角膜缘血管丛全圆烧灼治疗啮齿动物手术诱发的青光眼

摘要

该协议的目的是表征一种基于角膜缘血管丛 360° 热烧灼的青光眼性神经退行性变性的新模型，诱导亚急性高眼压症。

摘要

青光眼是全球第二大失明原因，是一组异质性眼部疾病，其特征是视神经结构损伤和视网膜神经节细胞 （RGC） 变性，通过中断视觉信息从眼睛到大脑的传递而导致视觉功能障碍。眼压升高是最重要的危险因素;因此，已经通过遗传或实验方法在啮齿动物中开发了几种高眼压模型来研究疾病的原因和影响。其中，已经报告了一些局限性，例如手术侵入性、功能评估不足、需要广泛培训以及视网膜损伤的高度可变扩展。本工作描述了一种简单、低成本和高效的诱发啮齿动物高眼压的方法，该方法基于角膜缘血管丛的低温、全圆烧灼，角膜缘血管丛是房水引流的主要成分。新模型提供了一种技术上简单、无创且可重复的亚急性高眼压症，与进行性 RGC 和视神经变性相关，以及独特的术后临床恢复率，允许通过电生理学和行为学方法 进行体内 功能研究。

引言

医学文献将青光眼理解为一组异质性视神经病，其特征是视网膜神经节细胞 （RGC）、树突、体细胞和轴突进行性变性，导致视盘结构拔罐（挖掘）和视神经功能退化，通过中断视觉信息从眼睛到大脑的传递，导致不受控制的病例黑朦¹.青光眼是目前全球不可逆转性失明的最常见原因，预计到 2040 年将达到约 1.118 亿人²，从而严重影响患者的生活质量 （QoL），并导致重大的社会经济问题³。

眼内压 （IOP） 升高是青光眼发生和进展的最重要且唯一可改变的危险因素之一。在多种类型的青光眼中，除正常张力型青光眼 （NTG） 外，所有青光眼在临床病史中的某个时间都与眼压升高有关。尽管在靶向眼压和减缓或阻止疾病进展方面取得了显着的临床和手术进展，但患者仍然因青光眼而失明 ^4,5。因此，彻底了解这种疾病的复杂和多因素病理生理学对于开发更有效的治疗方法至关重要，特别是为RGC提供神经保护。

在了解疾病机制的各种实验方法中，基于高眼压症（OHT）的动物模型与人类青光眼最为相似。啮齿动物模型特别有用，因为它们成本低，易于操作，可以进行基因操作，寿命短，并且具有与人类相当的眼部解剖学和生理学特征，例如房水产生和引流6,7,8,9,10,11,12,13 .目前使用的模型包括将高渗盐水注射到巩膜外静脉后小梁网硬化¹⁴、前房内注射微珠 15 或粘弹性物质 16、涡静脉烧灼 ¹⁷、用氩激光光凝小梁网 18、环缘缝合¹⁹，以及使用年龄相关 OHT 的转基因模型（DBA/2J 小鼠）⁸.然而，侵入性、术后角膜混浊、眼前节破坏、广泛的学习曲线、昂贵的设备和高度可变的术后眼压是与当前模型相关的少数报告陷阱之一，因此需要开发 OHT 的替代模型来克服这些问题^20,21,22。

本方案正式确定了一种新的外科手术，以诱导 OHT 作为青光眼的代理，基于啮齿动物的角膜缘丛烧灼 （LPC）²³。这是一种简单、可重复、可访问且非侵入性的模型，可提供高效率和低 IOP 升高的变异性，与独特的高临床完全恢复率相关，因此在减少每个实验中使用的动物数量的情况下提供 体内 功能评估。手术技术诱导亚急性 OHT，并在几天内逐渐恢复到基线水平，这模拟了急性闭角型青光眼中可见的高血压发作。此外，模型中的眼压恢复之后是持续的青光眼性神经变性，这对于未来 RGC 继发性变性的机制研究很有用，尽管 IOP 得到充分控制，但 RGC 的继发性变性发生在几例人类青光眼病例中。

研究方案

所有程序均按照视觉和眼科研究协会 （ARVO） 的《在眼科和视觉研究中使用动物的声明》进行，并得到里约热内卢联邦大学健康科学中心科学中心动物使用伦理委员会的批准（协议 083/17）。在本研究中，使用了两性李斯特帽大鼠，年龄为2-3个月，体重为180-320克。然而，该程序可以适用于不同年龄范围的不同大鼠品系。

1. 高眼压手术及临床随访

1. 家畜在受控温度环境和 12 小时光/暗循环（早上 6 点:开灯/下午 6 点:关灯）中，使用标准颗粒伽马辐照食品（Nuvilab® CR-1，Quimtia S/A，巴西）和水（三重过滤器，含无毒活性炭） 随意提供。
2. 准备由三份10%盐酸氯胺酮和一份2%盐酸甲苯噻嗪（稀释剂:无菌水）组成的储备麻醉剂混合物。
3. 通过握住背部皮肤轻轻约束动物，并通过腹膜内施用1μL/ g体重的混合物（氯胺酮:75mg / kg;甲苯噻嗪:5mg / kg）诱导麻醉。大约 5 分钟后通过执行脚趾捏合反应检查麻醉是否正确。
4. 通过滴注盐酸丙美卡因 0.5% 滴眼液局部麻醉双眼表面。等待30-60秒，用小无菌棉签轻轻触摸鼻结膜或外侧球结膜，从球体前部除去剩余的溶液。
5. 通过将动物置于工作台上的腹侧褥疮位置来测量实验和对侧对照眼的基线眼压，使角膜表面易于接近眼压计的尖端。
6. 使用压平或回弹手持式眼压计（图1A）。放置眼压计尖端，使其略微垂直接触中央角膜区域。获取并平均 3-5 个可靠的机器生成的平均值。每个平均值在六次成功的单独测量后由设备自动计算。
   1. 用探头装入回弹眼压计并按一次测量按钮将其打开，同时将设备的尖端向上放置，以避免探头掉落。开机后，显示屏显示 00，表示设备已准备好测量。
   2. 将带有探头尖端的设备放置在距离角膜 1-4 毫米处，并在不移动设备的情况下快速小心地按下测量按钮来获取测量值。每个成功的测量都会通过一声短促的哔哔声来识别，六次后，平均值会显示在设备的屏幕上。
      注意:尽管在压平眼压计方面有长期经验，但为了优化整个过程，作者建议使用反跳眼压计，这样可以更容易地获得可靠的眼压测量值。
7. 将动物置于立体显微镜下的轻微侧卧位，并通过以40倍放大倍率检查实验眼来仔细计划手术。不要忘记在手术过程中通过滴入一滴羧甲基纤维素钠或透明质酸钠来保持对侧对照眼的润滑。
8. 借助弯曲的镊子，轻轻向前推动实验眼球，以暴露围绕角膜缘 360° 的脉管系统¹³.另一方面，用低温眼科烧灼（1,300°F;Bovie Medical，美国）（图1B-E）。
   注意:提到的烧灼器有一个圆形尖端，应纵向接触角膜缘脉管系统。
9. 注意不要烧灼角膜周边，因为这可能导致术后角膜混浊，从而妨碍对视网膜功能进行 体内 评估。
10. 观察巩膜缘上烧灼的小圆形痕迹的出现、角膜缘脉管系统的闭塞和手术眼的瞳孔散大，这些都是外科手术成功的迹象。
    注意:由于大鼠和小鼠的角膜缘脉管系统在解剖学上相似^13,24，并且使用的烧灼具有温和的小尖端，因此该协议也可以适用于小鼠眼睛^，而无需任何调整。
11. 手术后，检查双眼术后即时眼压，如步骤1.5所述。
12. 滴眼用醋酸泼尼松龙（1.2 mg/mL），并将其与实验眼的前表面接触约40秒，然后用抗生素眼药膏（盐酸土霉素30mg/g加多粘菌素B 10,000 U/g;或环丙沙星3.5mg/g）代替。肌内注射盐酸曲马多（单剂量;2 mg/kg）以防止手术后疼痛。
13. 密切跟踪动物从麻醉中恢复的情况，最好在温暖的环境中，如加热垫或在有适当垫料的笼子里。注意呼吸模式。
14. 使用由非甾体抗炎药（NSAID，例如酮咯酸氨丁三醇 0.5% 滴眼液）和抗生素软膏（最好是手术后立即使用的相同药物）组成的局部药物对实验眼进行每日临床随访。
    注意:建议使用非甾体抗炎药水而不是甾体抗炎滴眼液，因为后者可能会诱导 OHT，并且经常用于啮齿动物糖皮质激素诱导的青光眼模型。
    1. 在轻度镇静（氯胺酮:18.75 mg/kg;甲苯噻嗪:1.25 mg/kg）下，优先在一天中的同一时间段测量眼压，以避免生理性昼夜节律眼压波动引起的偏差。
    2. 在眼部检查期间，注意罕见的临床并发，例如与葡萄膜脱垂相关的前房积血、角膜纤维化或巩膜变薄。角膜水肿、水肿和结膜充血很常见，但只是暂时的。
    3. 注意术后第 7 天左右完全恢复临床。角膜缘血运重建通常在手术后的前两天开始，与预期的眼压逐渐恢复到基线一致。

2. 光运动反应（OMR）分析

注:对于此过程，使用了特定系统²⁵。

1. 将四台电脑显示器布置成一个四边形，以中间的平台划分出一个竞技场。在显示器上，显示具有垂直正弦波光栅（交替的黑白条纹）的虚拟圆柱体的图像，以固定速度（12度/秒）和对比度（100%）围绕平台旋转。
2. 在平台上方放置一个摄像机，让实验者观察动物的动作。在明视条件下进行测试，并将软件优先设置为手动/单独模式，以便分别评估每只眼睛。
3. 让动物在平台上习惯约2分钟。将红色十字准线光标保持在自由移动动物眼睛之间的视频帧上，因为它指示虚拟圆柱体的中心（图1G）²⁵。
4. 观察OMR，包括由旋转光栅引起的对动物头部和颈部的反射跟踪。通过分别顺时针和逆时针旋转正弦波光栅的方向来测试左侧和右侧视觉通路。
   1. 最初呈现低空间频率（0.042 个周期/度）的刺激。然后，逐渐增加频率，直到不再注意到跟踪运动。引发清晰 OMR 的最高空间频率对应于被评估眼睛的阈值空间频率。
   2. 如果动物最终在检查过程中从平台上掉下来，请立即将其送回平台并继续测试。

3. 记录模式-视网膜电图 （PERG）

注:视网膜电图是使用用于信号处理的特定系统和用于存储和分析波形的相关软件记录的。

1. 通过肌肉注射盐酸氯胺酮和盐酸甲苯噻嗪（分别为75mg / kg和5mg / kg）深度麻醉动物。深度麻醉（手术平面）可减少检查过程中不自主肌肉运动或其他噪音源产生伪影的机会。通过执行脚趾捏合反应来检查麻醉是否正确。
   注意:上述麻醉剂不影响反应的幅度²⁶.由于插入角膜的小针被用作活性电极，因此首选肌内麻醉而不是腹膜内麻醉，因为在大鼠需要加强剂量（初始剂量的 1/2）时更容易重新注射，修改电极位置的机会较低，从而在整个实验过程中导致更可重复的记录， 可能持续长达 60 分钟。
2. 用一滴盐酸丙美卡因 0.5% 局部麻醉角膜，并用眼科润滑剂保持眼对侧湿润。
3. 小心地将有源电极（不锈钢针 0.25 毫米× 15 毫米）插入角膜的颞周。此外，将参比电极和接地电极（不锈钢针0.4 mm×37 mm）分别插入同侧颞眦的皮下组织和后肢之一（图1I）。
4. 对于 PERG，将刺激设置为黑白保留棋盘，以 15 次反转/秒和恒定的平均亮度 （250 cd/m2） 交替进行。将带通滤波器设置为 1 Hz-100 Hz。
   注意:快速反转刺激产生稳态 PERG，这是一种稳定且可重复的正弦波，它收集了最有可能与 RGC 生物电响应相关的波分量:瞬态 PERG 的 NII 偏转。
5. 将动物放置在距离刺激屏幕20厘米处（液晶显示器0.58 m;图1I），监控信号基线，然后按采集系统上的分析按钮开始PERG采集。
6. 在手术过程中，使动物适应环境光（~140勒克斯的白光）。在这里，以随机顺序呈现了六个不同的空间频率（以每度周期为单位:0.018、0.037、0.073、0.146、0.292、0.585）。
   注意: 用于信号处理的软件会自动执行平均。200-300 个单个波的平均值被认为足以从噪声中脱颖而出并分析波幅。

4. 视网膜神经节细胞体细胞的定量

注:以下程序用于定量 RGC 胞体，基于使用针对脑特异性同源盒/POU 结构域蛋白 3A （Brn3a） 的抗体对视网膜扁平支架进行免疫组织化学染色。

1. 对实验动物进行颈椎脱位安乐死，然后吸入二氧化碳以诱导昏迷。
2. 安乐死后，立即在立体显微镜下使用齿镊子和弯曲剪刀解剖双眼。
3. 仔细解剖，使眼外肌的远端部分和痈保持附着在眼球上，因为它们是视网膜地形方向的重要标志（在步骤4.5中描述）。尽量延长附着在眼球上的一段视神经，以备将来分析。
4. 摘除后，将眼睛置于 0.1 M 磷酸盐缓冲液 （PBS） 中 4% 多聚甲醛 （4% PFA） 的 1 mL 溶液中，并保持 24 小时以进行适当的化学固定。
5. 将视网膜与其他眼组织分开。
   1. 在解剖显微镜下，将眼球置于覆盖有 1x PBS 的培养皿中，并注意重要的标志，例如鼻痈、脉络膜裂和涡脉的巩膜印记，以获得正确的地形方向²⁷。
   2. 使用齿形镊子和弯曲剪刀（Westcott）从中央角膜穿透前房。在巩膜的上（背）侧，朝向视神经的巩膜孔做两个径向切口，以划定眼球的背象限。
   3. 通过巩膜缘的纵向 360° 切口将角膜与地球的其余部分分开。取下晶状体和虹膜，并使用上述相同的巩膜径向分界线划定视网膜背侧象限（步骤4.5.2）。
   4. 小心地将视网膜组织从脉络膜和巩膜上分离，避免整个组织的随机撕裂伤和最终的地形迷失方向。
   5. 将睫状体与视网膜 或锯齿分离。使用弯曲的无齿镊子加弯曲的剪刀（拉动玻璃体并将其解剖到靠近内部限制膜）和小刷子小心地从视网膜杯中取出剩余的玻璃体。
      注意:去除玻璃体是获得强大而干净的免疫组织化学信号的重要步骤。
6. 将分离的视网膜转移到含有 1 mL 1x PBS 的 24 孔培养板（每孔一个视网膜）中，并保持内视网膜朝上。
7. 用在1x PBS（0.3mL）中稀释的0.5%非离子表面活性剂洗涤3x，使组织透化10分钟。然后在室温下，在非离子表面活性剂2%和1x PBS（封闭溶液;0.25mL）中的5%牛血清白蛋白（BSA）中轻轻摇动组织60分钟。
8. 在步骤4.7中，通过在0.5%非离子表面活性剂和1x PBS加5%BSA中以1:200稀释来制备Brn3a一抗溶液，并将其储存在4°C。
9. 组织阻断60分钟后，将视网膜在0.2mL一抗溶液中在4°C孵育72小时，轻轻摇动。
10. 用 1x PBS 洗涤组织 3 次 10 分钟，然后在室温下将组织在 0.2 mL 的二抗溶液中孵育 2 小时，该溶液在 1x PBS 加 5% BSA 中以 1:750 稀释。
11. 此外，将组织在核复染溶液中孵育10分钟，用于荧光核染色。用1x PBS（0.3mL）重复3次进行最后的洗涤步骤，结束免疫组化。
12. 借助两把小刷子将视网膜转移到玻璃显微镜载玻片上，保持玻璃体面朝上。将视网膜背侧象限放在显微镜载玻片上（先前在步骤4.5.3中分隔）。朝视神经头再做两个径向切口，以划定其他 3 个象限（鼻、腹和颞）。
    注意: 切割尺寸不是固定的。它们不应太短，以免损害载玻片上视网膜的有效平坦化，也不应太长，以免到达视神经孔并将划定的视网膜象限与组织的其余部分完全分开。
13. 最后，在玻璃盖玻片上涂上 0.2 mL 抗淬灭封固剂，并将其放在平坦的视网膜上进行组织显微镜分析。要估计RGC的密度，请使用40x / 1.3物镜在共聚焦落射荧光显微镜下检查平面支架。
14. 对于视网膜的每个象限，拍摄八张照片:两张来自中央视网膜（距视盘~0.9 mm），三张来自视网膜中部（距视盘~2.0 mm），三张来自周边视网膜（距视盘~3.7 mm），每张视网膜共计 32 张照片。使用FIJI软件对Brn3a阳性细胞进行计数并估计平均细胞密度。

5.视神经检查

1. 安乐死和眼球摘除术（步骤4.1-4.3）后，去除视神经眶内部分（1-2mm）的近端段，包括部分眼内部分，并立即将样品放入含有0.2-0.3mL冷固定剂（2.5%戊二醛溶液在0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中）的小瓶/管中2小时。
   注意:以下视神经处理步骤在步骤 5.1 中的相同小瓶/管中执行
2. 用冷的0.1M二甲胂酸钠缓冲液洗涤材料3次5分钟。在1.0%四氧化锇的0.8%亚铁氰化钾和5nM氯化钙在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中稀释的溶液中轻轻摇动固定组织1小时，在4°C（0.1-0.2mL）。
3. 用冷的0.1M二甲胂酸钠缓冲液洗涤视神经碎片3次5分钟，然后用冷蒸馏水洗涤3次，持续1分钟。在1.0%醋酸铀酰的蒸馏水溶液中轻轻摇动下将材料保存过夜，以便在4°C（0.1-0.2mL）下染色。用冷蒸馏水洗涤片段 3 次。
4. 用分级丙酮系列（每个0.5mL）逐渐脱水组织，随后在蒸馏水中替换以下稀释液:在15%冰冷的丙酮中孵育2x 7分钟;在30%冰冷的丙酮中孵育2x 7分钟;在50%冰冷的丙酮中孵育2x 7分钟;在70%冰冷的丙酮中孵育2x 7分钟;在80%冰冷的丙酮中孵育2x 7分钟;在90%冰冷的丙酮中孵育2x 7分钟;在室温（RT）下在100%丙酮中孵育2x 15分钟。
5. 执行 3 个浸润/包埋步骤，随后更换以下溶液:1 份环氧树脂:2 份丙酮（总体积:0.5 mL），室温 12 小时;1份环氧树脂:1份丙酮（总体积:0.5mL），室温12小时;2份环氧树脂:1份丙酮（总体积:0.5mL），室温12小时。最后，在室温下将组织浸润在纯环氧树脂中24小时。
6. 从样品载体中取出样品，将它们转移到包埋模具中，并使其在60°C下聚合48小时。 使用超薄切片机切割视神经碎片的横向半薄片（300-400nm），收集并将它们转移到显微镜载玻片上。用甲苯胺蓝染色切片，并使用光学显微镜在100倍放大倍率下成像。
7. 对于超微结构分析，进行超薄横截面 （70 nm），将它们收集在铜网格上，然后用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。在透射电子显微镜中检查切片。

结果

定量变量表示为平均值±均值标准误差 （SEM）。除了OHT组和对照组之间的IOP动态比较（图1F）外，使用双向方差分析进行统计分析，然后进行Sidak的多重比较检验。p 值< 0.05 被认为具有统计学意义。

图 1 说明了全圆角膜缘神经丛烧灼术 （LPC） 模型的手术步骤，具有重要的标志，例如 360° 热诱导的角膜缘血管消失，以及手术结束时?...

讨论

角膜缘丛烧灼术 （LPC） 是一种新型的后小梁模型，其优点是它针对不需要结膜或肌腫夹层的易于接近的血管结构^17,28。与涡旋静脉烧灼模型（一种基于脉络膜静脉引流手术损伤的著名 OHT 模型）不同，静脉淤血预计不会影响 LPC 模型中的眼压升高，因为角膜缘静脉位于房水流出的上游。此外，它在技术上易于学习且成本低廉，主要需要低温热烧灼器。此...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Isofar	201	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Active electrode for electroretinography	Hansol Medical Co	-	Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm
Anestalcon	Novartis Biociências S/A	MS-1.0068.1087	Proxymetacaine hydrochloride 0.5%
Calcium chloride	Vetec	560	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx	Bovie Medical Corporation	AA00	Low-temperature ophthalmic cautery
Cetamin	Syntec do Brasil Ltda	000200-3-000003	Ketamine hydrochloride 10%
DAKO	Dako North America	S3023	Antifade mounting medium
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm
Ecofilm	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0487	Carmellose sodium 0.5%
EPON Resin	Polysciences, Inc.	-	Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16110	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Hyabak	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-8042140002	Sodium hyaluronate 0.15%
Icare Tonolab	Icare Finland Oy	TV02 (model number)	Rebound handheld tonometer
IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	Secondary antibody solution
LCD monitor 23 inches	Samsung Electronics Co. Ltd.	S23B550	Model LS23B550, for electroretinogram recording
LSM 510 Meta	Carl Zeiss	-	Confocal epifluorescence microscope
Maxiflox	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0489	Ciprofloxacin 3.5 mg/g
MEB-9400K	Nihon Kohden Corporation	-	System for electroretinogram recording
monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a primary antibody solution
Neuropack Manager v08.33	Nihon Kohden Corporation	-	Software for electroretinogram signal processing
Optomotry	CerebralMechanics	-	System for optomotor response analysis
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Potassium ferrocyanide	Electron Microscopy Sciences	20150	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Reference and ground electrodes for electroretinography	Chalgren Enterprises	110-63	Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm
Sodium cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	12300	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Ster MD	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-1.0497.1287	Prednisolone acetate 0.12%
Terolac	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0497.1286	Ketorolac trometamol 0.5%
Terramicina	Laboratórios Pfizer Ltda	MS-1.0216.0024	Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g
Tono-Pen XL	Reichert Technologies	230635	Digital applanation handheld tonometer
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	Non-ionic surfactant
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)
Xilazin	Syntec do Brasil Ltda	7899	Xylazine hydrochloride 2%
	Carl Zeiss	-	Stereo microscope for surgery and retinal dissection