Kemirgenlerde Cerrahi Olarak İndüklenen Glokom için Limbal Vasküler Pleksusun Tam Daire Koterizasyonu

Özet

Bu protokolün amacı, subakut oküler hipertansiyonu indükleyen limbal vasküler pleksusun 360° termik koterizasyonuna dayanan yeni bir glokomatöz nörodejenerasyon modelini karakterize etmektir.

Özet

Dünya çapında körlüğün ikinci önde gelen nedeni olan glokom, optik sinirde yapısal hasar ve retina ganglion hücresi (RGC) dejenerasyonu ile karakterize, gözden beyne görsel bilgi iletimini kesintiye uğratarak görsel işlev bozukluğuna neden olan heterojen bir oküler bozukluk grubudur. Göz içi basıncının yükselmesi en önemli risk faktörüdür; Bu nedenle, hastalığın nedenlerini ve etkilerini araştırmak için genetik veya deneysel yaklaşımlarla kemirgenlerde çeşitli oküler hipertansiyon modelleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında cerrahi invazivlik, yetersiz fonksiyonel değerlendirme, kapsamlı eğitim gereksinimi ve retina hasarının oldukça değişken uzantısı gibi bazı sınırlamalar bildirilmiştir. Bu çalışma, sulu mizah drenajının önemli bir bileşeni olan limbal vasküler pleksusun düşük sıcaklıkta, tam daire koterizasyonuna dayalı olarak kemirgenlerde oküler hipertansiyonu indüklemek için basit, düşük maliyetli ve etkili bir yöntemi karakterize etmektedir. Yeni model, ilerleyici RGC ve optik sinir dejenerasyonu ile ilişkili, teknik olarak kolay, noninvaziv ve tekrarlanabilir bir subakut oküler hipertansiyon ve hem elektrofizyolojik hem de davranışsal yöntemlerle in vivo fonksiyonel çalışmalara izin veren benzersiz bir postoperatif klinik iyileşme oranı sağlar.

Giriş

Tıp literatürü glokomu, retinal ganglion hücrelerinin (RGC'ler), dendritlerin, soma ve aksonların ilerleyici dejenerasyonu ile karakterize heterojen bir optik nöropati grubu olarak anlamaktadır, bu da optik diskin yapısal çukurluğu (kazısı) ve optik sinirin fonksiyonel bozulması ile sonuçlanan, kontrolsüz vakalarda gözden beyne görsel bilgi iletimini kesintiye uğratarak amaurozise yol açmaktadır¹. Glokom şu anda dünya çapında geri dönüşü olmayan körlüğün en yaygın nedenidir ve 2040 yılında yaklaşık 111,8 milyon kişiye ulaşacağı tahmin edilmektedir², bu nedenle hastaların yaşam kalitesini (YK) derinden etkilemekte ve önemli sosyoekonomik kaygılara yol açmaktadır³.

Yüksek göz içi basıncı (GİB), glokomun gelişimi ve ilerlemesi için en önemli ve değiştirilebilir tek risk faktörlerinden biridir. Birden fazla glokom tipi arasında, normal tansiyonlu glokom (NTG) hariç tümü, hastalığın klinik öyküsünde bir süre yüksek GİB ile ilişkilidir. GİB'yi hedeflemek ve hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak veya durdurmak için kayda değer klinik ve cerrahi gelişmelere rağmen, hastalar glokom nedeniyle hala görme yetisini kaybetmektedir ^4,5. Bu nedenle, bu hastalığın karmaşık ve multifaktöriyel patofizyolojisinin tam olarak anlaşılması, özellikle RGC'lere nöroproteksiyon sağlamak için daha etkili tedavilerin geliştirilmesi için zorunludur.

Hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına yönelik çeşitli deneysel yaklaşımlar arasında, oküler hipertansiyona (OHT) dayalı hayvan modelleri en çok insan glokomuna benzemektedir. Kemirgen modelleri, düşük maliyetli oldukları, kullanımı kolay oldukları, genetik olarak manipüle edilebildikleri, kısa ömürlü oldukları ve sulu mizah üretimi ve drenajı gibi insanlarla karşılaştırılabilir oküler anatomik ve fizyolojik özellikler sundukları için özellikle kullanışlıdır 6,7,8,9,10,11,12,13 . Şu anda kullanılan modeller arasında episkleral venlere 14 hipertonik salin enjeksiyonunu takiben trabeküler ağın sklerozu, mikroboncukların 15 veya viskoelastik maddelerin¹⁶ intrakameral enjeksiyonu, vorteks damarlarının^{koterizasyonu 17}, trabeküler ağın argon lazer 18 ile fotokoagülasyonu, circumlimbal sütür ¹⁹ ve yaşa bağlı OHT'nin transgenik bir modelinin (DBA/2J fareler) kullanımı yer ^almaktadır8. Bununla birlikte, invazivlik, korneanın postoperatif opaklaşması, ön segment bozulması, kapsamlı öğrenme eğrileri, pahalı ekipman ve oldukça değişken postoperatif GİB'ler, mevcut modellerle ilişkili bildirilen tuzaklardan birkaçı arasındadır ve bu sorunların üstesinden gelmek için alternatif bir OHT modelinin geliştirilmesini talep etmektedir^20,21,22.

Mevcut protokol, kemirgenlerde limbal pleksus koterizasyonuna (LPC) dayalı olarak glokoma vekil olarak OHT'yi indüklemek için yeni bir cerrahi prosedürü resmileştirmektedir²³. Bu, benzersiz bir şekilde yüksek bir tam klinik iyileşme oranı ile ilişkili, yüksek verimlilik ve düşük GİB yükselmesi değişkenliği sağlayan, dolayısıyla her deneyde kullanılan daha az sayıda hayvanda in vivo fonksiyonel değerlendirme sağlayan kolay, tekrarlanabilir, erişilebilir ve invaziv olmayan bir modeldir. Cerrahi teknik, akut açı kapanması glokomunda görülen hipertansif atağı modelleyen, birkaç gün içinde başlangıç seviyelerine kademeli bir dönüş ile subakut OHT'yi indükler. Ayrıca, modeldeki GİB iyileşmesini, GİB'nin yeterli kontrolüne rağmen birkaç insan glokomu vakasında meydana gelen RGC'lerin sekonder dejenerasyonunun gelecekteki mekanik çalışmaları için yararlı olan sürekli glokomatöz nörodejenerasyon takip eder.

Protokol

Tüm prosedürler, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) Oftalmik ve Görsel Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildiri'ye uygun olarak gerçekleştirildi ve Rio de Janeiro Federal Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'nden Bilimsel Deneylerde Hayvanların Kullanımına İlişkin Etik Komite tarafından onaylandı (protokol 083/17). Bu çalışmada, her iki cinsiyetten 2-3 aylık ve 180-320 g ağırlığındaki Lister Hooded sıçanlar kullanıldı. Bununla birlikte, prosedür çeşitli yaş aralıklarındaki farklı sıçan suşlarına uyarlanabilir.

1. Oküler hipertansiyon cerrahisi ve klinik takibi

1. Ev hayvanları, kontrollü bir sıcaklık ortamında ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsünde (6: ışık açık/ 6 pm: ışık kapalı) standart peletlenmiş gama ışınlanmış gıda (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brezilya) ve su (üçlü filtre, toksik olmayan aktif kömürlü) ad libitum mevcuttur.
2. Üç kısım %10 ketamin hidroklorür ve bir kısım %2 ksilazin hidroklorürden (seyreltici: steril su) oluşan bir stok anestezik kokteyl karışımı hazırlayın.
3. Sırt derisini tutarak hayvanı nazikçe kısıtlayın ve karışımın 1 μL / g vücut ağırlığının (ketamin: 75 mg / kg; ksilazin: 5 mg / kg) intraperitoneal uygulamasıyla anesteziyi indükleyin. Yaklaşık 5 dakika sonra ayak parmağını kıstırma tepkisi vererek uygun anesteziyi kontrol edin.
4. Proxymetakain hidroklorür% 0.5 göz damlası damlatarak her iki göz yüzeyini topikal olarak uyuşturun. 30-60 saniye bekleyin ve kalan çözeltiyi, küçük bir steril pamuklu çubukla nazal veya lateral bulbar konjonktivaya hafifçe dokunarak dünyanın ön yönünden çıkarın.
5. Kornea yüzeyine tonometrenin ucundan kolayca erişilebilecek şekilde hayvanı tezgah üzerinde ventral dekübit pozisyonuna yerleştirerek hem deneysel hem de kontralateral kontrol gözlerinin temel GİB'sini ölçün.
6. Aplanasyon veya geri tepme el tonometresi kullanın (Şekil 1A). Tonometre ucunu, merkezi kornea bölgesine dik olarak hafifçe dokunacak şekilde konumlandırın. Makine tarafından oluşturulan 3-5 güvenilir ortalamayı elde edin ve ortalamasını alın. Her ortalama, altı başarılı bireysel ölçümden sonra cihaz tarafından otomatik olarak hesaplanır.
   1. Geri tepme tonometresini bir probla yükleyin ve probun düşmesini önlemek için cihazın ucunu yukarı doğru yerleştirirken açmak için ölçüm düğmesine bir kez basın. Açıldıktan sonra, ekranda ekipmanın ölçüme hazır olduğunu gösteren 00 görüntülenecektir.
   2. Cihazı probun ucu korneadan 1-4 mm mesafede olacak şekilde konumlandırın ve ekipmanı hareket ettirmeden ölçüm düğmesine hızlı ve dikkatli bir şekilde basarak ölçümler alın. Her başarılı ölçüm kısa bir bip sesiyle tanımlanır ve altı kez sonra ortalama cihazın ekranında görüntülenir.
      NOT: Aplanasyon tonometresi ile uzun bir deneyime rağmen, tüm prosedürü optimize etmek için yazarlar, güvenilir GİB ölçümünün daha kolay elde edilmesini sağlayan bir geri tepme tonometresinin kullanılmasını önermektedir.
7. Hayvanı stereo mikroskop altında hafif bir lateral dekübit pozisyonuna yerleştirin ve deney gözünü 40x büyütmede inceleyerek ameliyatı dikkatlice planlayın. İşlem sırasında bir damla karmeloz sodyum veya sodyum hiyalüronat damlatılarak yağlanan kontralateral kontrol gözünü korumayı unutmayın.
8. Kavisli forseps yardımıyla, limbusun¹³ 360°'sini çevreleyen damar sistemini ortaya çıkarmak için deneysel göz küresini hafifçe ileri doğru itin. Öte yandan, korneanın etrafındaki damarları düşük sıcaklıkta oftalmik koter (1.300 °F; Bovie Medical, ABD) (Şekil 1B-E).
   NOT: Bahsedilen koter, limbal damar sistemine uzunlamasına temas etmesi gereken yuvarlak bir uca sahiptir.
9. Kornea çevresini koterize etmemeye dikkat edin, çünkü bu, retina fonksiyonunun in vivo değerlendirmesini engelleyen ameliyat sonrası kornea opaklaşmasına neden olabilir.
10. Başarılı bir cerrahi prosedürün belirtileri olan skleral limbusta küçük dairesel koterizasyon izlerinin ortaya çıktığını, limbal vaskülatürün obliterasyonunu ve ameliyat edilen gözde göz bebeği genişlemesini gözlemleyin.
    NOT: Sıçanların ve farelerin limbal damar sistemi anatomik olarak benzer olduğundan^13,24 ve kullanılan koterin hafif küçük bir ucu olduğundan^, bu protokol herhangi bir adaptasyon olmaksızın fare gözü için de işe yarayabilir.
11. Ameliyattan sonra, adım 1.5'te açıklandığı gibi her iki gözde de ameliyat sonrası GİB'yi kontrol edin.
12. Bir damla oftalmik prednizolon asetat (1.2 mg / mL) uygulayın ve bunu deney gözünün ön yüzeyi ile yaklaşık 40 saniye boyunca temas halinde tutun, daha sonra oftalmik bir antibiyotik merhemi ile değiştirin (oksitetrasiklin hidroklorür 30 mg / g artı polimiksin B 10.000 U / g; veya siprofloksasin 3.5 mg / g). İşlemden sonra ağrıyı önlemek için intramüsküler tramadol hidroklorür enjeksiyonu (tek doz; 2 mg / kg) yapın.
13. Tercihen ısıtma yastığı gibi sıcak bir ortamda veya uygun yataklı muhafaza kafesinin içinde anesteziden sonra hayvanın iyileşmesini yakından takip edin. Solunum düzenine dikkat edin.
14. Steroid olmayan bir antienflamatuar ilaçtan (NSAID, örneğin, ketorolak trometamol% 0.5 göz damlası) ve antibiyotik merhemden (tercihen ameliyattan hemen sonra kullanılanla aynı) oluşan topikal ilaçlarla deneysel gözün günlük klinik takibini yapın.
    NOT: Steroidal antienflamatuar göz damlası yerine NSAID kullanılması önerilir, çünkü ikincisi OHT'yi indükleyebilir ve kemirgenlerde glukokortikoid kaynaklı glokom modelleri için düzenli olarak uygulanır.
    1. Hafif sedasyon altında (ketamin: 18.75 mg / kg; ksilazin: 1.25 mg / kg), fizyolojik sirkadiyen GİB dalgalanmasından kaynaklanan önyargıyı önlemek için tercihen günün aynı döneminde GİB'yi ölçün.
    2. Oküler muayene sırasında, uveal prolapsus ile ilişkili hifema, kornea fibrozu veya skleral incelme gibi nadir klinik nükslere dikkat edin. Kornea ödemi, kemoz ve konjonktival hiperemi yaygındır ancak geçicidir.
    3. Ameliyat sonrası 7. günde tam klinik iyileşmeye dikkat edin. Limbal revaskülarizasyon genellikle ameliyattan sonraki ilk iki gün içinde, beklenen kademeli GİB'nin başlangıç seviyesine dönüşüne paralel olarak başlar.

2. Optomotor yanıt (OMR) analizi

NOT: Bu prosedür için özel bir sistem kullanılmıştır²⁵.

1. Ortada bir platform bulunan bir arenayı sınırlayan dört bilgisayar monitörünü dörtgen olarak düzenleyin. Monitörlerde, platformun etrafında sabit bir hızda (12 derece/sn) ve kontrastta (%100) dönen, dikey olarak yönlendirilmiş sinüs dalgası ızgaralarına (alternatif siyah beyaz çizgiler) sahip sanal bir silindirin görüntüsünü görüntüleyin.
2. Deneycinin hayvanın hareketlerini izlemesine izin vermek için platformun üzerine bir video kamera yerleştirin. Testi fotopik koşullarda gerçekleştirin ve her bir gözü ayrı ayrı değerlendirmek için yazılımı tercihen manuel/ayrı moda ayarlayın.
3. Hayvanların platformda yaklaşık 2 dakika alışmasına izin verin. Sanal silindirin merkezini gösterdiğinden, video karesi üzerindeki kırmızı artı işareti imlecini serbestçe hareket eden hayvanın gözleri arasında tutun (Şekil 1G)²⁵.
4. Dönen ızgaralar tarafından ortaya çıkarılan hayvanın başının ve boynunun refleksif bir takibinden oluşan OMR'yi gözlemleyin. Sinüs dalgası ızgaralarının yönlerini sırasıyla saat yönünde ve saat yönünün tersine çevirerek sol ve sağ görsel yolları test edin.
   1. Başlangıçta düşük uzamsal frekansa (0.042 döngü/derece) sahip bir uyaran sunun. Ardından, izleme hareketi artık fark edilmeyene kadar frekansı kademeli olarak artırın. Net bir OMR'nin ortaya çıktığı en yüksek uzamsal frekans, değerlendirilen gözün eşik uzamsal frekansına karşılık gelir.
   2. Hayvan sonunda muayene sırasında platformdan düşerse, hemen platforma geri koyun ve teste devam edin.

3. Desen-elektroretinogramın (PERG) kaydedilmesi

NOT: Elektroretinogram, sinyal işleme için özel bir sistem ve dalga formlarının depolanması ve analizi için ilgili yazılım kullanılarak kaydedilmiştir.

1. Hayvanları kas içi ketamin hidroklorür ve ksilazin hidroklorür (sırasıyla 75 mg / kg ve 5 mg / kg) enjeksiyonu ile derinlemesine uyuşturun. Derin anestezi (cerrahi düzlem), muayene sırasında istemsiz kas hareketleri veya alternatif gürültü kaynakları ile artefakt olasılığını azaltır. Ayak parmağını kıstırma tepkisi vererek uygun anesteziyi kontrol edin.
   NOT: Bahsedilen anestezik ajanlar yanıtın^{genliğini etkilemez 26}. Aktif elektrot olarak korneaya sokulan küçük bir iğne kullanıldığından, sıçanın bir rapel doza (başlangıç dozunun 1/2'si) ihtiyaç duyması durumunda yeniden enjekte edilmesi daha kolay olduğundan, intraperitoneal yerine kas içi anestezi tercih edilir, elektrot pozisyonunu değiştirme şansı daha düşüktür ve böylece tüm deney boyunca daha tekrarlanabilir kayıtlara yol açar, 60 dakikaya kadar sürebilir.
2. Korneayı topikal olarak %0.5'lik bir damla proxymetakain hidroklorür ile uyuşturun ve diğer gözü oftalmik kayganlaştırıcılarla nemlendirin.
3. Aktif elektrodu (paslanmaz çelik iğne 0,25 mm × 15 mm) korneanın temporal çevresine dikkatlice yerleştirin. Ek olarak, referans ve toprak elektrotlarını (paslanmaz çelik iğne 0,4 mm × 37 mm) sırasıyla ipsilateral temporal kantusun deri altı dokusuna ve arka bacaklardan birine yerleştirin (Şekil 1I).
4. PERG için, uyaranı sabit ortalama parlaklık (250 cd/m2) ile 15 ters çevirme/s'de dönüşümlü olarak siyah beyaz bir dama tahtasına ayarlayın. Bant geçiren filtreyi 1 Hz-100 Hz'e ayarlayın.
   NOT: Hızlı tersine çevirme uyaranı, büyük olasılıkla RGC biyoelektrik tepkisi ile ilişkili dalga bileşenini toplayan kararlı ve tekrarlanabilir bir sinüzoid olan kararlı durum PERG'yi üretir: geçici durum PERG'nin NII sapması.
5. Hayvanı uyaran ekranından 20 cm uzağa yerleştirin (LCD monitör 0,58 m; Şekil 1I), sinyal taban çizgisini izleyin ve toplama sistemindeki Analiz düğmesine basarak PERG alımını başlatın.
6. Prosedür sırasında, hayvanları çevresel ışığa (~140 lux beyaz ışık) adapte edin. Burada, altı farklı uzamsal frekans (derece başına döngü olarak: 0.018, 0.037, 0.073, 0.146, 0.292, 0.585) rastgele sırayla sunuldu.
   NOT: Sinyal işleme için kullanılan yazılım otomatik olarak ortalama alma işlemi gerçekleştirir. 200-300 bireysel dalganın ortalaması, gürültüden sıyrılmak ve dalga genliğini analiz etmek için yeterli kabul edildi.

4. Retinal ganglion hücreleri somaların miktar tayini

NOT: Aşağıdaki prosedür, beyne özgü homeobox/POU domain proteini 3A'ya (Brn3a) karşı bir antikorla retinal düz montajların immünohistokimyasal boyanmasına dayanan RGC somalarının miktar tayini içindir.

1. Deney hayvanlarını servikal çıkık ötenaziye maruz bırakın, ardından bilinç kaybına neden olmak için karbondioksit solunması.
2. Ötenaziden hemen sonra, dişli forseps ve kavisli makas kullanarak her iki gözü stereo mikroskop altında inceleyin.
3. Hem ekstraoküler kasların distal kısmı hem de karınkül dünyaya bağlı kalacak şekilde dikkatli diseksiyon yapın, çünkü bunlar retinanın topografik oryantasyonu için önemli yer işaretleridir (adım 4.5'te açıklanmıştır). Gelecekteki analizler için dünyaya bağlı optik sinirin bir bölümünü mümkün olduğunca uzun süre saklamaya çalışın.
4. Enükleasyondan sonra, gözleri 0.1 M fosfat tamponunda (PBS) 1 mL'lik %4 paraformaldehit (%4) çözeltisine yerleştirin ve uygun kimyasal fiksasyon için 24 saat bekletin.
5. Retinayı oküler dokuların geri kalanından ayırın.
   1. Diseksiyon mikroskobu altında göz küresini 1x PBS ile kaplı bir Petri kabına yerleştirin ve uygun topografik oryantasyon için nazal karunkül, koroid fissürleri ve girdap damarlarından skleral izler gibi önemli yer işaretlerine dikkat edin²⁷.
   2. Dişli forseps ve kavisli makas (westcott) kullanarak ön kamaraya merkezi korneadan nüfuz edin. Göz küresinin dorsal kadranını sınırlamak için skleranın üst (dorsal) yönüne, optik sinirin skleral foramenine doğru iki radyal kesim yapın.
   3. Korneayı skleral limbusta uzunlamasına 360°'lik bir kesi ile dünyanın geri kalanından ayırın. Lensi ve irisi çıkarın ve yukarıda açıklanan aynı skleral radyal sınırları kullanarak dorsal retinal kadranı sınırlandırın (adım 4.5.2).
   4. Retina dokusunu koroid ve skleradan dikkatlice ayırın, hem doku boyunca rastgele yırtılmalardan hem de nihai topografik oryantasyon kaybından kaçının.
   5. Siliyer gövdeyi retinal ora serrata'dan ayırın. Hem kavisli dişsiz forseps hem de kavisli makas (vitreusu çekin ve iç sınırlayıcı membrana yakın bir şekilde inceleyin) ve küçük bir fırça kullanarak kalan vitreus gövdesini retina kabından dikkatlice çıkarın.
      NOT: Vitreus mizahının çıkarılması, güçlü ve temiz bir immünohistokimyasal sinyal elde etmek için önemli bir adımdır.
6. İzole retinaları 1 mL 1x PBS içeren 24 oyuklu bir kültür plakasına (oyuk başına bir retina) aktarın ve iç retinayı yukarı bakacak şekilde tutun.
7. 1x PBS (0.3 mL) içinde seyreltilmiş iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ile 3x'i 10 dakika boyunca yıkayarak dokuyu geçirgenleştirin.% 0.5. Daha sonra dokuyu oda sıcaklığında 60 dakika boyunca iyonik olmayan yüzey aktif madde içinde% 5 sığır serum albümini (BSA),% 2 ve 1x PBS (bloke edici çözelti; 0.25 mL) içinde hafifçe çalkalayın.
8. Adım 4.7 sırasında, iyonik olmayan yüzey aktif madde %0.5 ve 1x PBS artı %5 BSA içinde 1:200 seyrelterek Brn3a birincil antikor çözeltisini hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
9. 60 dakikalık doku blokajından sonra, retinaları 0.2 mL primer antikor çözeltisinde 4 ° C'de 72 saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
10. Dokuyu 3x 1x PBS ile 10 dakika boyunca yıkayın, daha sonra dokuyu oda sıcaklığında 2 saat boyunca 1x PBS ve% 5 BSA'da 1:750 oranında seyreltilmiş 0.2 mL ikincil antikor çözeltisinde inkübe edin.
11. Ayrıca, floresan çekirdek boyama için dokuyu nükleer karşı leke çözeltisinde 10 dakika inkübe edin. İmmünohistokimyayı, 3x tekrarlanan 1x PBS (0.3 mL) ile son bir yıkama adımı ile sonlandırın.
12. Retinaları iki küçük fırça yardımıyla, vitreus tarafı yukarı bakacak şekilde cam mikroskop lamlarına aktarın. Dorsal retinal kadranı mikroskop slaytları üzerine yerleştirin (daha önce adım 4.5.3'te sınırlandırılmıştır). Diğer 3 kadranı (nazal, ventral ve temporal) sınırlamak için optik sinir kafasına doğru iki radyal kesim daha yapın.
    NOT: Kesim boyutları sabit değildir. Slayt üzerinde retinanın etkili bir şekilde düzleşmesini bozacak kadar kısa olmamalı ve optik sinir foramenine ulaşacak ve sınırlandırılmış retinal kadranı dokunun geri kalanından tamamen ayıracak şekilde çok uzun olmamalıdır.
13. Son olarak, bir cam lamel üzerine 0.2 mL antifade montaj ortamı uygulayın ve bunu doku mikroskobik analizi için düz monte edilmiş retinaya yerleştirin. RGC'lerin yoğunluğunu tahmin etmek için, düz bağlantıları 40x/1.3 objektif kullanarak konfokal epifloresan mikroskobu altında inceleyin.
14. Retinanın her çeyreği için sekiz fotoğraf çekin: ikisi merkezi retinadan (optik diskten ~ 0.9 mm), üçü orta retinadan (optik diskten ~ 2.0 mm) ve üçü periferik retinadan (optik diskten ~ 3.7 mm), retina başına toplam 32 fotoğraf. Brn3a-pozitif hücreleri saymak ve ortalama hücre yoğunluğunu tahmin etmek için FIJI yazılımını kullanın.

5. Optik sinirin incelenmesi

1. Ötenazi ve göz küresi enükleasyonundan sonra (adım 4.1-4.3), göz içi kısmın bir kısmı da dahil olmak üzere optik sinirin intraorbital kısmının proksimal segmentini (1-2 mm) çıkarın ve numuneleri hemen 2 saat boyunca 0.2-0.3 mL soğuk fiksatif (0.1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7.4)% 2.5 glutaraldehit çözeltisi) içeren şişelere/tüplere yerleştirin.
   NOT: Optik sinir işleme için aşağıdaki adımlar, adım 5.1'den itibaren aynı şişelerde/tüplerde gerçekleştirilir.
2. Malzemeyi 3x 5 dakika boyunca soğuk 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ile yıkayın. % 0.8 potasyum ferrosiyanür içinde% 1.0 osmiyum tetroksit ve 4 ° C'de (0.1-0.2 mL) 0.1 M sodyum kakodilat tamponu içinde seyreltilmiş 5 nM kalsiyum klorür çözeltisinde hafifçe çalkalama altında 1 saat boyunca dokuyu sabitleyin.
3. Optik sinir parçalarını 3x 5 dakika boyunca soğuk 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ile ve ardından soğuk damıtılmış su ile 3x 1 dakika yıkayın. Malzemeyi 4 °C'de (0.1-0.2 mL) boyama için damıtılmış suda %1.0 uranil asetat çözeltisinde hafifçe çalkalayarak gece boyunca tutun. Parçaları 3x soğuk damıtılmış suyla yıkayın.
4. Dokuyu kademeli bir aseton serisi (her biri 0.5 mL) ile aşamalı olarak dehidre edin, daha sonra damıtılmış suda aşağıdaki seyreltmelerin değiştirilmesiyle:% 15 buz gibi soğuk asetonda 2x 7 dakika inkübasyon; % 30 buz gibi asetonda 2x 7 dakika inkübasyon; % 50 buz gibi asetonda 2x 7 dakika inkübasyon; % 70 buz gibi asetonda 2x 7 dakika inkübasyon; % 80 buz gibi asetonda 2x 7 dakika inkübasyon; % 90 buz gibi asetonda 2x 7 dakika inkübasyon; Oda sıcaklığında (RT) %100 asetonda 2x 15 dakika inkübasyon.
5. Aşağıdaki çözeltilerin daha sonra değiştirilmesiyle 3 sızma / gömme adımı gerçekleştirin: 1 kısım epoksi reçine: 2 kısım aseton (toplam hacim: 0,5 mL), 12 saat boyunca RT'de; 1 kısım epoksi reçine: 1 kısım aseton (toplam hacim: 0,5 mL), RT'de 12 saat; 2 kısım epoksi reçine: 1 kısım aseton (toplam hacim: 0,5 mL), RT'de 12 saat. Son olarak, 24 saat boyunca RT'de saf epoksi reçine içinde dokuya sızın.
6. Numuneleri numune taşıyıcıdan çıkarın, gömme kalıplarına aktarın ve 60 °C'de 48 saat polimerize olmasına izin verin. Bir ultramikrotom kullanarak optik sinir parçalarının enine yarı ince kesitlerini (300-400 nm) kesin, toplayın ve bir mikroskop cam lamına aktarın. Kesitleri toluidin mavisi ile boyayın ve optik mikroskop kullanarak 100x büyütmede görüntüleyin.
7. Ultrastrüktürel analiz için ultra ince kesitler (70 nm) yapın, bunları bakır ızgaralarda toplayın ve uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyayın. Transmisyon elektron mikroskobunda kesitleri inceleyin.

Sonuçlar

Kantitatif değişkenler ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edilir. OHT ve kontrol grupları arasındaki GİB dinamiklerinin karşılaştırılması dışında (Şekil 1F), istatistiksel analiz iki yönlü ANOVA ve ardından Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak yapıldı. p değerinin 0.05< olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Şekil 1 , limbal damarların 360° termal kaynakl...

Tartışmalar

Limbal pleksus koterizasyonu (LPC), konjonktival veya zıvana diseksiyonu gerektirmeyen, kolay erişilebilir vasküler yapıları hedefleme avantajına sahip yeni bir trabeküler modeldir^17,28. Koroid venöz drenajın cerrahi bozukluğuna dayanan ünlü bir OHT modeli olan vorteks venler koterizasyon modelinden farklı olarak, limbal venler sulu mizah çıkışında yukarı akışta yer aldığından, venöz tıkanıklığın LPC modelinde GİB artışını etkil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Isofar	201	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography	Hansol Medical Co	-	Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon	Novartis Biociências S/A	MS-1.0068.1087	Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride	Vetec	560	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx	Bovie Medical Corporation	AA00	Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin	Syntec do Brasil Ltda	000200-3-000003	Ketamine hydrochloride 10%
DAKO	Dako North America	S3023	Antifade mounting medium
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0487	Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin	Polysciences, Inc.	-	Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16110	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-8042140002	Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab	Icare Finland Oy	TV02 (model number)	Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches	Samsung Electronics Co. Ltd.	S23B550	Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta	Carl Zeiss	-	Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0489	Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K	Nihon Kohden Corporation	-	System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33	Nihon Kohden Corporation	-	Software for electroretinogram signal processing
Optomotry	CerebralMechanics	-	System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide	Electron Microscopy Sciences	20150	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography	Chalgren Enterprises	110-63	Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	12300	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-1.0497.1287	Prednisolone acetate 0.12%
Terolac	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0497.1286	Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina	Laboratórios Pfizer Ltda	MS-1.0216.0024	Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL	Reichert Technologies	230635	Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	Non-ionic surfactant
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin	Syntec do Brasil Ltda	7899	Xylazine hydrochloride 2%
	Carl Zeiss	-	Stereo microscope for surgery and retinal dissection