بصريات غير خطية خالية من الملصقات لدراسة العيوب المعتمدة على التوبولين في المايلين المركزي

Summary

في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا للكشف عن الخلايا قليلة التغصن المحملة بالأنابيب الدقيقة في نموذج لاعتلال الأنابيب من خلال نهج الفحص المجهري التوافقي الثاني البسيط والمبتكر.

Abstract

يمثل التصور المرضي للمكونات الهيكلية الخلوية في الدماغ تحديا. إن التوزيع في كل مكان لشبكات الأنابيب الدقيقة والشعيرات الدقيقة والخيوط الوسيطة في جميع الأنسجة العصبية ، جنبا إلى جنب مع التباين في نتائج استراتيجيات اندماج البروتين الفلوري وقابليتها المحدودة للتطبيق على الدراسات الديناميكية للأجسام المضادة والأدوية كمركبات كروموفور ، تجعل الأساليب البصرية الكلاسيكية ليست فعالة مثل البروتينات الأخرى. عندما يحتاج التوبولين إلى الدراسة ، فإن الجيل الخالي من الملصقات من التوافقيات الثانية يعد خيارا مناسبا جدا بسبب التنظيم غير المتماثل للجزيء. يمكن لهذه التقنية ، عند اقترانها بالفحص المجهري ، أن تصف نوعيا التوزيع الحجمي للحزم المتوازية من الأنابيب الدقيقة في العينات البيولوجية ، مع ميزة إضافية تتمثل في العمل مع الأنسجة الطازجة غير الثابتة وغير المنفذة. يصف هذا العمل كيفية تصوير التوبولين باستخدام إعداد مجهري تجاري من الجيل التوافقي الثاني لتسليط الضوء على الأنابيب الدقيقة في الهياكل المخصبة بالأنبوبين في الخلايا قليلة التغصن ، كما هو الحال في نقص الميالين مع ضمور العقد القاعدية والمخيخ (H-ABC) اعتلال الأنابيب ، وهو اضطراب المايلين الموصوف مؤخرا.

Introduction

التصوير البصري للهياكل الهيكلية الخلوية في الأنسجة ومستحضرات الأعضاء ليست مهمة سهلة. خيوط الهيكل الخلوي موجودة في كل مكان ، لذلك إذا تم إجراء تلطيخ عام ، على سبيل المثال ، ضد ألفا توبولين أو بيتا أكتين أو يحتمل أن يكون الكيراتين في عينة ظهارية ، فمن المحتمل أن يتم توزيع الإشارة بشكل متجانس إلى حد ما في جميع أنحاء العينة. لتقييد التلوين إلى مجموعة فرعية أكثر وضوحا من المكونات الخلوية ، يمكن للمرء إما استخدام الفئران المعدلة وراثيا مع التعبير المستهدف¹ أو التخطيط لاستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالشكل المتساوي. في حين أن عددا قليلا جدا من هذه الأخيرة موجودة في السوق (ويوجد عدد قليل جدا منها على الإطلاق²،³،⁴) ^، قد يتوفر نموذج حيواني معدل وراثيا. ومع ذلك ، يجب أن يحصل عليها المختبر وأن يتم إيواؤها بشكل صحيح ، مع جميع النفقات التي تنطوي عليها العملية. قد تكون بعض الأجسام المضادة أو المواد الكيميائية ، على سبيل المثال ، الأدوية المترافقة بالفلوروفور مثل phalloidin أو paclitaxel ، غير متوافقة جزئيا أو كليا مع الاستخدام في الخلايا أو الأنسجة الحية ، مما يحد من قابليتها للتطبيق على دراسات العينات الثابتة فقط.

في حالة التوبولين ، يجب أخذ جانب إضافي في الاعتبار ، وهو حساسية البوليمر للتثبيت. من المعروف أن التثبيت الكيميائي التقليدي بالفورمالديهايد غير كاف للحفاظ على سلامة الأنابيب الدقيقة على النحو الأمثل⁵. بالإضافة إلى ذلك ، يؤكد تقرير حديث أن تشابك الفورمالديهايد يؤدي إلى تغييرات طفيفة في البنية التحتية للأنابيب الدقيقة ، على غرار ما يحدث مع ربط بعض الأدوية أو الجزيئات الفسيولوجية مثل GTP⁶.

لذلك ، غالبا ما يكون التصور المباشر للأنابيب الدقيقة في العينات غير الملوثة وغير الثابتة أمرا مرغوبا فيه. لتحقيق ذلك ، فإن أحد الحلول التقنية هو الفحص المجهري^للجيل التوافقي الثاني (SHG) 7 ، والذي يعتمد على قدرة حزم الأنابيب الدقيقة المتوازية على العمل كهارمونوفور وإصدار ضوء مضاعف التردد عند إضاءته بشكل صحيح باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي المكثف. على الرغم من أنه يمكن توليد إشارة توافقية ثانية أقوى وأكثر استقرارا من الكولاجين والميوسين ، وهما المادتان البيولوجيتان الأخريان الوحيدتان المعروفتان بأنهما قادران على مضاعفة التردد ، فقد تم استخدام الإشارة من التوبولين حتى الآن في الغالب لدراسة إعادة ترتيب المغزل الانقسامي⁸،⁹،¹⁰ ومورفولوجيا الأنابيب الدقيقة المحورية¹¹،^12،13.

في هذا العمل ، نقدم استخداما جديدا لمجهر SHG كأداة تشخيصية لتمييز أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS) المتأثرة باعتلال الأنابيب tubulin beta 4 A (TUBB4A) عن نظيراتها الصحية¹⁴. بعض الطفرات التي تحدث في هذا الشكل العصبي في الغالب من التوبولين ، مثل تلك التي تسبب نقص الميالين وضمور العقد القاعدية والمخيخ (H-ABC) ، تحفز الأنابيب الدقيقة على ملء الخلايا قليلة التغصن^15,16 ؛ ترتبط التغيرات الهيكلية الخلوية ، بدورها ، بتأثيرات المصب مثل خلل الميالين ، مع ضعف عميق في المسارات الحركية والحسية¹⁶،¹⁷،^18،19. يعرض نموذج الفئران التايب المستخدم في هذا العمل محتوى الأنابيب الدقيقة غير الطبيعي في الخلايا قليلة التغصن ويلخص معظم الأعراض الحسية الحركية لمرضى H-ABC¹⁷. يشرح البروتوكول كيفية تصوير الهياكل مثل الجسم الثفني والمخيخ ، والتي عادة ما تكون شديدة الميالين والتي تتأثر بشدة في المرضى من البشر وكذلك في فأر تايب ¹⁹ ، لتسليط الضوء على الاختلافات في إشارات SH بين الأنسجة السليمة والمتحولة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للقوانين والمدونات المعتمدة في العنوان السابع من لائحة قانون الصحة العامة فيما يتعلق بالبحوث الصحية للحكومة المكسيكية (NOM-062-ZOO-1999) ووفقا لتوصيات المعاهد الوطنية للصحة دليل رعاية واستخدام التجارب وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات البيولوجيا في أبحاث جامعة غواناخواتو وجامعة بينيميريتا المستقلة بويبلا.

1. إعدادات المجهر

1. قم بتشغيل نظام الفحص المجهري.
2. قم بتشغيل الليزر النبضي للتأكد من أنه سيكون جاهزا للتفريغ بمستوى طاقة مثالي وثابت بعد استخراج العينة وتحضيرها.
3. اضبط الليزر على 810 نانومتر. لدراسة الأنابيب الدقيقة tissular ، يتم استخدام 10 ٪ -20 ٪ من طاقة الليزر المتاحة ، والتي ، في النظام الموصوف ، تتوافق مع 13-26 ميغاواط تقاس في المستوى البؤري الخلفي للهدف.
4. تأكد من أن المجهر محاذ لكوهلر (الملف التكميلي 1) ، مع الهدف الذي سيتم استخدامه لتصوير SHG.
   ملاحظة: هذا مهم لأنه في الإعداد التجاري المستخدم في هذا العمل ، يتم إجراء الكشف في وضع الإرسال ومن خلال المكثف.
5. قم بإزالة المرشحات غير المرغوب فيها من مسار الكشف البصري (الشكل 1 أ).
6. تأكد من فتح غشاء المكثف بالكامل لضمان عدم توقف أي ضوء دون داع عند هذا المستوى.
7. قم بإعداد هدف غمر الزيت بفتحة عددية 25x/0.8 (NA) مع قطرة صغيرة من زيت الغمر في العدسة.
   ملاحظة: تم استخدام هذا الهدف لمطابقة المكثف NA بشكل أفضل ، والذي كان 0.55 (من الناحية المثالية ، NA_cond ≥ NA_obj).

2. الضوابط الأولية المجهر

ملاحظة: قم بإجراء عناصر التحكم المجهرية الأولية مرة واحدة، ما لم يتم تعديل الإعداد.

1. صورة نشا الذرة الجافة محصورة بين الشرائح الزجاجية مع معلمات SHG لإنشاء صور SHG التي تكشف عن اتجاه استقطاب الليزر. اتبع الخطوات المذكورة في الملف التكميلي 2 ، باستثناء طاقة الليزر ، والتي تقل عن 5٪ لنشا الذرة.
2. التقط صورة واحدة لحبيبات نشا الذرة المتناثرة ، وحدد اتجاه فصيصات SHG في المستوى x-y. يتوافق هذا الاتجاه مع اتجاه الليزر (الشكل 2 أ).
3. كعنصر تحكم ، التقط صورة أخرى لنفس العينة ، وأدخل في المسار البصري لوحة نصف موجة (الموضع الموضح في الشكل 1 أ) لتغيير اتجاه تذبذب الليزر. تعرض الصورة الناتجة فصيصات إشارة SHG الدوارة (الشكل 2B ، C).
4. إذا كنت تستخدم نوعا مختلفا من مرشح تمرير النطاق الترددي ل SHG ، فتأكد من أنه يتمتع بخصائص إرسال مثالية من خلال مقارنة الصور (الشكل 2D ، E) وشدة الإشارة بكسل تلو الآخر على طول مسح الخط (الشكل 2F).

3. استخراج الأنسجة

ملاحظة: استخدم دائما أدوات نظيفة لإجراء العمليات الجراحية.

1. استخدم فئران تايب البالغة من العمر 6-12 شهرا وعناصر تحكم Sprague-Dawley المطابقة للعمر (WT).
2. تخدير الحيوانات بحقن حقن خليط من الكيتامين-زيلازين (0.125 ملغ/كغ و5 ملغ/كغ) المخفف في محلول كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪.
   1. تحقق من ردود الفعل الألم ، والمضي قدما فقط إذا كانت غائبة.
3. التضحية بالحيوان عن طريق قطع الرأس.
4. بمجرد عزل الرأس ، افتح عظام قبو الجمجمة بعناية على طول خط الوسط ، بدءا من النقطة الذيلية في الأعلى باتجاه الأنف ، ومن التجاويف المدارية نحو خط الوسط ، ثم من النقطة الذيلية إلى أسفل الدماغ والمخيخ.
   ملاحظة: تسمح قواطع العظام و Rongeurs بالإزالة الصحيحة لعظام الرأس دون الإضرار بهياكل الدماغ.
5. حرر الدماغ والمخيخ من العظم. يمكن فصل نصفي الكرة الأرضية. إذا تم تقسيم نصفي الكرة الأرضية ، فاستخدم نصفا لتصوير SHG ، وقم بتثبيت النصف الآخر في 3.7٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 20 دقيقة داخل غطاء كيميائي للتقسيم والتلوين اللاحق.

4. تقسيم الاهتزاز

1. قم بإعداد صينية عازلة اهتزازية مملوءة بمحلول الملح المتوازن (HBSS) الدافئ (37 درجة مئوية).
2. ثبت الدماغ على لوحة العينة باستخدام غراء cyanoacrylate عبر قطعة من الشريط اللاصق. يتصل الجزء / المنطقة الأكثر ذيلية بالغراء بحيث يمكن قطع الأجزاء الإكليلية القابلة للاستخدام من الجزء المعاكس المنقار.
   1. السماح ~ 10 ثانية للغراء لبلمرة للحصول على مرفق فعال للعينة.
      ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم توجيه الدماغ بحيث تقطع الشفرة "من أعلى إلى أسفل" بدلا من "من جانب إلى آخر" (الشكل 1 ب).
3. انقل لوحة العينة إلى دعامتها المغناطيسية داخل الدرج العازل.
4. ابدأ في قطع أقسام 300-500 ميكرومتر حتى تشمل الشرائح المنتجة سطح الدماغ بالكامل.
5. عند هذه النقطة ، قلل سمك القسم إلى 160 ميكرومتر.
6. بمجرد قطع قسم كامل 160 ميكرومتر على مستوى الجسم الثفني ، قم باستعادته باستخدام ماصة باستور زجاجية معدلة مع فتحة كبيرة ملتهبة (الشكل 1C).
7. انقله إلى طبق بتري نظيف مع HBSS دافئ جديد أو مباشرة على الدعامة الزجاجية للفحص المجهري (غطاء غطاء أو طبق ذو قاع زجاجي).
   ملاحظة: بالنسبة للظروف التجريبية الموصوفة ، فإن إضافة غطاء فوق العينة يضر بالتصوير.

5. نقل إلى المجهر

1. إذا كان المجهر في غرفة مختلفة ، فقم بإعداد صندوق معزول به عبوات هلام دافئة لنقل أقسام الأنسجة مع الحفاظ على درجة الحرارة. يعمل الصندوق أيضا على إبقاء الأقسام دافئة حتى يتم تصويرها.
2. ضع العينة تحت المجهر ، وتأكد من وضعها بشكل صحيح تحت الهدف عن طريق الملاحظة المباشرة من خلال المنظار مع الضوء المرسل.
   ملاحظة: الهدف هو محاذاة هياكل الانبعاث المتوقعة مع اتجاه تذبذب الليزر لزيادة إشارة SHG المنبعثة (وبالتالي المكتشفة).
3. قم بإزالة HBSS الزائد بحيث يغطي فيلم سائل رقيق العينة بأكملها. تحقق بصريا من الفيلم السائل كل بضع دقائق لتجنب التبخر المفرط وتجفيف العينة.
   ملاحظة: في الظروف الموضحة ، يتم استخدام قسم لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة. يؤدي تجفيف العينة إلى تأثيرات أثرية جذرية (الشكل التكميلي 1 أ). بدلا من إضافة المزيد من HBSS ، يوصى بالنقع الدوري للقسم في وسط دافئ وجديد إذا كانت هناك حاجة إلى أوقات تصوير أطول. يوصى أيضا باستخدام غرف التروية والغراء أو الأغاروز منخفض الانصهار لشل حركة الأنسجة عند إجراء تجارب أطول.
4. قم بإعداد مرحلة المجهر للتصوير غير الممسوح ضوئيا ، والذي قد يشمل إغلاق جميع أبواب غرفة الحضانة المظلمة أو تغطية غرفة الحضانة بنسيج أسود مطلي بالنايلون البولي يوريثين.

6. التصوير

1. حدد وضع التصوير "غير الممسوح ضوئيا" على طول مسار الإرسال. بهذه الطريقة ، سيتم تحسين التقاط إشارة SH الضعيفة للتوبولين.
2. حدد هدف خطة LCI-Neofluar 25x / 0.8 NA.
3. اضبط طاقة الليزر بين 13 ميجاوات و 26 ميجاوات ، مع وقت سكون بكسل يبلغ 12.6 ميكرو ثانية. التقط صورا لا يزيد حجمها عن 512 بكسل × 512 بكسل ، بسرعة 5 ومتوسط 2 ، بمتوسط وقت اكتساب يبلغ حوالي 15 ثانية.
   ملاحظة: قد يؤدي استخدام قوى ليزر أعلى و / أو أوقات مكوث أطول إلى إتلاف العينة (الشكل التكميلي 1 ب).
4. التقط الصور أولا باستخدام مرشح تمرير قصير 485 نانومتر (SP485) ، وفي الخطوة الثانية ، أضف مرشح تمرير نطاق حاد 405 نانومتر (BP405; الشكل 3). اتبع الخطوات الواردة في الملف التكميلي 2.
   ملاحظة: يمكن التقاط صور الحقل الساطع الزائف من خلال نفس الكاشف باستخدام ضوء الليزر المتبقي لخط مرئي (يعمل الليزر 405 نانومتر أو 488 نانومتر بشكل أفضل).

7. معالجة المخيخ

1. أولا ، قم بقطع المخيخ بمشرط إلى نصفي الكرة الأرضية ، ثم قم بلصقهما على دعم الاهتزاز بواسطة الجزء الأوسط (الجزء المسطح الذي تم الحصول عليه بعد القطع).
2. قسم وصورة المخيخ بنفس الطريقة التي تم وصفها للدماغ (أقسام 160 ميكرومتر ، نفس إعدادات الاهتزاز ، نفس الشفرة ، نفس إعدادات المجهر ، إلخ).
   ملاحظة: بسبب تشريح المخيخ ، فإن اتجاهه في لحظة التقسيم ليس حرجا ؛ في معظم الشرائح المتولدة بعيدا عن السطح ، ستكون هناك ورقة مقسمة جيدا إلى المادة البيضاء.

النتائج

الصور التي تم الحصول عليها باستخدام هذه المنهجية لها مستوى خلفية منخفض جوهري بسبب العدد المحدود جدا من harmonophores الموجودة في الأنسجة البيولوجية ، والتي تعد واحدة من المزايا الهامة للطريقة.

عندما يتم تصوير ألياف الجسم الثفني ، يمكن العثور باستمرار على هياكل قصيرة تشبه الأليا?...

Discussion

يعد الفحص المجهري SHG جزءا من مجموعة من تقنيات البصريات غير الخطية ، والتي تشمل الفحص المجهري للإثارة ثنائي الفوتون ، والمجهر من الجيل التوافقي الثالث ، والمجهر المتماسك المضاد لستوكس رامان ، والتي ساهمت في توسيع نطاق تطبيقات المجهر الضوئي التقليدي لعلوم الحياة²⁰.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200