中枢ミエリンにおけるチューブリン依存性欠陥の研究のためのラベルフリー非線形光学系

要約

本稿では、細管障害のモデルで微小管を負荷した希突起膠細胞を、シンプルで革新的な第2高調波発生顕微鏡アプローチで検出するためのプロトコルを紹介します。

要約

脳内の細胞骨格成分を十分に可視化することは困難です。すべての神経組織における微小管、マイクロフィラメント、および中間フィラメントのネットワークの遍在する分布は、蛍光タンパク質融合戦略の結果のばらつきと、発色団ビヒクルとしての抗体および薬物の動的研究へのそれらの限られた適用性とともに、古典的な光学的アプローチを他のタンパク質ほど効果的ではないものにします。チューブリンを研究する必要がある場合、分子の非中心対称組織化のために、ラベルフリーの第二高調波の生成は非常に適切な選択肢です。この手法を顕微鏡に結合させると、生物学的サンプル中の微小管の平行な束の体積分布を定性的に記述でき、固定および透過性のない新鮮な組織を扱うという追加の利点があります。この研究では、最近報告されたミエリン障害である大脳基底核および小脳(H-ABC)チューブリノパシーの萎縮を伴う髄鞘形成低下のように、希突起膠細胞のチューブリンが豊富な構造の微小管を強調するために、市販の第2倍音発生顕微鏡セットアップでチューブリンを画像化する方法について説明します。

概要

組織や臓器製剤中の細胞骨格構造の光学イメージングは簡単な作業ではありません。細胞骨格フィラメントはいたるところにあるため、例えば、上皮サンプル中のα-チューブリンまたはβ-アクチン、または潜在的にケラチンに対して一般的な染色が行われる場合、シグナルはサンプル全体にかなり均一に分布する可能性があります。染色を細胞成分のより意味のあるサブセットに制限するには、標的発現¹のトランスジェニックマウスを使用するか、アイソフォーム特異的抗体の使用を計画することができます。後者のほとんどが市場に出回っていませんが(そして、まったく存在しないものはほとんどありません^2,3,4)、トランスジェニック動物モデルが利用可能である可能性があります。ただし、ラボで取得し、適切に収容する必要があり、プロセスにすべての費用がかかります。特定の抗体または化学物質、例えばファロイジンやパクリタキセルなどの蛍光色素結合薬物は、生細胞または組織での使用と部分的または完全に適合しない可能性があるため、固定サンプルの研究のみに適用できます。

チューブリンの場合、追加の側面、すなわち固定に対するポリマーの感受性を考慮する必要があります。ホルムアルデヒドによる従来の化学的固定は、微小管の完全性を最適に保存するのに十分ではないことが知られています⁵。さらに、最近の報告では、ホルムアルデヒド架橋が、GTP⁶などの一部の薬物または生理学的分子の結合で起こるのと同様に、微小管の微細構造に微妙な変化を誘発することが確認されています。

したがって、染色されていない、固定されていないサンプル中の微小管を直接可視化することがしばしば望ましいです。これを達成するための技術的解決策の1つは、平行な微小管の束がハーモノフォアとして機能し、強力なパルス赤外線レーザーで適切に照らされたときに周波数倍の光を放出する能力に基づく第2高調波発生(SHG)顕微鏡7です。周波数倍増が可能なことが知られている他の2つの生物学的材料であるコラーゲンとミオシンから、より強力でより安定した第2高調波信号を生成できますが、チューブリンからの信号は、これまで主に有糸分裂紡錘体再配列^8,9,10および軸索微小管形態11,12,13の研究に使用されてきました。

この研究では、チューブリンベータ4A(TUBB4A)チューブリノパシーの影響を受けた中枢神経系(CNS)組織を健康な組織と区別するための診断ツールとしてのSHG顕微鏡の新しい使用法を紹介します¹⁴。この主に神経アイソフォームのチューブリンで発生する変異のいくつかは、大脳基底核および小脳(H-ABC)の髄鞘形成低下および萎縮を引き起こすものと同様に、希突起膠細胞の微小管の過剰充填を誘発します^15,16;次に、細胞骨格の変化は、髄鞘形成などの下流効果に関連しており、運動経路と感覚経路の深刻な障害を伴います^16,17,18,19。本研究で用いたマウスモデルは、希突起膠細胞の微小管含量の異常を示し、H-ABC患者の感覚運動症状のほとんどを再現している¹⁷。プロトコルは、健康な組織と変異組織の間のSH信号の違いを強調するために、通常は高度に有髄性であり、ヒト患者およびtaiepラット¹⁹で深刻な影響を受ける脳梁および小脳として構造を画像化する方法を説明します。

プロトコル

記載されているすべての手順は、メキシコ政府の健康研究に関する一般健康法の規則(NOM-062-ZOO-1999)の第7タイトルで承認された法律およびコードに準拠して、および実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所ガイドの勧告に従って行われ、グアナファト大学およびベネメリタ自治大学の研究における生命倫理の制度委員会によって承認されました。 プエブラ。

1. 顕微鏡設定

1. 顕微鏡システムのスイッチを入れます。
2. パルスレーザーをオンにして、サンプルの抽出と準備後、最適で安定したパワーレベルでレイズする準備ができていることを保証します。
3. レーザーを810nmに合わせます。骨膜微小管を研究するために、利用可能なレーザー出力の10%〜20%が使用され、これは、記載されたシステムでは、対物レンズの後焦点面で測定された13〜26mWに相当する。
4. 顕微鏡がケーラー位置合わせ(補足ファイル1)であり、SHGイメージングに使用される対物レンズであることを確認してください。
   注意: この作業で使用される商用セットアップでは、検出は伝送モードでコンデンサーを介して実行されるため、これは重要です。
5. 光学検出経路から不要なフィルタを取り外します(図1A)。
6. コンデンサーダイアフラムが完全に開いていることを確認して、このレベルで光が不必要に停止しないようにします。
7. レンズに少量の液浸油を入れた25倍/0.8倍の開口数(NA)油浸対物レンズを用意します。
   注:この対物レンズは、コンデンサーNAに最も一致するように使用され、0.55(理想的にはNA_コンド≥_NAOBJ)でした。

2.顕微鏡予備制御

注意: セットアップが変更されない限り、予備的な顕微鏡制御を一度実行してください。

1. 乾燥コーンスターチをスライドガラスで挟んだ画像をSHGパラメータで表し、レーザー偏光方向を明らかにするSHG画像を生成します。 補足ファイル2に記載されている手順に従いますが、レーザー出力はコーンスターチの場合は5%未満です。
2. まばらなコーンスターチ粒の画像を1枚撮り、x-y平面のSHG小葉の向きをマークします。この向きはレーザーの向きに対応します(図2A)。
3. 対照として、同じサンプルの別の画像を撮影し、レーザーの発振方向を変えるために半波長板( 図1Aに示す位置)を光路に挿入します。結果の画像は、回転したSHG信号小葉を表示します(図2B、C)。
4. SHGに異なるタイプのバンドパスフィルタを使用する場合は、ラインスキャンに沿って画像(図2D、E)と信号強度をピクセルごとに比較して、最適な伝送特性を備えていることを確認してください(図2F)。

3.組織抽出

注意: 外科的処置を実行するには、常に清潔な道具を使用してください。

1. 生後6〜12か月の タイエップ ラットと年齢が一致したスプレイグ-ドーリーコントロール(WT)を使用します。
2. 0.9%滅菌NaCl溶液で希釈したケタミン-キシラジン(0.125 mg / Kgおよび5 mg / Kg)の混合物のi.p.注射で動物を麻酔します。.
   1. 痛みの反射を確認し、それらが存在しない場合にのみ続行してください。
3. 斬首 によって 動物を犠牲にします。
4. 頭が分離されたら、頭蓋冠の骨を正中線に沿って慎重に開き、上部の最も尾側の点から鼻に向かって、眼窩腔から正中線に向かって、次に最も尾側の点から脳と小脳の下まで開きます。
   注:ボーンカッターとロンジャーは、脳構造に損傷を与えることなく、頭の骨を適切に除去することができます。
5. 骨から脳と小脳を解放します。2つの半球は分離することができます。半球が分割されている場合は、SHGイメージングに半分を使用し、残りの半分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の3.7%パラホルムアルデヒドで20分間化学フード内で固定して、その後の切片作成と染色を行います。

4.ビブラトーム切片

1. 温かい(37°C)ハンクスバランス塩溶液(HBSS)で満たされたビブラトームバッファートレイを準備します。
2. マスキングテープ を介して シアノアクリレート接着剤を使用して脳を標本プレートに固定します。最も尾側の部分/領域が接着剤に接触するため、反対側の吻側部分から使用可能な冠状部分を切り取ることができます。
   1. 接着剤が重合するまで~10秒待って、サンプルを効果的に付着させます。
      注:最良の結果は、ブレードが「左右」ではなく「上から下」に切断されるように脳を向けると得られます(図1B)。
3. 試料プレートをバッファトレイ内の磁気サポートに移します。
4. 生成されたスライスが脳の表面全体を取り囲むまで、300〜500μmの切片の切断を開始します。
5. この時点で、セクションの厚さを160μmに減らします。
6. 脳梁のレベルで160 μmの切片全体を切断したら、大きなフレームオリフィスを備えた改良ガラス製パスツールピペットで回収します(図1C)。
7. 新しい温かいHBSSで清潔なペトリ皿に移すか、顕微鏡検査用のガラスサポート(カバーガラスまたはガラス底皿)に直接移します。
   注:説明されている実験条件では、サンプルの上にカバーガラスを追加すると、イメージングに悪影響を及ぼします。

5.顕微鏡に移す

1. 顕微鏡が別の部屋にある場合は、温度を維持しながら組織切片を移すために、温めたゲルパックを入れた断熱ボックスを用意します。ボックスは、画像化されるまでセクションを暖かく保つのにも役立ちます。
2. サンプルを顕微鏡の下に置き、透過光で接眼レンズを通して直接観察することにより、対物レンズの下に正しく配置されていることを確認します。
   注:目標は、予測された発光構造をレーザーの発振方向に合わせ、放出された(したがって検出された)SHG信号を最大化することです。
3. 薄い液体膜がサンプル全体を覆うように、余分なHBSSを取り除きます。サンプルの過度の蒸発と乾燥を避けるために、数分ごとに液膜を目視で確認してください。
   注意: 説明されている条件では、セクションは20分以内使用されます。サンプルの乾燥は、劇的なアーチファクト効果を引き起こします(補足図1A)。より長いイメージング時間が必要な場合は、HBSSを追加するのではなく、切片を温かく新鮮な培地に定期的に浸すことをお勧めします。より長い実験を行う場合は、灌流チャンバーと接着剤または低融点アガロースを使用して組織を固定化することも推奨されます。
4. 暗いインキュベーションチャンバーのすべてのドアを閉めたり、インキュベーションチャンバーを黒いナイロンポリウレタンコーティングされた布で覆ったりするなど、非デススキャンイメージング用の顕微鏡ステージを準備します。

6. イメージング

1. 伝送経路に沿って「非スキャン」イメージングモードを選択します。このようにして、チューブリンの弱いSHシグナルの捕捉が最適化されます。
2. LCIプラン-ネオフルアー25x/0.8 NAの目標を選択します。
3. レーザー出力を13 mWから26 mWの間で設定し、ピクセル滞留時間を12.6 μsにします。512ピクセル×512ピクセル以下の画像を速度5、平均2で撮影し、平均取得時間は約15秒です。
   注意: より高いレーザー出力および/またはより長い滞留時間を使用すると、サンプルが損傷する可能性があります(補足図1B)。
4. 最初に485 nmのショートパスフィルター(SP485)を使用して画像を撮影し、2番目のステップでシャープな405 nmバンドパスフィルター(BP405; 図3)。 補足ファイル 2 に記載されている手順に従います。
   注:擬似明視野画像は、可視線の残留レーザー光を使用して同じ検出器で撮影できます(405nmまたは488nmレーザーが最適です)。

7.小脳の処理

1. まず、メスで小脳を2つの半球に切断し、次に中央部分(切断後に得られる平らな部分)でビブラトムサポートに接着します。
2. 脳について説明したのと同じ方法で小脳を切片および画像化する(160μm切片、同じビブラトーム設定、同じブレード、同じ顕微鏡設定など)。
   注:小脳の解剖学的構造のため、切片作成の瞬間のその向きは重要ではありません。表面から離れた場所で生成されたスライスのほとんどでは、白質によく分割された葉があります。

結果

この方法論で得られた画像は、生物学的組織に存在するハーモノフォアの数が非常に限られているため、本質的に低いバックグラウンドレベルを有し、これはこの方法の重要な利点の1つである。

脳梁の線維を画像化すると、線維のような短い構造と丸い要素がタイエップ脳に一貫して見られますが(図3B)、対照脳の脳梁は脳領域全体ではるかに不均一で等方性の信...

ディスカッション

SHG顕微鏡は、2光子励起顕微鏡、第3高調波発生顕微鏡、コヒーレント反ストークスラマン散乱顕微鏡などの非線形光学技術のグループの一部であり、従来の光学顕微鏡のライフサイエンスへの応用範囲の拡大に貢献してきました²⁰。

具体的には、SHG顕微鏡の主な長所と短所は同じ条件に関連しています:信号発生器は非中心対称です²¹。?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200