1,25 mg/kg), medir a PIO preferencialmente no mesmo período do dia, para evitar viés devido à flutuação fisiológica da PIO circadiana.
    2. Durante o exame ocular, observe intercorrências clínicas raras, como hifema, fibrose corneana ou adelgaçamento escleral associado ao prolapso uveal. Edema de córnea, quemose e hiperemia conjuntival são comuns, mas temporários.
    3. Observar recuperação clínica completa por volta do 7º dia de pós-operatório. A revascularização do limbo geralmente começa nos primeiros dois dias após a cirurgia, de acordo com o retorno gradual esperado da PIO aos valores basais.

2. Análise da resposta optomotora (OMR)

OBS: Para este procedimento, foi utilizado um sistema específico²⁵.

1. Organize quatro monitores de computador em um quadrilátero, que delimitam uma arena com uma plataforma no meio. Nos monitores, exibe a imagem de um cilindro virtual com grades senoidais orientadas verticalmente (listras alternadas em preto e branco), girando em torno da plataforma a uma velocidade fixa (12 graus/s) e contraste (100%).
2. Posicione uma câmera de vídeo acima da plataforma, permitindo que o experimentador observe os movimentos do animal. Realizar o teste em condições fotópicas e definir o software preferencialmente no modo manual/separado, a fim de avaliar cada olho separadamente.
3. Permita que os animais se habituem por aproximadamente 2 min na plataforma. Mantenha o cursor da mira vermelha no quadro de vídeo entre os olhos do animal em movimento livre, pois indica o centro do cilindro virtual (Figura 1G)²⁵.
4. Observar a TMO, que consiste em um rastreamento reflexivo da cabeça e pescoço do animal provocado pelas grades rotatórias. Teste as vias visuais esquerda e direita girando as direções das grades de onda senoidal no sentido horário e anti-horário, respectivamente.
   1. Inicialmente apresentam um estímulo com baixa frequência espacial (0,042 ciclos/grau). Em seguida, incremente a frequência progressivamente até que o movimento de rastreamento não seja mais notado. A maior frequência espacial em que uma OMR clara é eliciada corresponde à frequência espacial limiar do olho avaliado.
   2. Se o animal eventualmente cair da plataforma durante o exame, devolva-o imediatamente à plataforma e retome o teste.

3. Registro do eletrorretinograma padrão (PERG)

OBS: O eletrorretinograma foi registrado utilizando-se um sistema específico para processamento de sinais e software relacionado para armazenamento e análise das formas de onda.

1. Anestesiar profundamente os animais por injeção intramuscular de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina (75 mg/kg e 5 mg/kg, respectivamente). A anestesia profunda (plano cirúrgico) diminui as chances de artefatos por movimentos musculares involuntários ou fontes alternativas de ruído durante o exame. Verifique se há anestesia adequada realizando uma resposta de pinça do dedo do pé.
   LEGENDA: Os agentes anestésicos citados não afetam a amplitude da resposta²⁶. Como uma pequena agulha inserida na córnea foi usada como eletrodo ativo, a anestesia intramuscular é preferida em vez da intraperitoneal, pois é mais fácil de reinjetar caso o rato necessite de uma dose de reforço (1/2 da dose inicial), com menores chances de modificar a posição do eletrodo e, assim, levando a registros mais reprodutíveis durante todo o experimento, que pode durar até 60 min.
2. Anestesiar topicamente a córnea com uma gota de cloridrato de proximetacaína 0,5% e manter o olho umedecido com lubrificantes oftálmicos.
3. Inserir cuidadosamente o eletrodo ativo (agulha de aço inoxidável 0,25 mm × 15 mm) na periferia temporal da córnea. Além disso, inserir os eletrodos de referência e terra (agulha de aço inoxidável 0,4 mm × 37 mm) no tecido subcutâneo do canto temporal ipsilateral e em um dos membros pélvicos, respectivamente (Figura 1I).
4. Para o PERG, ajuste o estímulo para um xadrez reservatório preto e branco, alternando em 15 reversões/s com luminância média constante (250 cd/m2). Defina o filtro passa-banda para 1 Hz-100 Hz.
   NOTA: O estímulo de reversão rápida gera o PERG em estado estacionário, um sinusóide estável e reprodutível que reúne o componente de onda mais provavelmente associado à resposta bioelétrica RGC: a deflexão NII do PERG de estado transitório.
5. Posicionar o animal a 20 cm da tela de estímulo (monitor LCD 0,58 m; Figura 1I), monitore a linha de base do sinal e inicie a aquisição do PERG pressionando o botão Analysis no sistema de aquisição.
6. Durante o procedimento, mantenha os animais adaptados à luz do ambiente (luz branca de ~140 lux). Aqui, seis frequências espaciais distintas (em ciclos por grau: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) foram apresentadas em sequência aleatória.
   NOTA: O software usado para processamento de sinais executa automaticamente a média. A média de 200-300 ondas individuais foi considerada adequada para se destacar do ruído e analisar a amplitude das ondas.

4. Quantificação de somas de células ganglionares da retina

NOTA: O procedimento a seguir é para quantificação de somas RGC, com base na coloração imunohistoquímica de montagens planas da retina com um anticorpo contra a proteína de domínio homeobox/POU 3A específica do cérebro (Brn3a).

1. Submeter animais de experimentação à eutanásia por luxação cervical, precedida de inalação de dióxido de carbono para induzir inconsciência.
2. Imediatamente após a eutanásia, dissecar ambos os olhos sob um microscópio estéreo, usando pinça dentada e tesoura curva.
3. Realizar dissecção cuidadosa de modo que tanto a porção distal dos músculos extraoculares quanto a carúncula permaneçam aderidas ao globo ocular, pois são marcos importantes para a orientação topográfica da retina (descritos no passo 4.5). Tente salvar um trecho do nervo óptico ligado ao globo o maior tempo possível para análises futuras.
4. Após a enucleação, colocar os olhos em uma solução de 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA 4%) em tampão fosfato 0,1 M (PBS) e mantê-lo por 24 h para fixação química adequada.
5. Separe a retina do resto dos tecidos oculares.
   1. Sob um microscópio dissecante, coloque o globo ocular em uma placa de Petri coberta com PBS 1x e preste atenção a pontos de referência importantes, como carúncula nasal, fissuras coroides e impressões esclerais de vórtices para orientação topográfica adequada²⁷.
   2. Penetrar na câmara anterior a partir da córnea central usando pinça dentada e tesoura curva (westcott). Realizar dois cortes radiais na face superior (dorsal) da esclera, em direção ao forame escleral do nervo óptico, de modo a delimitar o quadrante dorsal do globo ocular.
   3. Separe a córnea do resto do globo terrestre através de um corte longitudinal de 360° no limbo escleral. Retirar o cristalino e a íris e delimitar o quadrante dorsal da retina utilizando as mesmas demarcações radiais esclerais descritas acima (passo 4.5.2).
   4. Desprender cuidadosamente o tecido retiniano da coroide e esclera, evitando lacerações aleatórias por todo o tecido e eventual perda topográfica de orientação.
   5. Separe o corpo ciliar da ora serrata da retina. Remova cuidadosamente o corpo vítreo restante do copo da retina usando uma pinça curva não dentada mais uma tesoura curva (puxe o vítreo e disseque-o perto da membrana limitante interna) e uma pequena escova.
      NOTA: A remoção do humor vítreo é um passo importante para obter um sinal imuno-histoquímico forte e limpo.
6. Transfira retinas isoladas para uma placa de cultura de 24 poços (uma retina por poço) contendo 1 mL de 1x PBS e mantenha a retina interna voltada para cima.
7. Permeabilizar o tecido lavando 3x por 10 min com um tensoativo não iônico 0,5% diluído em 1x PBS (0,3 mL). Em seguida, manter o tecido agitando suavemente em albumina de soro bovino (BSA) a 5% em surfactante não iônico a 2% e 1x PBS (solução bloqueadora; 0,25 mL) por 60 min à temperatura ambiente.
8. Durante a etapa 4.7, preparar a solução de anticorpos primários Brn3a diluindo 1:200 em tensoactivo não iónico a 0,5% e 1x PBS mais BSA a 5% e armazená-la a 4 °C.
9. Após 60 minutos de bloqueio tecidual, incubar as retinas em 0,2 mL de solução de anticorpos primários a 4 °C por 72 h com agitação suave.
10. Lavar o tecido 3x por 10 min com 1x PBS, em seguida, incubar o tecido por 2 h à temperatura ambiente em 0,2 mL da solução de anticorpos secundários diluída 1:750 em 1x PBS mais 5% BSA.
11. Além disso, incubar o tecido por 10 min em solução de contracoloração nuclear para coloração de núcleos fluorescentes. Concluir a imunohistoquímica com uma etapa final de lavagem com 1x PBS (0,3 mL) repetido 3x.
12. Transfira retinas com o auxílio de duas pequenas escovas para lâminas de microscópio de vidro, mantendo o lado vítreo para cima. Posicionar o quadrante dorsal da retina para cima sobre as lâminas do microscópio (previamente delimitado no passo 4.5.3). Realizar mais dois cortes radiais em direção à cabeça do nervo óptico para delimitar os outros 3 quadrantes (nasal, ventral e temporal).
    Observação : as dimensões de corte não são fixas. Eles não devem ser muito curtos que prejudiquem um achatamento eficiente da retina na lâmina e não devem ser muito longos para que atinja o forame do nervo óptico e separe completamente o quadrante retiniano delimitado do resto do tecido.
13. Finalmente, aplique 0,2 mL de meio de montagem antifade em uma lamínula de vidro e coloque-a na retina plana para análise microscópica do tecido. Para estimar a densidade de RGCs, examine as montagens planas sob um microscópio confocal de epifluorescência usando uma objetiva de 40x/1,3.
14. Para cada quadrante da retina, tire oito fotos: duas da retina central (~0,9 mm do disco óptico), três da retina média (~2,0 mm do disco óptico) e três da retina periférica (~3,7 mm do disco óptico), totalizando 32 fotos por retina. Use o software FIJI para contar células positivas para Brn3a e estimar a densidade celular média.

5. Exame do nervo óptico

1. Após a eutanásia e enucleação do globo ocular (passos 4.1-4.3), remover o segmento proximal da porção intraorbital do nervo óptico (1-2 mm), incluindo parte da porção intraocular, e colocar imediatamente as amostras em frascos/tubos contendo 0,2-0,3 mL de fixador a frio (solução de glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4)) por 2 h.
   NOTA: As seguintes etapas para o processamento do nervo óptico são executadas nos mesmos frascos / tubos da etapa 5.1
2. Lave o material 3x por 5 min com tampão cacodilato de sódio 0,1 M frio. Tecido pós-fixação por 1 h sob agitação suave em solução de tetróxido de ósmio a 1,0% em ferrocianeto de potássio a 0,8% e cloreto de cálcio 5 nM diluído em tampão cacodilato de sódio 0,1 M a 4 °C (0,1-0,2 mL).
3. Lavar fragmentos de nervo óptico 3x por 5 min com tampão cacodilato de sódio 0,1 M frio e, posteriormente, com água destilada fria, 3x por 1 min. Manter o material durante a noite sob agitação suave em uma solução de acetato de uranila a 1,0% em água destilada para coloração a 4 °C (0,1-0,2 mL). Lave os fragmentos 3x com água destilada fria.
4. Desidratar progressivamente o tecido com uma série graduada de acetona (0,5 mL cada), com posterior substituição das seguintes diluições em água destilada: incubação 2x 7 min em acetona gelada a 15%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 30%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 50%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 70%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 80%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 90%; 2x 15 min de incubação em acetona 100% à temperatura ambiente (TR).
5. Realizar 3 etapas de infiltração/incorporação, com posterior substituição das seguintes soluções: 1 parte de resina epóxi: 2 partes de acetona (volume total: 0,5 mL), em TR por 12 h; 1 parte de resina epóxi: 1 parte de acetona (volume total: 0,5 mL), em TR por 12 h; 2 partes de resina epóxi: 1 parte de acetona (volume total: 0,5 mL), em TR por 12 h. Finalmente, infiltrar-se o tecido em resina epóxi pura em RT por 24 h.
6. Retire as amostras do porta-amostras, transfira-as para moldes de incorporação e deixe polimerizar por 48 h a 60 °C. Cortar cortes transversais semifinos (300-400 nm) dos fragmentos do nervo óptico usando um ultramicrótomo, coletá-los e transferi-los para uma lâmina de vidro do microscópio. Cortes coratórios com azul de toluidina e imagem com microscópio óptico em aumento de 100x.
7. Para análise ultraestrutural, realizar cortes transversais ultrafinos (70 nm), coletá-los em grades de cobre e corá-los com acetato de uranila e citrato de chumbo. Examine as seções em um microscópio eletrônico de transmissão.

Resultados

As variáveis quantitativas foram expressas como média ± erro padrão da média (EPM). Com exceção da comparação da dinâmica da PIO entre os grupos ESB e controle (Figura 1F), a análise estatística foi realizada por meio de ANOVA two-way seguida do teste de comparações múltiplas de Sidak. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

A Figura 1 ilustra os passos cirúrgicos do modelo de cauterizaçã...

Discussão

A cauterização do plexo limbal (LPC) é um novo modelo pós-trabecular com a vantagem de ter como alvo estruturas vasculares de fácil acesso, não necessitando de dissecção conjuntival ou^{tenonal 17,28}. Diferentemente do modelo de cauterização de veias vórtices, um renomado modelo de OHT baseado no comprometimento cirúrgico da drenagem venosa coroide, não se espera que a congestão venosa influencie a elevação da PIO no modelo LPC, uma vez que as veias...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Isofar	201	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography	Hansol Medical Co	-	Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon	Novartis Biociências S/A	MS-1.0068.1087	Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride	Vetec	560	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx	Bovie Medical Corporation	AA00	Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin	Syntec do Brasil Ltda	000200-3-000003	Ketamine hydrochloride 10%
DAKO	Dako North America	S3023	Antifade mounting medium
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0487	Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin	Polysciences, Inc.	-	Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16110	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-8042140002	Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab	Icare Finland Oy	TV02 (model number)	Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches	Samsung Electronics Co. Ltd.	S23B550	Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta	Carl Zeiss	-	Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0489	Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K	Nihon Kohden Corporation	-	System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33	Nihon Kohden Corporation	-	Software for electroretinogram signal processing
Optomotry	CerebralMechanics	-	System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide	Electron Microscopy Sciences	20150	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography	Chalgren Enterprises	110-63	Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	12300	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-1.0497.1287	Prednisolone acetate 0.12%
Terolac	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0497.1286	Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina	Laboratórios Pfizer Ltda	MS-1.0216.0024	Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL	Reichert Technologies	230635	Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	Non-ionic surfactant
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin	Syntec do Brasil Ltda	7899	Xylazine hydrochloride 2%
	Carl Zeiss	-	Stereo microscope for surgery and retinal dissection