Cautérisation complète du plexus vasculaire limbique pour le glaucome induit chirurgicalement chez les rongeurs

Résumé

L’objectif de ce protocole est de caractériser un nouveau modèle de neurodégénérescence glaucomateuse basé sur une cautérisation thermique à 360° du plexus vasculaire limbique, induisant une hypertension oculaire subaiguë.

Résumé

Le glaucome, deuxième cause de cécité dans le monde, est un groupe hétérogène de troubles oculaires caractérisés par des lésions structurelles du nerf optique et une dégénérescence des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), entraînant un dysfonctionnement visuel en interrompant la transmission des informations visuelles de l’œil au cerveau. Une pression intraoculaire élevée est le facteur de risque le plus important ; Ainsi, plusieurs modèles d’hypertension oculaire ont été développés chez les rongeurs par des approches génétiques ou expérimentales pour étudier les causes et les effets de la maladie. Parmi celles-ci, certaines limites ont été signalées, telles que l’invasivité chirurgicale, l’évaluation fonctionnelle inadéquate, la nécessité d’une formation approfondie et l’extension très variable des lésions rétiniennes. Le présent travail caractérise une méthode simple, peu coûteuse et efficace pour induire l’hypertension oculaire chez les rongeurs, basée sur la cautérisation à basse température et en cercle complet du plexus vasculaire limbique, une composante majeure du drainage de l’humeur aqueuse. Le nouveau modèle fournit une hypertension oculaire subaiguë techniquement facile, non invasive et reproductible, associée à un CGR progressif et à une dégénérescence du nerf optique, ainsi qu’un taux de récupération clinique postopératoire unique qui permet des études fonctionnelles in vivo par des méthodes électrophysiologiques et comportementales.

Introduction

La littérature médicale considère le glaucome comme un groupe hétérogène de neuropathies optiques caractérisées par une dégénérescence progressive des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), des dendrites, du soma et des axones, entraînant une ventouse structurelle (excavation) du disque optique et une détérioration fonctionnelle du nerf optique, conduisant à l’amaurose dans les cas non contrôlés en interrompant la transmission des informations visuelles de l’œil au cerveau¹. Le glaucome est actuellement la cause la plus fréquente de cécité irréversible dans le monde, et devrait toucher environ 111,8 millions de personnes en 2040², affectant ainsi profondément la qualité de vie des patients et entraînant d’importantes préoccupations socio-économiques³.

L’élévation de la pression intraoculaire (PIO) est l’un des facteurs de risque les plus importants et les seuls modifiables pour le développement et la progression du glaucome. Parmi les multiples types de glaucome, tous, à l’exception du glaucome à tension normale (NTG), sont associés à une PIO élevée à un moment donné de l’histoire clinique de la maladie. Malgré des avancées cliniques et chirurgicales remarquables pour cibler la PIO et ralentir ou arrêter la progression de la maladie, les patients perdent toujours la vue en raison du glaucome ^4,5. Par conséquent, une compréhension approfondie de la physiopathologie complexe et multifactorielle de cette maladie est impérative pour le développement de traitements plus efficaces, en particulier pour fournir une neuroprotection aux CGR.

Parmi une variété d’approches expérimentales pour la compréhension des mécanismes de la maladie, les modèles animaux basés sur l’hypertension oculaire (OHT) ressemblent le plus au glaucome humain. Les modèles de rongeurs sont particulièrement utiles car ils sont peu coûteux, faciles à manipuler, peuvent être manipulés génétiquement, ont une courte durée de vie et présentent des caractéristiques anatomiques et physiologiques oculaires comparables à celles des humains, telles que la production et le drainage de l’humeur aqueuse 6,7,8,9,10,11,12,13 . Les modèles actuellement utilisés comprennent la sclérose du réseau trabéculaire après injection de solution saline hypertonique dans les veines épisclérales¹⁴, l’injection intracamérale de microbilles¹⁵ ou de substances viscoélastiques 16, la cautérisation des veines vortex 17, la photocoagulation du réseau trabéculaire avec un laser argon 18, la suture circumlimbique ¹⁹ et l’utilisation d’un modèle transgénique d’OHT liée à l’âge (souris DBA/2J)8. Cependant, le caractère invasif, l’opacification postopératoire de la cornée, la perturbation du segment antérieur, les courbes d’apprentissage étendues, l’équipement coûteux et les PIO postopératoires très variables sont quelques-uns des pièges signalés associés aux modèles actuels, ce qui fait du développement d’un modèle alternatif d’OHT une exigence pour surmonter ces problèmes^20,21,22.

Le présent protocole formalise une nouvelle intervention chirurgicale pour induire l’OHT en tant qu’indicateur du glaucome, basée sur la cautérisation du plexus limbique (LPC) chez les rongeurs²³. Il s’agit d’un modèle simple, reproductible, accessible et non invasif qui offre une grande efficacité et une faible variabilité de l’élévation de la PIO, associée à un taux particulièrement élevé de récupération clinique complète, permettant ainsi une évaluation fonctionnelle in vivo chez un nombre réduit d’animaux utilisés dans chaque expérience. La technique chirurgicale induit une HTO subaiguë avec un retour progressif aux niveaux de base en quelques jours, ce qui modélise l’attaque hypertensive observée dans le glaucome aigu à angle fermé. De plus, la récupération de la PIO dans le modèle est suivie d’une neurodégénérescence glaucomateuse continue, ce qui est utile pour les futures études mécanistiques de la dégénérescence secondaire des CGR, qui se produit dans plusieurs cas de glaucome humain malgré un contrôle adéquat de la PIO.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la Déclaration sur l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle de l’Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) et approuvée par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux dans l’expérimentation scientifique du Centre des sciences de la santé de l’Université fédérale de Rio de Janeiro (protocole 083/17). Dans le présent travail, des rats à capuchon Lister des deux sexes ont été utilisés, âgés de 2 à 3 mois et pesant entre 180 et 320 g. Cependant, la procédure peut être adaptée à différentes souches de rats de différentes tranches d’âge.

1. Chirurgie de l’hypertension oculaire et suivi clinique

1. Hébergez les animaux dans un environnement à température contrôlée et un cycle lumière/obscurité de 12 h (6 h : lumière allumée / 18 h : lumière éteinte) avec de la nourriture standard en granulés irradiés aux rayons gamma (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brésil) et de l’eau (triple filtre, avec charbon actif non toxique) disponibles ad libitum.
2. Préparez un mélange de cocktail anesthésique composé de trois parties de chlorhydrate de kétamine à 10 % et d’une partie de chlorhydrate de xylazine à 2 % (diluant : eau stérile).
3. Immobiliser doucement l’animal en tenant la peau dorsale et provoquer une anesthésie par administration intrapéritonéale de 1 μL/g de poids corporel du mélange (kétamine : 75 mg/kg ; xylazine : 5 mg/kg). Vérifiez l’anesthésie appropriée après environ 5 minutes en effectuant une réponse de pincement des orteils.
4. Anesthésier localement les deux surfaces oculaires en instillant du chlorhydrate de proxymétacaïne 0,5 % de collyre. Attendez 30 à 60 s et retirez la solution restante de la face antérieure du globe, en touchant doucement la conjonctive nasale ou bulbaire latérale avec un petit coton-tige stérile.
5. Mesurez la PIO de base des yeux témoins expérimentaux et controlatéraux en plaçant l’animal en position de décubitus ventral sur la paillasse de manière à ce que la surface cornéenne soit facilement accessible à l’extrémité du tonomètre.
6. Utilisez un tonomètre portatif à aplanation ou à rebond (Figure 1A). Positionnez la pointe du tonomètre de manière à ce qu’elle touche légèrement la zone cornéenne centrale perpendiculairement. Acquérir et faire la moyenne de 3 à 5 moyennes fiables générées par la machine. Chaque moyenne est automatiquement calculée par l’appareil après six mesures individuelles réussies.
   1. Chargez le tonomètre à rebond avec une sonde et appuyez une fois sur le bouton de mesure pour l’allumer, tout en plaçant la pointe de l’appareil vers le haut, afin d’éviter que la sonde ne tombe. Après la mise sous tension, l’écran affichera 00 indiquant que l’équipement est prêt à mesurer.
   2. Positionnez l’appareil avec la pointe de la sonde à une distance de 1 à 4 mm de la cornée et obtenez des mesures en appuyant rapidement et soigneusement sur le bouton de mesure, sans déplacer l’équipement. Chaque mesure réussie est identifiée par un bip court et après six fois, la moyenne est affichée sur l’écran de l’appareil.
      REMARQUE : Malgré une longue expérience avec le tonomètre d’aplanation, pour optimiser l’ensemble de la procédure, les auteurs recommandent l’utilisation d’un tonomètre de rebond, qui facilite l’acquisition d’une mesure fiable de la PIO.
7. Placez l’animal sur une légère position latérale de décubitus sous un microscope stéréoscopique et planifiez soigneusement l’opération en inspectant l’œil expérimental à un grossissement de 40x. N’oubliez pas de maintenir l’œil de contrôle controlatéral lubrifié pendant l’intervention en instillant une goutte de carmellose sodique ou d’hyaluronate de sodium.
8. À l’aide d’une pince incurvée, poussez doucement vers l’avant le globe oculaire expérimental de manière à exposer le système vasculaire qui entoure à 360° le limbe¹³. De l’autre main, cautériser doucement les vaisseaux tout autour de la cornée avec un cautéris ophtalmique à basse température (1 300 °F ; Bovie Medical, États-Unis) (Figure 1B-E).
   REMARQUE : Le cautéris mentionné a une extrémité ronde qui doit toucher la vascularisation limbique longitudinalement.
9. Veillez à ne pas cautériser la périphérie cornéenne, car cela pourrait entraîner une opacification cornéenne postopératoire, ce qui empêche l’évaluation in vivo de la fonction rétinienne.
10. Observez l’apparition de petites marques circulaires de cautérisation sur le limbe scléral, l’oblitération de la vascularisation limbique et la dilatation de la pupille dans l’œil opéré, qui sont des signes d’une intervention chirurgicale réussie.
    REMARQUE : Comme le système vasculaire limbique des rats et des souris est anatomiquement similaire^13,24 et que le cautérier utilisé a une petite pointe douce^, ce protocole peut également fonctionner pour l’œil de la souris sans aucune adaptation.
11. Après la chirurgie, vérifiez la PIO postopératoire immédiate dans les deux yeux, comme décrit à l’étape 1.5.
12. Appliquez une goutte d’acétate ophtalmique de prednisolone (1,2 mg/mL) et maintenez-la en contact avec la face antérieure de l’œil expérimental pendant environ 40 s, puis remplacez-la par une pommade ophtalmique d’antibiotiques (chlorhydrate d’oxytétracycline 30 mg/g plus polymyxine B 10 000 U/g ; ou ciprofloxacine 3,5 mg/g). Effectuer une injection intramusculaire de chlorhydrate de tramadol (dose unique ; 2 mg / kg) pour prévenir la douleur après l’intervention.
13. Suivez de près la récupération de l’animal après l’anesthésie, de préférence dans un environnement chaud tel qu’un coussin chauffant ou à l’intérieur de sa cage d’habitation avec une litière appropriée. Faites attention au schéma respiratoire.
14. Effectuer un suivi clinique quotidien de l’œil expérimental avec des médicaments topiques composés d’un anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS, par exemple, ketorolac trométamol 0,5% collyre) et d’une pommade antibiotique (de préférence la même que celle utilisée immédiatement après la chirurgie).
    REMARQUE : L’utilisation d’AINS plutôt que de gouttes ophtalmiques anti-inflammatoires stéroïdiennes est recommandée car cette dernière peut induire une OHT et est régulièrement appliquée pour les modèles de glaucome induit par les glucocorticoïdes chez les rongeurs.
    1. Sous sédation légère (kétamine : 18,75 mg/kg ; xylazine : 1,25 mg/kg), mesurer la PIO de préférence à la même période de la journée, afin d’éviter les biais dus à la fluctuation physiologique de la PIO circadienne.
    2. Lors de l’examen oculaire, notez de rares intercidives cliniques, telles que l’hyphéma, la fibrose cornéenne ou l’amincissement scléral associé à un prolapsus uvéal. L’œdème cornéen, le chémose et l’hyperémie conjonctivale sont fréquents mais temporaires.
    3. Remarquez une récupération clinique complète vers le 7e jour postopératoire. La revascularisation limbique commence généralement dans les deux premiers jours après la chirurgie, conformément au retour progressif attendu de la PIO à la ligne de base.

2. Analyse de la réponse optomotrice (OMR)

NOTE : Pour cette procédure, un système spécifique a été utilisé²⁵.

1. Disposez quatre écrans d’ordinateur dans un quadrilatère, qui délimite une arène avec une plate-forme au milieu. Sur les moniteurs, affichez l’image d’un cylindre virtuel avec des réseaux sinusoïdaux orientés verticalement (bandes noires et blanches alternées), tournant autour de la plate-forme à une vitesse (12 degrés/s) et un contraste (100%).
2. Placez une caméra vidéo au-dessus de la plate-forme, permettant à l’expérimentateur d’observer les mouvements de l’animal. Effectuez le test dans des conditions photopiques et réglez le logiciel de préférence en mode manuel/séparé afin d’évaluer chaque œil séparément.
3. Laissez les animaux s’habituer pendant environ 2 minutes sur la plate-forme. Maintenez le curseur en forme de croix rouge sur l’image vidéo entre les yeux de l’animal qui se déplace librement, car il indique le centre du cylindre virtuel (Figure 1G)²⁵.
4. Observez l’OMR, qui consiste en un suivi réflexe de la tête et du cou de l’animal provoqué par les grilles rotatives. Testez les voies visuelles gauche et droite en tournant les directions des réseaux sinusoïdaux dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, respectivement.
   1. Présenter initialement un stimulus avec une faible fréquence spatiale (0,042 cycles/degré). Ensuite, augmentez progressivement la fréquence jusqu’à ce que le mouvement de suivi ne soit plus remarqué. La fréquence spatiale la plus élevée dans laquelle une OMR claire est obtenue correspond à la fréquence spatiale seuil de l’œil évalué.
   2. Si l’animal finit par tomber de la plate-forme pendant l’examen, remettez-le immédiatement sur la plate-forme et reprenez le test.

3. Enregistrement de l’électrorétinogramme (PERG)

NOTE : L’électrorétinogramme a été enregistré à l’aide d’un système spécifique de traitement du signal et d’un logiciel associé pour le stockage et l’analyse des formes d’onde.

1. Anesthésier en profondeur les animaux par injection intramusculaire de chlorhydrate de kétamine et de chlorhydrate de xylazine (75 mg/kg et 5 mg/kg, respectivement). L’anesthésie profonde (plan chirurgical) diminue les risques d’artéfacts par des mouvements musculaires involontaires ou d’autres sources de bruit pendant l’examen. Vérifiez que l’anesthésie est correcte en effectuant une réponse de pincement des orteils.
   REMARQUE : Les agents anesthésiques mentionnés n’affectent pas l’amplitude de la réponse²⁶. Comme une petite aiguille insérée dans la cornée a été utilisée comme électrode active, l’anesthésie intramusculaire est préférée à l’anesthésie intrapéritonéale, car elle est plus facile à réinjecter au cas où le rat aurait besoin d’une dose de rappel (1/2 de la dose initiale), avec moins de chances de modifier la position de l’électrode et conduisant ainsi à des enregistrements plus reproductibles pendant toute l’expérience. qui peut durer jusqu’à 60 min.
2. Anesthésiez la cornée par voie topique avec une goutte de chlorhydrate de proxymétacaïne 0,5 % et maintenez l’œil humidifié avec des lubrifiants ophtalmiques.
3. Insérez délicatement l’électrode active (aiguille en acier inoxydable 0,25 mm × 15 mm) à la périphérie temporale de la cornée. De plus, insérez les électrodes de référence et de masse (aiguille en acier inoxydable de 0,4 mm × 37 mm) dans le tissu sous-cutané du canthus temporal ipsilatéral et dans l’un des membres postérieurs, respectivement (Figure 1I).
4. Pour le PERG, réglez le stimulus sur un damier de réserve noir et blanc, alternant à 15 inversions/s avec une luminance moyenne constante (250 cd/m2). Réglez le filtre passe-bande sur 1 Hz-100 Hz.
   REMARQUE : Le stimulus d’inversion rapide génère le PERG à l’état d’équilibre, une sinusoïde stable et reproductible qui rassemble la composante d’onde la plus probablement associée à la réponse bioélectrique du RGC : déviation NII du PERG à l’état transitoire.
5. Positionnez l’animal à 20 cm de l’écran de stimulus (écran LCD 0,58 m ; Figure 1I), surveillez la ligne de base du signal et démarrez l’acquisition PERG en appuyant sur le bouton Analysis (Analyse) du système d’acquisition.
6. Pendant la procédure, gardez les animaux adaptés à la lumière ambiante (lumière blanche de ~140 lux). Ici, six fréquences spatiales distinctes (en cycles par degré : 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) ont été présentées en séquence aléatoire.
   REMARQUE : Le logiciel utilisé pour le traitement du signal effectue automatiquement la moyenne. La moyenne de 200 à 300 ondes individuelles a été considérée comme suffisante pour se démarquer du bruit et analyser l’amplitude des vagues.

4. Quantification des cellules ganglionnaires de la rétine somas

NOTA : La procédure suivante est destinée à la quantification des somas RGC, basée sur la coloration immunohistochimique de supports plats rétiniens avec un anticorps dirigé contre la protéine 3A (Brn3a) du domaine homéobox/POU spécifique du cerveau.

1. Soumettre les animaux de laboratoire à une euthanasie par luxation du col de l’utérus, précédée d’une inhalation de dioxyde de carbone pour induire une perte de conscience.
2. Immédiatement après l’euthanasie, disséquez les deux yeux au microscope stéréoscopique, à l’aide d’une pince dentée et de ciseaux courbés.
3. Effectuez une dissection soigneuse de manière à ce que la partie distale des muscles extraoculaires et la caroncule restent attachées au globe, car ce sont des points de repère importants pour l’orientation topographique de la rétine (décrit à l’étape 4.5). Essayez de conserver un tronçon du nerf optique attaché au globe aussi longtemps que possible pour une analyse future.
4. Après l’énucléation, placer les yeux dans une solution de 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (4 % de PFA) dans un tampon phosphate (PBS) à 0,1 M et le conserver pendant 24 h pour une fixation chimique correcte.
5. Séparez la rétine du reste des tissus oculaires.
   1. Sous un microscope à dissection, placez le globe oculaire dans une boîte de Pétri recouverte de 1x PBS et faites attention aux points de repère importants tels que la caroncule nasale, les fissures choroïdes et les empreintes sclérales des veines vortex pour une orientation topographique correcte²⁷.
   2. Pénétrer dans la chambre antérieure à partir de la cornée centrale à l’aide d’une pince dentée et de ciseaux courbés (westcott). Faites deux coupes radiales à la face supérieure (dorsale) de la sclère, vers le foramen scléral du nerf optique, de manière à délimiter le quadrant dorsal du globe oculaire.
   3. Séparez la cornée du reste du globe par une coupe longitudinale à 360° au niveau du limbe scléral. Retirez le cristallin et l’iris et délimitez le quadrant dorsal rétinien en utilisant les mêmes démarcations radiales sclérales décrites ci-dessus (étape 4.5.2).
   4. Détachez soigneusement le tissu rétinien de la choroïde et de la sclère, en évitant à la fois les lacérations aléatoires dans tout le tissu et une éventuelle perte d’orientation topographique.
   5. Séparez le corps ciliaire de l’ora serrata rétinienne. Retirez délicatement le corps vitré restant de la cupule rétinienne à l’aide d’une pince incurvée non dentée et de ciseaux courbés (tirez sur le vitré et disséquez-le près de la membrane limitante interne) et d’une petite brosse.
      REMARQUE : L’élimination de l’humeur vitrée est une étape importante pour obtenir un signal immunohistochimique fort et propre.
6. Transférez les rétines isolées dans une plaque de culture à 24 puits (une rétine par puits) contenant 1 mL de PBS 1x et gardez la rétine interne vers le haut.
7. Perméabiliser les tissus en les lavant 3 fois pendant 10 min avec un tensioactif non ionique à 0,5 % dilué dans 1 PBS (0,3 ml). Ensuite, maintenez le tissu doucement agité dans de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % dans un tensioactif non ionique à 2 % et 1 x PBS (solution bloquante ; 0,25 ml) pendant 60 min à température ambiante.
8. Au cours de l’étape 4.7, préparez la solution primaire d’anticorps Brn3a en la diluant 1 :200 dans un tensioactif non ionique à 0,5 % et 1 x PBS plus 5 % de BSA, et conservez-la à 4 °C.
9. Après 60 min de blocage tissulaire, incuber les rétines dans 0,2 mL de solution primaire d’anticorps à 4 °C pendant 72 h en agitant doucement.
10. Lavez le tissu 3 fois pendant 10 min avec 1 PBS, puis incubez le tissu pendant 2 h à température ambiante dans 0,2 mL de solution d’anticorps secondaire diluée 1 :750 dans 1 x PBS plus 5 % de BSA.
11. De plus, incuber le tissu pendant 10 minutes dans une solution de contre-coloration nucléaire pour la coloration des noyaux fluorescents. Terminez l’immunohistochimie par une dernière étape de lavage avec 1x PBS (0,3 mL) répété 3x.
12. Transférez les rétines à l’aide de deux petites brosses sur des lames de microscope en verre, en maintenant le côté vitré vers le haut. Positionnez le quadrant dorsal de la rétine vers le haut sur les lames du microscope (préalablement délimité à l’étape 4.5.3). Faites deux autres coupes radiales vers la tête du nerf optique pour délimiter les 3 autres quadrants (nasal, ventral et temporal).
    REMARQUE : Les dimensions de coupe ne sont pas fixes. Ils ne doivent pas être trop courts pour ne pas nuire à un aplatissement efficace de la rétine sur la lame et ne doivent pas être trop longs pour qu’ils atteignent le foramen du nerf optique et séparent complètement le quadrant rétinien délimité du reste du tissu.
13. Enfin, appliquez 0,2 mL de milieu d’enrobage anti-décoloration sur une lamelle de verre et placez-la sur la rétine montée à plat pour une analyse microscopique tissulaire. Pour estimer la densité des CGR, examinez les montures plates sous un microscope confocal à épifluorescence à l’aide d’un objectif 40x/1,3.
14. Pour chaque quadrant de la rétine, prenez huit photos : deux de la rétine centrale (~0,9 mm du disque optique), trois de la rétine moyenne (~2,0 mm du disque optique) et trois de la rétine périphérique (~3,7 mm du disque optique), soit un total de 32 photos par rétine. Utilisez le logiciel FIJI pour compter les cellules Brn3a positives et estimer la densité cellulaire moyenne.

5. Examen du nerf optique

1. Après l’euthanasie et l’énucléation du globe oculaire (étapes 4.1 à 4.3), retirer le segment proximal de la partie intraorbitaire du nerf optique (1 à 2 mm), y compris une partie de la partie intraoculaire, et placer immédiatement les échantillons dans des flacons/tubes contenant 0,2 à 0,3 mL de fixateur froid (solution de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon de cacodylate de sodium à 0,1 M (pH 7,4)) pendant 2 h.
   REMARQUE : Les étapes suivantes pour le traitement du nerf optique sont effectuées dans les mêmes flacons/tubes que ceux de l’étape 5.1
2. Lavez le matériau 3 fois pendant 5 min avec un tampon de cacodylate de sodium à froid de 0,1 M. Fixer le tissu pendant 1 h en agitant doucement dans une solution de tétroxyde d’osmium à 1,0 % dans du ferrocyanure de potassium à 0,8 % et de chlorure de calcium à 5 nM dilué dans un tampon de cacodylate de sodium à 0,1 M à 4 °C (0,1-0,2 mL).
3. Laver les fragments du nerf optique 3 fois pendant 5 min avec un tampon de cacodylate de sodium à 0,1 M à froid, puis avec de l’eau distillée froide, 3 fois pendant 1 min. Conserver le matériau toute la nuit sous une légère agitation dans une solution d’acétate d’uranyle à 1,0 % dans de l’eau distillée pour coloration à 4 °C (0,1 à 0,2 ml). Lavez les fragments 3 fois avec de l’eau distillée froide.
4. Déshydrater progressivement le tissu avec une série d’acétone graduée (0,5 mL chacune), puis remplacer les dilutions suivantes dans de l’eau distillée : 2 x 7 min d’incubation dans de l’acétone glacée à 15 % ; 2 x 7 min d’incubation dans de l’acétone glacée à 30 % ; 2x 7 min d’incubation dans de l’acétone glacée à 50 % ; 2 x 7 min d’incubation dans de l’acétone glacée à 70 % ; 2x 7 min d’incubation dans de l’acétone glacée à 80 % ; 2 x 7 min d’incubation dans de l’acétone glacée à 90 % ; 2x 15 min d’incubation dans de l’acétone à 100% à température ambiante (RT).
5. Effectuer 3 étapes d’infiltration/enrobage, avec remplacement ultérieur des solutions suivantes : 1 partie de résine époxy : 2 parties d’acétone (volume total : 0,5 mL), à RT pendant 12 h ; 1 partie de résine époxy : 1 part d’acétone (volume total : 0,5 ml), à RT pendant 12 h ; 2 parties de résine époxy : 1 part d’acétone (volume total : 0,5 ml), à RT pendant 12 h. Enfin, infiltrer le tissu dans de la résine époxy pure à RT pendant 24 h.
6. Retirez les échantillons du support d’échantillon, transférez-les dans des moules d’enrobage et laissez polymériser pendant 48 h à 60 °C. Découper des coupes transversales semi-minces (300-400 nm) des fragments du nerf optique à l’aide d’un ultramicrotome, les recueillir et les transférer sur une lame de verre de microscope. Colorez les coupes avec du bleu de toluidine et imagez-les à l’aide d’un microscope optique à un grossissement de 100x.
7. Pour l’analyse ultrastructurale, effectuez des coupes transversales ultraminces (70 nm), collectez-les sur des grilles de cuivre et colorez-les avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb. Examinez les coupes dans un microscope électronique à transmission.

Résultats

Les variables quantitatives sont exprimées en moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). À l’exception de la comparaison de la dynamique de la PIO entre le groupe OHT et le groupe témoin (figure 1F), l’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’une ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Sidak. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

La figure 1 il...

Discussion

La cautérisation du plexus limbique (LPC) est un nouveau modèle post-trabéculaire qui présente l’avantage de cibler des structures vasculaires facilement accessibles ne nécessitant pas de dissection conjonctivale ou à tenon^17,28. Contrairement au modèle de cautérisation des veines vortex, un modèle d’OHT renommé basé sur l’atteinte chirurgicale du drainage veineux choroïde, la congestion veineuse ne devrait pas influencer l’augmentation de la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Isofar	201	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography	Hansol Medical Co	-	Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon	Novartis Biociências S/A	MS-1.0068.1087	Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride	Vetec	560	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx	Bovie Medical Corporation	AA00	Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin	Syntec do Brasil Ltda	000200-3-000003	Ketamine hydrochloride 10%
DAKO	Dako North America	S3023	Antifade mounting medium
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0487	Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin	Polysciences, Inc.	-	Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16110	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-8042140002	Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab	Icare Finland Oy	TV02 (model number)	Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches	Samsung Electronics Co. Ltd.	S23B550	Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta	Carl Zeiss	-	Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0489	Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K	Nihon Kohden Corporation	-	System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33	Nihon Kohden Corporation	-	Software for electroretinogram signal processing
Optomotry	CerebralMechanics	-	System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide	Electron Microscopy Sciences	20150	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography	Chalgren Enterprises	110-63	Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	12300	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-1.0497.1287	Prednisolone acetate 0.12%
Terolac	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0497.1286	Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina	Laboratórios Pfizer Ltda	MS-1.0216.0024	Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL	Reichert Technologies	230635	Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	Non-ionic surfactant
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin	Syntec do Brasil Ltda	7899	Xylazine hydrochloride 2%
	Carl Zeiss	-	Stereo microscope for surgery and retinal dissection