Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein neuartiges Modell der glaukomatösen Neurodegeneration zu charakterisieren, das auf einer thermischen 360°-Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus basiert und eine subakute okuläre Hypertonie induziert.

Zusammenfassung

Das Glaukom, die zweithäufigste Erblindungsursache weltweit, ist eine heterogene Gruppe von Augenerkrankungen, die durch eine strukturelle Schädigung des Sehnervs und eine Degeneration der retinalen Ganglienzellen (RGC) gekennzeichnet sind, die zu einer Sehstörung führt, indem die Übertragung visueller Informationen vom Auge zum Gehirn unterbrochen wird. Ein erhöhter Augeninnendruck ist der wichtigste Risikofaktor; Daher wurden mehrere Modelle der okulären Hypertonie bei Nagetieren entweder durch genetische oder experimentelle Ansätze entwickelt, um die Ursachen und Auswirkungen der Krankheit zu untersuchen. Unter diesen wurden einige Einschränkungen berichtet, wie z. B. chirurgische Invasivität, unzureichende funktionelle Beurteilung, die Notwendigkeit einer umfangreichen Ausbildung und eine sehr variable Ausdehnung der Netzhautschäden. Die vorliegende Arbeit charakterisiert eine einfache, kostengünstige und effiziente Methode zur Induktion von okulärer Hypertonie bei Nagetieren, die auf der Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei niedriger Temperatur, einer Hauptkomponente der Kammerwasserdrainage, basiert. Das neue Modell bietet eine technisch einfache, nicht-invasive und reproduzierbare subakute okuläre Hypertonie, die mit einer progressiven RGC und einer Degeneration des Sehnervs einhergeht, sowie eine einzigartige postoperative klinische Genesungsrate, die in vivo funktionelle Studien sowohl mit elektrophysiologischen als auch mit verhaltenstherapeutischen Methoden ermöglicht.

Einleitung

In der medizinischen Literatur wird das Glaukom als eine heterogene Gruppe von Optikusneuropathien verstanden, die durch eine fortschreitende Degeneration von retinalen Ganglienzellen (RGCs), Dendriten, Soma und Axonen gekennzeichnet sind, was zu einem strukturellen Schröpfen (Exkavation) der Papille und einer funktionellen Verschlechterung des Sehnervs führt, was in unkontrollierten Fällen zu einer Amaurose führt, indem die Übertragung visueller Informationen vom Auge zum Gehirn unterbrochen wird¹. Das Glaukom ist derzeit weltweit die häufigste Ursache für irreversible Erblindung und wird im Jahr 2040 voraussichtlich etwa 111,8 Millionen Menschen erreichen², was die Lebensqualität der Patienten stark beeinträchtigt und zu erheblichen sozioökonomischen Problemen führt³.

Ein erhöhter Augeninnendruck (IOD) ist einer der wichtigsten und einzigen modifizierbaren Risikofaktoren für die Entstehung und das Fortschreiten des Glaukoms. Unter den verschiedenen Arten von Glaukom sind alle, mit Ausnahme des Normaldruckglaukoms (NTG), mit einem erhöhten Augeninnendruck zu einem bestimmten Zeitpunkt in der klinischen Geschichte der Krankheit verbunden. Trotz bemerkenswerter klinischer und chirurgischer Fortschritte, um den Augeninnendruck zu bekämpfen und das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen oder zu stoppen, verlieren Patienten aufgrund eines Glaukoms immer noch ihr Augenlicht ^4,5. Daher ist ein gründliches Verständnis der komplexen und multifaktoriellen Pathophysiologie dieser Krankheit unerlässlich für die Entwicklung wirksamerer Behandlungen, insbesondere zur Neuroprotektion von RGCs.

Unter einer Vielzahl von experimentellen Ansätzen zum Verständnis von Krankheitsmechanismen ähneln Tiermodelle, die auf okulärer Hypertonie (OHT) basieren, am ehesten dem menschlichen Glaukom. Nagetiermodelle sind besonders nützlich, da sie kostengünstig sind, einfach zu handhaben sind, genetisch manipuliert werden können, eine kurze Lebensdauer haben und anatomische und physiologische Merkmale aufweisen, die mit denen des Menschen vergleichbar sind, wie z. B. Kammerwasserproduktion und -drainage 6,7,8,9,10,11,12,13 . Zu den derzeit verwendeten Modellen gehören die Sklerose des Trabekelwerks nach Injektion von hypertoner Kochsalzlösung in episklerale Venen¹⁴, die intrakamerale Injektion von Mikrokügelchen 15 oder viskoelastischen Substanzen 16, die Kauterisierung von Wirbelvenen¹⁷, die Photokoagulation des Trabekelwerks mit dem Argonlaser 18, die zirkumlimbale Naht ¹⁹ und die Verwendung eines transgenen Modells der altersabhängigen OHT (DBA/2J-Mäuse)⁸. Invasivität, postoperative Trübung der Hornhaut, Störung des vorderen Augenabschnitts, umfangreiche Lernkurven, teure Geräte und stark schwankende postoperative IOPs gehören jedoch zu den berichteten Fallstricken, die mit den aktuellen Modellen verbunden sind, so dass die Entwicklung eines alternativen OHT-Modells erforderlich ist, um diese Probleme zu überwinden^20,21,22.

Das vorliegende Protokoll formalisiert ein neuartiges chirurgisches Verfahren zur Induktion von OHT als Stellvertreter für das Glaukom, basierend auf der Kauterisierung des Limbusplexus (LPC) bei Nagetieren²³. Dies ist ein einfaches, reproduzierbares, zugängliches und nicht-invasives Modell, das eine hohe Effizienz und geringe Variabilität der IOD-Erhöhung bietet, verbunden mit einer einzigartig hohen Rate der vollständigen klinischen Genesung, und somit eine In-vivo-Funktionsbewertung bei einer reduzierten Anzahl von Tieren ermöglicht, die in jedem Experiment verwendet werden. Die Operationstechnik induziert eine subakute OHT mit einer allmählichen Rückkehr zum Ausgangswert innerhalb weniger Tage, was den hypertensiven Anfall beim akuten Winkelverschlussglaukom modelliert. Darüber hinaus folgt auf die IOD-Erholung im Modell eine kontinuierliche glaukomatöse Neurodegeneration, die für zukünftige mechanistische Studien der sekundären Degeneration von RGCs nützlich ist, die in mehreren Fällen von humanem Glaukom trotz adäquater Kontrolle des IOD auftritt.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) durchgeführt und von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in wissenschaftlichen Experimenten des Zentrums für Gesundheitswissenschaften der Bundesuniversität Rio de Janeiro genehmigt (Protokoll 083/17). In der vorliegenden Arbeit wurden Lister Hooded Ratten beiderlei Geschlechts im Alter von 2-3 Monaten und mit einem Gewicht von 180-320 g verwendet. Das Verfahren kann jedoch an verschiedene Rattenstämme unterschiedlichen Alters angepasst werden.

1. Okuläre Hypertonie-Operation und klinische Nachsorge

1. Haustiere in einer Umgebung mit kontrollierter Temperatur und 12-stündigem Hell-Dunkel-Zyklus (6 Uhr: Licht an/ 18 Uhr: Licht aus) mit pelletiertem gammabestrahltem Standardfutter (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brasilien) und Wasser (Dreifachfilter, mit ungiftiger Aktivkohle) nach Belieben verfügbar.
2. Bereiten Sie eine Anästhesie-Cocktailmischung vor, die aus drei Teilen 10%igem Ketaminhydrochlorid und einem Teil 2%igem Xylazinhydrochlorid (Verdünnungsmittel: steriles Wasser) besteht.
3. Das Tier wird vorsichtig zurückgehalten, indem die Rückenhaut festgehalten wird, und durch intraperitoneale Verabreichung von 1 μl/g Körpergewicht der Mischung (Ketamin: 75 mg/kg; Xylazin: 5 mg/kg) wird eine Anästhesie eingeleitet. Überprüfen Sie nach ca. 5 Minuten die richtige Anästhesie, indem Sie eine Zehenkneifreaktion durchführen.
4. Topische Betäubung beider Augenoberflächen durch Instillation von Proxymetacainhydrochlorid 0,5% Augentropfen. Warten Sie 30-60 Sekunden und entfernen Sie die restliche Lösung von der vorderen Seite der Kugel, indem Sie die nasale oder laterale bulbäre Bindehaut vorsichtig mit einem kleinen sterilen Wattestäbchen berühren.
5. Messen Sie den Ausgangswert sowohl der experimentellen als auch der kontralateralen Kontrollaugen, indem Sie das Tier in eine ventrale Dekubitusposition auf die Tischplatte legen, so dass die Hornhautoberfläche für die Spitze des Tonometers leicht zugänglich ist.
6. Verwenden Sie entweder ein Applanations- oder ein Rebound-Handtonometer (Abbildung 1A). Positionieren Sie die Tonometerspitze so, dass sie die zentrale Hornhautzone senkrecht leicht berührt. Erfassen und mitteln Sie 3-5 zuverlässige, maschinell generierte Durchschnittswerte. Jeder Mittelwert wird vom Gerät nach sechs erfolgreichen Einzelmessungen automatisch berechnet.
   1. Beladen Sie das Zugstufentonometer mit einer Sonde und drücken Sie einmal die Messtaste, um es einzuschalten, während Sie die Spitze des Geräts nach oben legen, um ein Herunterfallen der Sonde zu vermeiden. Nach dem Einschalten zeigt das Display 00 an, um anzuzeigen, dass das Gerät messbereit ist.
   2. Positionieren Sie das Gerät mit der Spitze der Sonde in einem Abstand von 1-4 mm von der Hornhaut und erfassen Sie die Messwerte durch schnelles und vorsichtiges Drücken der Messtaste, ohne das Gerät zu bewegen. Jede erfolgreiche Messung wird durch einen kurzen Piepton identifiziert und nach sechsmal wird der Mittelwert auf dem Bildschirm des Geräts angezeigt.
      HINWEIS: Trotz langjähriger Erfahrung mit Applanationstonometern empfehlen die Autoren zur Optimierung des gesamten Verfahrens die Verwendung eines Rückpralltonometers, das eine einfachere Erfassung einer zuverlässigen IOD-Messung ermöglicht.
7. Legen Sie das Tier unter ein Stereomikroskop in eine leichte seitliche Dekubitusposition und planen Sie die Operation sorgfältig, indem Sie das Versuchsauge mit 40-facher Vergrößerung untersuchen. Vergessen Sie nicht, das kontralaterale Kontrollauge während des Eingriffs befeuchtet zu halten, indem Sie einen Tropfen Carmellose-Natrium oder Natriumhyaluronat einträufeln.
8. Schieben Sie den experimentellen Augapfel mit Hilfe einer gekrümmten Pinzette vorsichtig nach vorne, um das Gefäßsystem freizulegen, das 360° des Limbus¹³ umgibt. Auf der anderen Seite werden die Gefäße rund um die Hornhaut vorsichtig mit einem Augenkauter bei niedriger Temperatur (1.300 °F; Bovie Medical, USA) (Abbildung 1B-E).
   HINWEIS: Der erwähnte Kauter hat eine runde Spitze, die das limbale Gefäßsystem in Längsrichtung berühren sollte.
9. Achten Sie darauf, die Hornhautperipherie nicht zu veröden, da dies zu einer postoperativen Hornhauttrübung führen kann, die eine In-vivo-Beurteilung der Netzhautfunktion ausschließt.
10. Beobachten Sie das Auftreten kleiner kreisförmiger Kauterisationsspuren am Sklerallimbus, die Verödung des limbalen Gefäßsystems und die Pupillenerweiterung im operierten Auge, die Anzeichen für einen erfolgreichen chirurgischen Eingriff sind.
    HINWEIS: Da das limbale Gefäßsystem von Ratten und Mäusen anatomisch ähnlich ist^13,24 und der verwendete Kauter eine sanfte kleine Spitze hat^, kann dieses Protokoll auch für das Mausauge ohne Anpassung funktionieren.
11. Überprüfen Sie nach der Operation den unmittelbaren postoperativen Augeninnendruck in beiden Augen, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
12. Tragen Sie einen Tropfen ophthalmisches Prednisolonacetat (1,2 mg/ml) auf und halten Sie diesen etwa 40 s lang in Kontakt mit der vorderen Oberfläche des Versuchsauges, dann ersetzen Sie ihn durch eine augenärztliche Salbe mit Antibiotika (Oxytetracyclinhydrochlorid 30 mg/g plus Polymyxin B 10.000 U/g oder Ciprofloxacin 3,5 mg/g). Führen Sie eine intramuskuläre Injektion von Tramadolhydrochlorid (Einzeldosis; 2 mg/kg) durch, um Schmerzen nach dem Eingriff zu vermeiden.
13. Verfolgen Sie die Genesung des Tieres aus der Narkose genau, vorzugsweise in einer warmen Umgebung wie einem Heizkissen oder in seinem Käfig mit geeigneter Einstreu. Achten Sie auf das Atemmuster.
14. Führen Sie eine tägliche klinische Nachuntersuchung des experimentellen Auges mit topischen Medikamenten durch, die aus einem nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAID, z. B. Ketorolac-Trometamol 0,5% Augentropfen) und einer antibiotischen Salbe (vorzugsweise die gleiche, die unmittelbar nach der Operation verwendet wird) bestehen.
    HINWEIS: Die Verwendung von NSAID anstelle von steroidalen entzündungshemmenden Augentropfen wird empfohlen, da letztere OHT induzieren können und regelmäßig bei Glukokortikoid-induzierten Glaukommodellen bei Nagetieren angewendet werden.
    1. Unter leichter Sedierung (Ketamin: 18,75 mg/kg; Xylazin: 1,25 mg/kg) wird der Augeninnendruck vorzugsweise zur gleichen Tageszeit gemessen, um eine Verzerrung aufgrund physiologischer zirkadianer IOD-Schwankungen zu vermeiden.
    2. Achten Sie bei der Augenuntersuchung auf seltene klinische Interzidive wie Hyphäm, Hornhautfibrose oder Skleraausdünnung im Zusammenhang mit Aderhautprolaps. Hornhautödeme, Chemose und Bindehauthyperämie sind häufig, aber vorübergehend.
    3. Beachten Sie die vollständige klinische Genesung etwa am 7. postoperativen Tag. Die limbale Revaskularisation beginnt in der Regel in den ersten zwei Tagen nach der Operation, im Einklang mit der erwarteten allmählichen Rückkehr des Augeninnendrucks zum Ausgangswert.

2. Analyse der optomotorischen Reaktion (OMR)

HINWEIS: Für dieses Verfahren wurde ein spezielles System^{verwendet 25}.

1. Ordnen Sie vier Computermonitore in einem Viereck an, die eine Arena mit einer Plattform in der Mitte begrenzen. Auf den Monitoren wird das Bild eines virtuellen Zylinders mit vertikal ausgerichteten Sinusgittern (abwechselnd schwarze und weiße Streifen) angezeigt, der sich mit einer festen Geschwindigkeit (12 Grad/s) und einem festen Kontrast (100 %) um die Plattform dreht.
2. Positionieren Sie eine Videokamera über der Plattform, damit der Versuchsleiter die Bewegungen des Tieres beobachten kann. Führen Sie den Test unter photopischen Bedingungen durch und stellen Sie die Software bevorzugt auf manuellen/separaten Modus ein, um jedes Auge separat zu bewerten.
3. Lassen Sie die Tiere ca. 2 Minuten auf der Plattform gewöhnen. Halten Sie den roten Fadenkreuz-Cursor auf dem Videobild zwischen den Augen des sich frei bewegenden Tieres, da er die Mitte des virtuellen Zylinders anzeigt (Abbildung 1G)²⁵.
4. Beobachten Sie die OMR, die aus einer reflexiven Verfolgung von Kopf und Hals des Tieres besteht, die durch die rotierenden Gitter hervorgerufen wird. Testen Sie die linke und die rechte Sehbahn, indem Sie die Richtungen der Sinuswellengitter im Uhrzeigersinn bzw. gegen den Uhrzeigersinn drehen.
   1. Präsentieren Sie zunächst einen Stimulus mit niedriger Ortsfrequenz (0,042 Zyklen/Grad). Erhöhen Sie dann die Frequenz progressiv, bis die Tracking-Bewegung nicht mehr bemerkt wird. Die höchste Ortsfrequenz, in der eine deutliche OMR hervorgerufen wird, entspricht der Schwellenortfrequenz des ausgewerteten Auges.
   2. Wenn das Tier während der Untersuchung von der Plattform fällt, bringen Sie es sofort auf die Plattform zurück und setzen Sie den Test fort.

3. Aufnahme des Muster-Elektroretinogramms (PERG)

HINWEIS: Das Elektroretinogramm wurde mit einem speziellen System zur Signalverarbeitung und zugehöriger Software zur Speicherung und Analyse der Wellenformen aufgezeichnet.

1. Die Tiere werden durch intramuskuläre Injektion von Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid (75 mg/kg bzw. 5 mg/kg) tief betäubt. Die Tiefenanästhesie (Operationsebene) verringert die Wahrscheinlichkeit von Artefakten durch unwillkürliche Muskelbewegungen oder alternative Geräuschquellen während der Untersuchung. Überprüfen Sie, ob die Anästhesie richtig ist, indem Sie eine Zehenkneifreaktion durchführen.
   ANMERKUNG: Die erwähnten Anästhetika beeinflussen nicht die Amplitude der Reaktion²⁶. Da eine kleine Nadel, die in die Hornhaut eingeführt wurde, als aktive Elektrode verwendet wurde, wird die intramuskuläre Anästhesie der intraperitonealen vorgezogen, da sie leichter zu injizieren ist, falls die Ratte eine Auffrischungsdosis (1/2 der ursprünglichen Dosis) benötigt, mit geringeren Chancen, die Elektrodenposition zu verändern, was zu reproduzierbareren Aufzeichnungen während des gesamten Experiments führt. die bis zu 60 Minuten dauern kann.
2. Betäuben Sie die Hornhaut topisch mit einem Tropfen Proxymetacainhydrochlorid 0,5% und halten Sie das Auge mit ophthalmologischen Gleitmitteln befeuchtet.
3. Führen Sie die aktive Elektrode (Edelstahlnadel 0,25 mm × 15 mm) vorsichtig am Schläfenumfang der Hornhaut ein. Zusätzlich werden die Referenz- und Masseelektroden (Edelstahlnadel 0,4 mm × 37 mm) in das Unterhautgewebe des ipsilateralen Schläfenkanthus bzw. in eine der Hintergliedmaßen eingeführt (Abbildung 1I).
4. Für PERG stellen Sie den Stimulus auf ein schwarz-weißes Reserve-Schachbrett ein, das sich mit 15 Umkehrungen/s bei konstanter mittlerer Leuchtdichte (250 cd/m2) abwechselt. Stellen Sie den Bandpassfilter auf 1 Hz bis 100 Hz ein.
   ANMERKUNG: Der schnell umkehrende Stimulus erzeugt den stationären PERG, eine stabile und reproduzierbare Sinuskurve, die die Wellenkomponente sammelt, die am wahrscheinlichsten mit der bioelektrischen Reaktion von RGC verbunden ist: die NII-Ablenkung des transienten PERG.
5. Positionieren Sie das Tier in einem Abstand von 20 cm zum Stimulusbildschirm (LCD-Monitor 0,58 m; Abbildung 1I), überwachen Sie die Signalbasislinie und starten Sie die PENG-Erfassung, indem Sie die Analysetaste am Erfassungssystem drücken.
6. Halten Sie die Tiere während des Eingriffs an das Umgebungslicht angepasst (weißes Licht von ~140 Lux). Hier wurden sechs unterschiedliche Ortsfrequenzen (in Zyklen pro Grad: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) in zufälliger Reihenfolge dargestellt.
   HINWEIS: Die für die Signalverarbeitung verwendete Software führt automatisch die Mittelwertbildung durch. Der Durchschnitt von 200-300 Einzelwellen wurde als ausreichend angesehen, um sich vom Rauschen abzuheben und die Wellenamplitude zu analysieren.

4. Quantifizierung von retinalen Ganglienzellen, Somas

ANMERKUNG: Das folgende Verfahren dient zur Quantifizierung von RGC-Somas und basiert auf der immunhistochemischen Färbung von retinalen Flat-Mounts mit einem Antikörper gegen das hirnspezifische Homöobox/POU-Domänenprotein 3A (Brn3a).

1. Versuchstiere werden einer Euthanasie der Gebärmutterhalsverrenkung unterzogen, der eine Kohlendioxid-Inhalation vorausgeht, um Bewusstlosigkeit herbeizuführen.
2. Unmittelbar nach der Euthanasie werden beide Augen unter einem Stereomikroskop mit einer Zahnzange und einer gebogenen Schere präpariert.
3. Führen Sie eine sorgfältige Dissektion durch, so dass sowohl der distale Teil der extraokularen Muskeln als auch der Karunkel mit der Kugel verbunden bleiben, da sie wichtige Orientierungspunkte für die topografische Orientierung der Netzhaut sind (beschrieben in Schritt 4.5). Versuchen Sie, einen Abschnitt des Sehnervs, der mit dem Globus verbunden ist, so lange wie möglich für zukünftige Analysen aufzubewahren.
4. Nach der Enukleation werden die Augen in eine 1-ml-Lösung mit 4 % Paraformaldehyd (4 % PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (PBS) gelegt und 24 Stunden lang aufbewahrt, um eine ordnungsgemäße chemische Fixierung zu gewährleisten.
5. Trennen Sie die Netzhaut vom Rest des Augengewebes.
   1. Legen Sie den Augapfel unter einem Präpariermikroskop in eine Petrischale, die mit 1x PBS bedeckt ist, und achten Sie auf wichtige Orientierungspunkte wie Nasenkarunkel, Aderhautfissuren und Skleraabdrücke von Wirbelvenen für die richtige topografische Orientierung²⁷.
   2. Die vordere Augenkammer wird von der zentralen Hornhaut aus mit einer Zahnzange und einer gebogenen Schere (Westcott) durchdrungen. Machen Sie zwei radiale Schnitte zum oberen (dorsalen) Aspekt der Sklera in Richtung des Foramen skleralis des Sehnervs, um den dorsalen Quadranten des Augapfels zu begrenzen.
   3. Trennen Sie die Hornhaut vom Rest des Globus durch einen 360°-Längsschnitt am Sklerallimbus. Entfernen Sie die Linse und die Iris und begrenzen Sie den dorsalen Netzhautquadranten mit den oben beschriebenen radialen Abgrenzungen der Sklera (Schritt 4.5.2).
   4. Lösen Sie vorsichtig das Netzhautgewebe von der Aderhaut und der Sklera und vermeiden Sie sowohl zufällige Risse im gesamten Gewebe als auch einen eventuellen topografischen Orientierungsverlust.
   5. Trennen Sie den Ziliarkörper von der retinalen Ora serrata. Entfernen Sie vorsichtig den verbliebenen Glaskörper aus der Netzhautpfanne, indem Sie sowohl eine gebogene, nicht gezahnte Pinzette als auch eine gebogene Schere (Glaskörper ziehen und in der Nähe der inneren Begrenzungsmembran präparieren) und eine kleine Bürste verwenden.
      HINWEIS: Die Entfernung des Glaskörpers ist ein wichtiger Schritt, um ein starkes und sauberes immunhistochemisches Signal zu erhalten.
6. Übertragen Sie isolierte Netzhäute in eine 24-Well-Kulturplatte (eine Netzhaut pro Well), die 1 ml 1x PBS enthält, und halten Sie die innere Netzhaut nach oben.
7. Permeabilisieren Sie das Gewebe, indem Sie das Gewebe 3x für 10 Minuten mit einem nichtionischen Tensid 0,5% verdünnt in 1x PBS (0,3 ml) waschen. Halten Sie dann das Gewebe vorsichtig geschüttelt in 5 % Rinderserumalbumin (BSA), in 2 % nichtionischem Tensid und 1x PBS (Blockierungslösung; 0,25 ml) für 60 Minuten bei Raumtemperatur.
8. In Schritt 4.7 wird die Brn3a-Primärantikörperlösung durch Verdünnung von 0,5 % und 1x PBS plus 5 % BSA im Verhältnis 1:200 in nichtionisches Tensid hergestellt und bei 4 °C gelagert.
9. Nach 60 Minuten Gewebeblockierung werden die Netzhäute in 0,2 ml primärer Antikörperlösung bei 4 °C für 72 Stunden unter leichtem Schütteln inkubiert.
10. Waschen Sie das Gewebe 3x für 10 min mit 1x PBS, dann inkubieren Sie das Gewebe für 2 h bei Raumtemperatur in 0,2 mL der Sekundärantikörperlösung, verdünnt 1:750 in 1x PBS plus 5% BSA.
11. Des Weiteren wird das Gewebe 10 Minuten lang in einer nuklearen Gegenfärbungslösung für die Färbung fluoreszierender Kerne inkubiert. Beenden Sie die Immunhistochemie mit einem abschließenden Waschschritt mit 1x PBS (0,3 ml), der 3x wiederholt wird.
12. Übertragen Sie die Netzhaut mit Hilfe von zwei kleinen Pinseln auf Objektträger aus Glas, wobei die Glaskörperseite nach oben gerichtet bleibt. Positionieren Sie den dorsalen Netzhautquadranten nach oben auf den Objektträgern (zuvor in Schritt 4.5.3 abgegrenzt). Machen Sie zwei weitere radiale Schnitte in Richtung des Sehnervenkopfes, um die anderen 3 Quadranten (nasal, ventral und temporal) abzugrenzen.
    HINWEIS: Die Schnittmaße sind nicht festgelegt. Sie sollten nicht zu kurz sein, um eine effiziente Abflachung der Netzhaut auf dem Objektträger zu beeinträchtigen und nicht zu lang, damit sie das Foramen des Sehnervs erreichen und den abgegrenzten Netzhautquadranten vollständig vom restlichen Gewebe trennen.
13. Tragen Sie zum Schluss 0,2 ml Antifade-Eindeckmedium auf ein Deckglas auf und legen Sie dieses zur gewebemikroskopischen Analyse auf die flach montierte Netzhaut. Um die RGC-Dichte abzuschätzen, untersuchen Sie die flachen Montierungen unter einem konfokalen Epifluoreszenzmikroskop mit einem 40x/1,3-Objektiv.
14. Machen Sie für jeden Quadranten der Netzhaut acht Fotos: zwei von der zentralen Netzhaut (~0,9 mm von der Papille), drei von der mittleren Netzhaut (~2,0 mm von der Papille) und drei von der peripheren Netzhaut (~3,7 mm von der Papille), insgesamt 32 Fotos pro Netzhaut. Verwenden Sie die FIJI-Software, um Brn3a-positive Zellen zu zählen und die mittlere Zelldichte zu schätzen.

5. Untersuchung des Sehnervs

1. Nach der Euthanasie und der Enukleation des Augapfels (Schritte 4.1-4.3) wird das proximale Segment des intraorbitalen Teils des Sehnervs (1-2 mm), einschließlich eines Teils des intraokularen Anteils, entfernt und die Proben sofort 2 h lang in Fläschchen/Röhrchen mit 0,2-0,3 ml kaltem Fixiermittel (2,5 % Glutaraldehydlösung in 0,1 M Natriumkacodylatpuffer (pH 7,4)) gegeben.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte für die Verarbeitung des Sehnervs werden in denselben Fläschchen/Röhrchen aus Schritt 5.1 durchgeführt
2. Waschen Sie das Material 3x für 5 min mit kaltem 0,1 M Natriumcacodylat-Puffer. Nach der Fixierung des Gewebes für 1 Stunde unter leichtem Schütteln in einer Lösung von 1,0 % Osmiumtetroxid in 0,8 % Kaliumferrocyanid und 5 nM Calciumchlorid, verdünnt in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bei 4 °C (0,1-0,2 ml).
3. Sehnervenfragmente 3x für 5 min mit kaltem 0,1 M Natriumcacodylatpuffer und anschließend mit kaltem destilliertem Wasser 3x für 1 min waschen. Bewahren Sie das Material über Nacht unter leichtem Schütteln in einer Lösung aus 1,0%igem Uranylacetat in destilliertem Wasser auf, um es bei 4 °C (0,1-0,2 ml) zu färben. Bruchstücke 3x mit kaltem destilliertem Wasser waschen.
4. Das Gewebe wird schrittweise mit einer abgestuften Acetonreihe (je 0,5 ml) dehydriert, wobei anschließend die folgenden Verdünnungen in destilliertem Wasser ersetzt werden: 2x 7 min Inkubation in 15% eiskaltem Aceton; 2x 7 min Inkubation in 30% eiskaltem Aceton; 2x 7 min Inkubation in 50% eiskaltem Aceton; 2x 7 min Inkubation in 70% eiskaltem Aceton; 2x 7 min Inkubation in 80% eiskaltem Aceton; 2x 7 min Inkubation in 90% eiskaltem Aceton; 2x 15 min Inkubation in 100% Aceton bei Raumtemperatur (RT).
5. Führen Sie 3 Infiltrations-/Einbettungsschritte durch, mit anschließendem Austausch der folgenden Lösungen: 1 Teil Epoxidharz: 2 Teile Aceton (Gesamtvolumen: 0,5 ml), bei RT für 12 h; 1 Teil Epoxidharz: 1 Teil Aceton (Gesamtvolumen: 0,5 ml), bei RT für 12 h; 2 Teile Epoxidharz: 1 Teil Aceton (Gesamtvolumen: 0,5 ml), bei RT für 12 h. Zum Schluss wird das Gewebe 24 h lang in reinem Epoxidharz bei RT infiltriert.
6. Entnehmen Sie die Proben aus dem Probenträger, überführen Sie sie in Einbettformen und lassen Sie sie 48 Stunden lang bei 60 °C polymerisieren. Mit einem Ultramikrotom werden transversale halbdünne Schnitte (300-400 nm) der Sehnervenfragmente geschnitten, gesammelt und auf einen Objektträger übertragen. Schnitte mit Toluidinblau färben und mit dem optischen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung abbilden.
7. Für die ultrastrukturelle Analyse werden ultradünne Querschnitte (70 nm) durchgeführt, auf Kupfergittern gesammelt und mit Uranylacetat und Bleicitrat angefärbt. Untersuchen Sie die Schnitte in einem Transmissionselektronenmikroskop.

Ergebnisse

Die quantitativen Variablen werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt. Mit Ausnahme des Vergleichs der IOD-Dynamik zwischen OHT- und Kontrollgruppen (Abbildung 1F) wurde die statistische Analyse mittels Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Abbildung 1 zeigt die chirurgischen Schritte des Modells der Full...

Diskussion

Die Limbus-Plexus-Kauterisation (LPC) ist ein neuartiges posttrabekuläres Modell mit dem Vorteil, dass es auf leicht zugängliche Gefäßstrukturen abzielt, die keine Konjunktival- oder Zapfendissektion erfordern^17,28. Anders als beim Vortex-Venen-Kauterisierungsmodell, einem renommierten OHT-Modell, das auf der chirurgischen Beeinträchtigung der Aderhautvenendrainage basiert, ist nicht zu erwarten, dass eine venöse Stauung den IOD-Anstieg im LPC-Modell beeinf...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Isofar	201	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography	Hansol Medical Co	-	Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon	Novartis Biociências S/A	MS-1.0068.1087	Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride	Vetec	560	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx	Bovie Medical Corporation	AA00	Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin	Syntec do Brasil Ltda	000200-3-000003	Ketamine hydrochloride 10%
DAKO	Dako North America	S3023	Antifade mounting medium
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0487	Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin	Polysciences, Inc.	-	Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16110	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-8042140002	Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab	Icare Finland Oy	TV02 (model number)	Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches	Samsung Electronics Co. Ltd.	S23B550	Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta	Carl Zeiss	-	Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0489	Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K	Nihon Kohden Corporation	-	System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33	Nihon Kohden Corporation	-	Software for electroretinogram signal processing
Optomotry	CerebralMechanics	-	System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide	Electron Microscopy Sciences	20150	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography	Chalgren Enterprises	110-63	Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	12300	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-1.0497.1287	Prednisolone acetate 0.12%
Terolac	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0497.1286	Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina	Laboratórios Pfizer Ltda	MS-1.0216.0024	Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL	Reichert Technologies	230635	Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	Non-ionic surfactant
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin	Syntec do Brasil Ltda	7899	Xylazine hydrochloride 2%
	Carl Zeiss	-	Stereo microscope for surgery and retinal dissection