Полное прижигание лимбального сосудистого сплетения при хирургически индуцированной глаукоме у грызунов

Резюме

Целью данного протокола является характеристика новой модели глаукоматозной нейродегенерации, основанной на термическом прижигании лимбального сосудистого сплетения на 360°, индуцирующем подострую глазную гипертензию.

Аннотация

Глаукома, вторая по значимости причина слепоты во всем мире, представляет собой гетерогенную группу глазных заболеваний, характеризующихся структурным повреждением зрительного нерва и дегенерацией ганглиозных клеток сетчатки (RGC), что приводит к зрительной дисфункции из-за прерывания передачи визуальной информации от глаза к мозгу. Повышенное внутриглазное давление является наиболее важным фактором риска; Таким образом, было разработано несколько моделей глазной гипертензии у грызунов с помощью генетических или экспериментальных подходов для изучения причин и последствий заболевания. Среди них были выявлены некоторые ограничения, такие как хирургическая инвазивность, неадекватная функциональная оценка, необходимость интенсивной подготовки и очень вариабельная протяженность повреждения сетчатки. В настоящей работе охарактеризован простой, малозатратный и эффективный метод индуцирования глазной гипертензии у грызунов, основанный на низкотемпературном прижигании по всему кругу лимбального сосудистого сплетения, являющегося основным компонентом дренажа водянистой влаги. Новая модель обеспечивает технически простую, неинвазивную и воспроизводимую подострую глазную гипертензию, связанную с прогрессирующей РГК и дегенерацией зрительного нерва, а также уникальную скорость послеоперационного клинического восстановления, позволяющую проводить функциональные исследования in vivo как электрофизиологическими, так и поведенческими методами.

Введение

В медицинской литературе глаукома понимается как гетерогенная группа оптических невропатий, характеризующихся прогрессирующей дегенерацией ганглиозных клеток сетчатки (РГК), дендритов, сомы и аксонов, что приводит к структурному купированию (выкапыванию) диска зрительного нерва и функциональному ухудшению зрительного нерва, приводящему в неконтролируемых случаях к амаврозу из-за прерывания передачи зрительной информации от глаза к мозгу¹. В настоящее время глаукома является наиболее распространенной причиной необратимой слепоты во всем мире, и, по прогнозам, к 2040 г. она охватит примерно 111,8 миллиона^{человек2,} что оказывает глубокое влияние на качество жизни пациентов (КЖ) и приводит к серьезным социально-экономическим^{проблемам3}.

Повышенное внутриглазное давление (ВГД) является одним из наиболее важных и единственно модифицируемых факторов риска развития и прогрессирования глаукомы. Среди множества типов глаукомы все, за исключением глаукомы нормального напряжения (НТГ), связаны с повышенным ВГД в какой-то момент клинической истории заболевания. Несмотря на выдающиеся клинические и хирургические достижения в области воздействия на ВГД и замедления или остановки прогрессирования заболевания, пациенты по-прежнему теряют зрение из-за глаукомы ^4,5. Поэтому глубокое понимание сложной и многофакторной патофизиологии этого заболевания является обязательным условием для разработки более эффективных методов лечения, особенно для обеспечения нейропротекции РГК.

Среди многообразия экспериментальных подходов к пониманию механизмов заболевания животные модели, основанные на глазной гипертензии (ОГТ), наиболее близки к глаукоме человека. Модели грызунов особенно полезны, поскольку они недороги, просты в обращении, могут быть генетически модифицированы, имеют короткую продолжительность жизни и обладают анатомическими и физиологическими особенностями глаза, сопоставимыми с человеческими, такими как выработка водянистой влаги и дренаж 6,7,8,9,10,11,12,13 . В настоящее время используются такие модели, как склероз трабекулярной сетки после введения гипертонического физиологического раствора в эписклеральные вены¹⁴, внутрикамерная инъекция микрогранул¹⁵ или вязкоэластичных веществ 16, прижигание вихревых вен 17, фотокоагуляция трабекулярной сетки аргоновым лазером 18, окололимбальный шов ¹⁹ и использование трансгенной модели возрастной ОГТ (мыши DBA/2J)8. Тем не менее, инвазивность, послеоперационное помутнение роговицы, разрушение переднего сегмента, обширные кривые обучения, дорогостоящее оборудование и высокая вариабельность послеоперационного ВГД являются одними из немногих зарегистрированных подводных камней, связанных с существующими моделями, что делает разработку альтернативной модели ГВТ требованием для преодоления этих проблем^20,21,22.

Настоящий протокол формализует новую хирургическую процедуру для индуцирования ГТ в качестве прокси глаукомы, основанную на прижигании лимбального сплетения (ЛПК) у грызунов²³. Это простая, воспроизводимая, доступная и неинвазивная модель, которая обеспечивает высокую эффективность и низкую вариабельность повышения ВГД, связанную с уникально высокой скоростью полного клинического выздоровления, что обеспечивает функциональную оценку in vivo на меньшем количестве животных, используемых в каждом эксперименте. Хирургический метод индуцирует подострую ГТ с постепенным возвращением к исходному уровню через несколько дней, что моделирует гипертонический приступ, наблюдаемый при острой закрытоугольной глаукоме. Кроме того, восстановление ВГД в модели сопровождается непрерывной глаукоматозной нейродегенерацией, что полезно для будущих механистических исследований вторичной дегенерации РГК, которая происходит в нескольких случаях глаукомы человека, несмотря на адекватный контроль ВГД.

протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с Положением об использовании животных в офтальмологических и визуальных исследованиях Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) и одобрены Комитетом по этике по использованию животных в научных экспериментах Центра медицинских наук Федерального университета Рио-де-Жанейро (протокол 083/17). В настоящей работе использовались крысы Lister Hooded обоего пола в возрасте 2-3 месяцев и массой 180-320 г. Тем не менее, процедура может быть адаптирована для разных линий крыс различных возрастных диапазонов.

1. Хирургия глазной гипертензии и клиническое наблюдение

1. Содержание животных в среде с контролируемой температурой и 12-часовым циклом света и темноты (6 утра: свет включен / 6 вечера: свет выключен) со стандартным гранулированным гамма-облученным кормом (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Бразилия) и водой (тройной фильтр, с нетоксичным активированным углем), доступными вволю.
2. Приготовьте смесь для приготовления анестетика, состоящую из трех частей 10% кетамина гидрохлорида и одной части 2% ксилазина гидрохлорида (разбавитель: стерильная вода).
3. Осторожно удерживают животное, удерживая спинную кожу, и вызывают анестезию путем внутрибрюшинного введения 1 мкл/г массы тела смеси (кетамин: 75 мг/кг; ксилазин: 5 мг/кг). Проверьте правильность анестезии примерно через 5 минут, выполнив реакцию на щипок пальца ноги.
4. Местно обезболивают обе глазные поверхности путем закапывания проксиметакаина гидрохлорида 0,5% глазных капель. Подождите 30-60 с и удалите оставшийся раствор с передней стороны земного шара, осторожно прикоснувшись к носовой или боковой бульбарной конъюнктиве небольшим стерильным ватным тампоном.
5. Измерьте исходный уровень ВГД как экспериментальных, так и контралатеральных контрольных глаз, поместив животное в положение вентрального пролежня на столе таким образом, чтобы поверхность роговицы была легко доступна для кончика тонометра.
6. Используйте ручной тонометр с аппланацией или отскоком (Рисунок 1A). Расположите наконечник тонометра так, чтобы он слегка касался центральной зоны роговицы перпендикулярно. Получите и усредните 3-5 надежных средних значений, сгенерированных машиной. Каждое среднее значение автоматически вычисляется устройством после шести успешных отдельных измерений.
   1. Загрузите тонометр отскока зондом и нажмите кнопку измерения один раз, чтобы включить его, расположив наконечник прибора вверх, чтобы зонд не упал. После включения на дисплее отобразится 00, указывающий на то, что оборудование готово к измерению.
   2. Расположите прибор наконечником зонда на расстоянии 1-4 мм от роговицы и проводите измерения быстрым и осторожным нажатием кнопки измерения, не перемещая оборудование. Каждое успешное измерение обозначается коротким звуковым сигналом, а после шести раз среднее значение отображается на экране устройства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на большой опыт работы с аппланационным тонометром, для оптимизации всей процедуры авторы рекомендуют использовать тонометр с отскоком, который обеспечивает более легкий получение достоверного измерения ВГД.
7. Поместите животное в слегка боковое пролежневое положение под стереомикроскопом и тщательно спланируйте операцию, осматривая экспериментальный глаз при 40-кратном увеличении. Не забывайте поддерживать контралатеральный контроль глаза смазанным во время процедуры, закапывая каплю кармеллозы натрия или гиалуроната натрия.
8. С помощью изогнутых щипцов осторожно выдвиньте вперед экспериментальное глазное яблоко так, чтобы обнажить сосудистую сеть, которая окружает лимб¹³ на 360°. Другой рукой осторожно прижгите сосуды вокруг роговицы с помощью низкотемпературного офтальмологического прижигания (1,300 °F; Bovie Medical, США) (рис. 1B-E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Упомянутое прижигание имеет круглый кончик, который должен касаться лимбальной сосудистой сети в продольном направлении.
9. Будьте осторожны и не прижигайте периферию роговицы, так как это может привести к послеоперационному помутнению роговицы, что исключает оценку функции сетчатки in vivo .
10. Наблюдайте появление небольших круглых следов прижигания на лимбе склеры, облитерацию лимбальной сосудистой сети и расширение зрачка в прооперированном глазу, которые являются признаками успешного хирургического вмешательства.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лимбальная сосудистая сеть крыс и мышей анатомически сходна^13,24, а используемое прижигание имеет мягкий маленький кончик^, этот протокол может работать и для мышиного глаза без какой-либо адаптации.
11. После операции проверьте послеоперационное ВГД на обоих глазах, как описано в шаге 1.5.
12. Нанесите каплю офтальмологического преднизолона ацетата (1,2 мг/мл) и поддерживайте контакт с передней поверхностью экспериментального глаза в течение примерно 40 с, затем замените ее офтальмологической мазью с антибиотиками (окситетрациклина гидрохлорид 30 мг/г плюс полимиксин В 10 000 ЕД/г; или ципрофлоксацин 3,5 мг/г). Выполнить внутримышечную инъекцию трамадола гидрохлорида (разовая доза; 2 мг/кг) для предотвращения болевых ощущений после процедуры.
13. Внимательно следите за восстановлением животного после наркоза, предпочтительно в теплой среде, такой как грелка, или в клетке с надлежащей подстилкой. Обратите внимание на рисунок дыхания.
14. Проводите ежедневное клиническое наблюдение за экспериментальным глазом с помощью местных препаратов, состоящих из нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП, например, 0,5% глазных капель кеторолака трометамола) и мази с антибиотиком (желательно такой же, которая используется сразу после операции).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать НПВП вместо стероидных противовоспалительных глазных капель, поскольку последние могут индуцировать ОГТ, и регулярно применяются для моделей глюкокортикоид-индуцированной глаукомы у грызунов.
    1. При небольшом седативном эффекте (кетамин: 18,75 мг/кг; ксилазин: 1,25 мг/кг) измеряйте ВГД предпочтительно в тот же период дня, чтобы избежать смещения из-за физиологических циркадных колебаний ВГД.
    2. Во время офтальмологического обследования обратите внимание на редкие клинические проявления, такие как гифема, фиброз роговицы или истончение склеры, связанные с увеальным пролапсом. Отек роговицы, хемоз и гиперемия конъюнктивы являются распространенными, но временными явлениями.
    3. Отметьте полное клиническое выздоровление примерно на 7-й день после операции. Лимбальная реваскуляризация обычно начинается в первые два дня после операции, в соответствии с ожидаемым постепенным возвращением ВГД к исходному уровню.

2. Анализ оптомоторного ответа (OMR)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры была использована специальная система²⁵.

1. Расположите четыре компьютерных монитора в четырехугольнике, которые разграничивают арену с площадкой посередине. На мониторах выводится изображение виртуального цилиндра с вертикально ориентированными синусоидальными решетками (чередующиеся черные и белые полосы), вращающегося вокруг платформы с фиксированной скоростью (12 градусов/с) и контрастностью (100%).
2. Расположите видеокамеру над платформой, чтобы экспериментатор мог наблюдать за движениями животного. Выполните тест в фотопических условиях и установите программное обеспечение предпочтительно в ручной/раздельный режим, чтобы оценить каждый глаз отдельно.
3. Дайте животным привыкнуть примерно на 2 минуты на платформе. Удерживайте красный курсор прицела на видеокадре между глазами свободно движущегося животного, так как он указывает на центр виртуального цилиндра (рис. 1G)²⁵.
4. Наблюдайте за OMR, состоящим из рефлекторного слежения за головой и шеей животного, вызванного вращающимися решетками. Проверьте левый и правый зрительные пути, поворачивая направления синусоидальных решеток по часовой стрелке и против часовой стрелки соответственно.
   1. Первоначально предъявляют стимул с низкой пространственной частотой (0,042 цикла/градус). Затем постепенно увеличивайте частоту до тех пор, пока отслеживание движения не перестанет быть заметным. Наибольшая пространственная частота, при которой вызывается четкий OMR, соответствует пороговой пространственной частоте оцениваемого глаза.
   2. Если животное все-таки упадет с платформы во время осмотра, немедленно верните его на платформу и возобновите тест.

3. Регистрация паттерн-электроретинограммы (ПЕРГ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Электроретинограмма была записана с использованием специальной системы обработки сигналов и соответствующего программного обеспечения для хранения и анализа сигналов.

1. Глубоко обезболивают животных путем внутримышечного введения кетамина гидрохлорида и ксилазина гидрохлорида (75 мг/кг и 5 мг/кг соответственно). Глубокая анестезия (хирургическая плоскость) снижает вероятность возникновения артефактов при непроизвольных движениях мышц или альтернативных источниках шума во время обследования. Проверьте правильность анестезии, выполнив реакцию щипки пальца ноги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Упомянутые анестетики не влияют на амплитуду ответа²⁶. Поскольку в качестве активного электрода использовалась маленькая игла, введенная в роговицу, внутримышечная анестезия предпочтительнее внутрибрюшинной, так как ее легче ввести повторно в случае, если крысе потребуется бустерная доза (1/2 начальной дозы), с меньшими шансами изменить положение электрода и, таким образом, привести к более воспроизводимым записям в течение всего эксперимента. который может длиться до 60 минут.
2. Местно обезболивайте роговицу каплей проксиметакаина гидрохлорида 0,5% и увлажняйте глаз офтальмологическими смазками.
3. Осторожно введите активный электрод (иглу из нержавеющей стали 0,25 мм × 15 мм) на височную периферию роговицы. Дополнительно вводят электроды сравнения и заземления (игла из нержавеющей стали 0,4 мм × 37 мм) в подкожную клетчатку ипсилатерального височного кантуса и в одну из задних конечностей соответственно (рис. 1I).
4. Для PERG установите стимул на черно-белую резервную шахматную доску, чередующуюся со скоростью 15 разворотов/с с постоянной средней яркостью (250 кд/м2). Установите полосовой фильтр на частоту 1–100 Гц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрый реверсивный стимул генерирует стационарный PERG, стабильную и воспроизводимую синусоиду, которая собирает волновой компонент, который, скорее всего, связан с биоэлектрическим откликом RGC: NII отклонения переходного состояния PERG.
5. Расположите животное на расстоянии 20 см от экрана стимула (ЖК-монитор 0,58 м; Рисунок 1I), отслеживайте базовую линию сигнала и начните сбор PERG, нажав кнопку Analysis (Анализ) в системе сбора данных.
6. Во время процедуры следите за тем, чтобы животные были адаптированы к окружающему свету (белый свет ~140 люкс). Здесь шесть различных пространственных частот (в циклах на градус: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) были представлены в случайной последовательности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, используемое для обработки сигналов, автоматически выполняет усреднение. Среднее значение в 200-300 отдельных волн считалось достаточным для того, чтобы выделиться из шума и проанализировать амплитуду волны.

4. Количественная оценка сома ганглиозных клеток сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура предназначена для количественной оценки сомов RGC, основанной на иммуногистохимическом окрашивании плоских монтирований сетчатки антителом против специфичного для мозга гомеобокса/POU домена белка 3A (Brn3a).

1. Подопытные животные подвергались эвтаназии при вывихе шейки матки, которой предшествовало вдыхание углекислого газа, чтобы вызвать потерю сознания.
2. Сразу после эвтаназии препарируйте оба глаза под стереомикроскопом, используя зубчатые щипцы и изогнутые ножницы.
3. Выполняйте тщательное рассечение таким образом, чтобы и дистальная часть экстраокулярных мышц, и карункул оставались прикрепленными к глобусу, так как они являются важными ориентирами для топографической ориентации сетчатки (описано в шаге 4.5). Постарайтесь сохранить участок зрительного нерва, прикрепленный к глобусу, как можно дольше для будущего анализа.
4. После энуклеации поместите глаза в 1 мл раствора 4% параформальдегида (4% PFA) в 0,1 М фосфатном буфере (PBS) и держите его в течение 24 ч для правильной химической фиксации.
5. Отделите сетчатку от остальных тканей глаза.
   1. Под препарирующим микроскопом поместите глазное яблоко в чашку Петри, покрытую 1x PBS, и обратите внимание на важные ориентиры, такие как носовой карункул, трещины сосудистой оболочки и отпечатки склеры из вихревых вен, для правильной топографической ориентации²⁷.
   2. Проникают в переднюю камеру из центральной роговицы с помощью зубчатых щипцов и изогнутых ножниц (Уэсткотт). Сделайте два радиальных надреза в верхней (дорсальной) части склеры, по направлению к склеральному отверстию зрительного нерва, чтобы разграничить дорсальный квадрант глазного яблока.
   3. Отделите роговицу от остального шара через продольный разрез на 360° в области склерального лимба. Удалите хрусталик и радужную оболочку и разграничите дорсальный квадрант сетчатки, используя те же склеральные радиальные разграничения, которые описаны выше (шаг 4.5.2).
   4. Осторожно отделите ткань сетчатки от сосудистой оболочки и склеры, избегая как случайных разрывов по всей ткани, так и возможной потери топографической ориентации.
   5. Отделяют цилиарное тело от ретинальной ora serrata. Осторожно извлеките оставшееся стекловидное тело из чашечки сетчатки с помощью изогнутых беззубых щипцов, а также изогнутых ножниц (вытяните стекловидное тело и рассеките его близко к внутренней ограничивающей мембране) и небольшой щетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление стекловидного тела является важным шагом для получения сильного и чистого иммуногистохимического сигнала.
6. Перенесите изолированную сетчатку в 24-луночный культуральный планшет (по одной сетчатке на лунку), содержащую 1 мл 1x PBS, и держите внутреннюю сетчатку вверх.
7. Пермеабилизируйте ткани, промывая 3 раза в течение 10 минут неионогенным поверхностно-активным веществом 0,5%, разведенным в 1x PBS (0,3 мл). Затем осторожно встряхивайте ткань в 5% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в неионогном поверхностно-активном веществе 2% и 1x PBS (блокирующий раствор; 0,25 мл) в течение 60 минут при комнатной температуре.
8. На этапе 4.7 приготовьте раствор первичных антител Brn3a, разбавив 1:200 неионогенным поверхностно-активным веществом 0,5% и 1x PBS плюс 5% BSA, и храните его при температуре 4 °C.
9. После 60 мин блокады тканей инкубируют сетчатку в 0,2 мл раствора первичных антител при 4 °C в течение 72 ч при легком встряхивании.
10. Промойте ткань 3 раза в течение 10 минут с 1 PBS, затем инкубируйте ткань в течение 2 ч при комнатной температуре в 0,2 мл раствора вторичных антител, разведенных 1:750 в 1x PBS плюс 5% BSA.
11. Далее инкубируют ткань в течение 10 мин в растворе ядерного контрокрашивания для флуоресцентного окрашивания ядер. Завершите иммуногистохимическое исследование заключительным этапом промывки с повторением 1x PBS (0,3 мл) 3 раза.
12. Перенесите сетчатку с помощью двух маленьких кистей на предметные стекла микроскопа, держа стекловидную сторону вверх. Расположите дорсальный квадрант сетчатки вверх на предметных стеклах микроскопа (ранее разграниченные в шаге 4.5.3). Сделайте еще два радиальных надреза по направлению к головке зрительного нерва, чтобы разграничить остальные 3 квадранта (носовой, вентральный и височный).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры выреза не фиксированы. Они не должны быть слишком короткими, что ухудшает эффективное уплощение сетчатки на предметном стекле, и не должны быть слишком длинными, чтобы они достигали отверстия зрительного нерва и полностью отделяли разграниченный квадрант сетчатки от остальной ткани.
13. Наконец, нанесите 0,2 мл антизатухающей монтажной среды на стеклянный покровный лист и поместите его на плоскую сетчатку для микроскопического анализа тканей. Чтобы оценить плотность RGC, исследуйте плоские крепления под конфокальным эпифлуоресцентным микроскопом с использованием объектива 40x/1,3.
14. Для каждого квадранта сетчатки сделайте восемь фотографий: две с центральной части сетчатки (~0,9 мм от диска зрительного нерва), три со средней части сетчатки (~2,0 мм с диска зрительного нерва) и три с периферической сетчатки (~3,7 мм с диска зрительного нерва), всего 32 фотографии на сетчатку. Используйте программное обеспечение FIJI для подсчета Brn3a-положительных клеток и оценки средней плотности клеток.

5. Обследование зрительного нерва

1. После эвтаназии и энуклеации глазного яблока (этапы 4.1-4.3) удаляют проксимальный сегмент внутриглазничного отдела зрительного нерва (1-2 мм), включая часть внутриглазной части, и немедленно помещают образцы во флаконы/пробирки, содержащие 0,2-0,3 мл фиксатора холода (2,5% раствор глутарового альдегида в 0,1 М буфере какодилата натрия (рН 7,4)) на 2 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы обработки зрительного нерва выполняются в тех же флаконах/пробирках, что и на этапе 5.1
2. Промыть материал 3 раза в течение 5 мин холодным 0,1 М буфером какодилата натрия. После фиксации ткани в течение 1 ч при легком встряхивании в растворе 1,0% тетраоксида осмия в 0,8% ферроцианиде калия и 5 нМ кальция хлорида, разбавленного в 0,1 М буфере какодилата натрия при 4 °С (0,1-0,2 мл).
3. Фрагменты зрительного нерва промывают 3 раза в течение 5 мин холодным 0,1 М буфером какодилата натрия, а затем холодной дистиллированной водой 3 раза в течение 1 мин. Материал выдерживают в течение ночи при легком встряхивании в растворе 1,0% уранилацетата в дистиллированной воде для окрашивания при 4 °C (0,1-0,2 мл). Фрагменты промыть 3 раза холодной дистиллированной водой.
4. Постепенно обезвоживайте ткань с помощью ступенчатой серии ацетона (0,5 мл каждая) с последующей заменой следующих разведений в дистиллированной воде: 2x 7-минутная инкубация в 15% ледяном ацетоне; 2x 7-минутная инкубация в 30% ледяном ацетоне; 2x 7-минутная инкубация в 50% ледяном ацетоне; 2x 7-минутная инкубация в 70% ледяном ацетоне; 2x 7-минутная инкубация в 80% ледяном ацетоне; 2x 7-минутная инкубация в 90% ледяном ацетоне; 2x 15-минутная инкубация в 100% ацетоне при комнатной температуре (RT).
5. Выполнить 3 этапа инфильтрации/заделки, с последующей заменой следующих растворов: 1 часть эпоксидной смолы: 2 части ацетона (общий объем: 0,5 мл), при RT в течение 12 ч; 1 часть эпоксидной смолы: 1 часть ацетона (общий объем: 0,5 мл), при RT в течение 12 ч; 2 части эпоксидной смолы: 1 часть ацетона (общий объем: 0,5 мл), при RT в течение 12 ч. Наконец, инфильтрировать ткань в чистую эпоксидную смолу при RT в течение 24 ч.
6. Извлеките образцы из носителя образцов, переложите их в формы для встраивания и дайте полимеризоваться в течение 48 ч при 60 °C. С помощью ультрамикротома вырезать поперечные полутонкие срезы (300-400 нм) фрагментов зрительного нерва, собрать и перенести их на предметное стекло микроскопа. Окрасьте срезы толуидиновым синим и визуализируйте с помощью оптического микроскопа при 100-кратном увеличении.
7. Для ультраструктурного анализа выполняют ультратонкие поперечные срезы (70 нм), собирают их на медные сетки и окрашивают уранилацетатом и цитратом свинца. Рассмотрите срезы в просвечивающий электронный микроскоп.

Результаты

Количественные переменные выражаются в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения (SEM). За исключением сравнения динамики ВГД между ГВТ и контрольной группами (рис. 1F), статистический анализ проводили с использованием двуфакторного ANOVA с последующим ?...

Обсуждение

Прижигание лимбального сплетения (ЛПК) является новой посттрабекулярной моделью, преимущество которой заключается в том, что она нацелена на легкодоступные сосудистые структуры, не требующие диссекции конъюнктивы или шипа^17,28. В отличие от модели прижиг...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Isofar	201	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography	Hansol Medical Co	-	Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon	Novartis Biociências S/A	MS-1.0068.1087	Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride	Vetec	560	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx	Bovie Medical Corporation	AA00	Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin	Syntec do Brasil Ltda	000200-3-000003	Ketamine hydrochloride 10%
DAKO	Dako North America	S3023	Antifade mounting medium
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0487	Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin	Polysciences, Inc.	-	Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16110	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-8042140002	Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab	Icare Finland Oy	TV02 (model number)	Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches	Samsung Electronics Co. Ltd.	S23B550	Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta	Carl Zeiss	-	Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0489	Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K	Nihon Kohden Corporation	-	System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33	Nihon Kohden Corporation	-	Software for electroretinogram signal processing
Optomotry	CerebralMechanics	-	System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide	Electron Microscopy Sciences	20150	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography	Chalgren Enterprises	110-63	Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	12300	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-1.0497.1287	Prednisolone acetate 0.12%
Terolac	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0497.1286	Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina	Laboratórios Pfizer Ltda	MS-1.0216.0024	Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL	Reichert Technologies	230635	Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	Non-ionic surfactant
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin	Syntec do Brasil Ltda	7899	Xylazine hydrochloride 2%
	Carl Zeiss	-	Stereo microscope for surgery and retinal dissection