Óptica não linear livre de rótulos para o estudo de defeitos dependentes de tubulina na mielina central

Resumo

Neste artigo, apresentamos um protocolo para detectar oligodendrócitos carregados de microtúbulos em um modelo de tubulinopatia através de uma abordagem microscópica simples e inovadora de segunda geração harmônica.

Resumo

A visualização satisfatória dos componentes citoesqueléticos no cérebro é um desafio. A distribuição ubíqua das redes de microtúbulos, microfilamentos e filamentos intermediários em todos os tecidos neurais, juntamente com a variabilidade nos resultados das estratégias de fusão de proteínas fluorescentes e sua aplicabilidade limitada a estudos dinâmicos de anticorpos e drogas como veículos cromóforos, tornam as abordagens ópticas clássicas não tão eficazes quanto para outras proteínas. Quando a tubulina precisa ser estudada, a geração livre de rótulo de segundos harmônicos é uma opção muito adequada devido à organização não centrossimétrica da molécula. Esta técnica, quando conjugada à microscopia, pode descrever qualitativamente a distribuição volumétrica de feixes paralelos de microtúbulos em amostras biológicas, com a vantagem adicional de trabalhar com tecidos frescos não fixos e não permeabilizados. Este trabalho descreve como obter imagens de tubulina com uma configuração comercial de microscopia de segunda geração harmônica para destacar microtúbulos nas estruturas enriquecidas com tubulina dos oligodendrócitos, como na hipomielinização com atrofia dos gânglios da base e tubulinopatia do cerebelo (H-ABC), um distúrbio de mielina recentemente descrito.

Introdução

A imagem óptica de estruturas citoesqueléticas em tecidos e preparações de órgãos não é uma tarefa fácil. Os filamentos citoesqueléticos são onipresentes, portanto, se a coloração genérica for realizada, por exemplo, contra alfa-tubulina ou beta-actina ou potencialmente queratina em uma amostra epitelial, o sinal provavelmente será distribuído de forma bastante homogênea por toda a amostra. Para restringir a coloração a um subconjunto mais significativo de componentes celulares, pode-se usar camundongos transgênicos com expressão direcionada¹ ou planejar o uso de anticorpos específicos de isoformas. Embora muito poucos destes últimos estejam no....

Protocolo

Todos os procedimentos descritos foram feitos em conformidade com as leis e códigos aprovados no sétimo título do Regulamento da Lei Geral de Saúde Relativa à Pesquisa em Saúde do Governo Mexicano (NOM-062-ZOO-1999) e de acordo com as recomendações do Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais e foram aprovados pelo comitê institucional de bioética em pesquisa da Universidad de Guanajuato e Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.

1. Configurações do microscópio

1. Ligue o sistema de microscopia.
2. Ligue o laser pulsado para garantir que ele estará pronto para lasc....

Resultados

As imagens obtidas com esta metodologia têm um baixo nível de fundo intrínseco devido ao número muito limitado de harmonóforos presentes nos tecidos biológicos, o que é uma das vantagens significativas do método.

Quando as fibras do corpo caloso são visualizadas, estruturas curtas semelhantes a fibras e elementos arredondados podem ser consistentemente encontrados no cérebro taiep (Figura 3B), enquanto o corpo caloso do cérebro controle mostra um sinal muito mais heterogên.......

Discussão

A microscopia SHG faz parte de um grupo de técnicas de óptica não linear, que incluem microscopia de excitação de dois fótons, microscopia de terceira geração harmônica e microscopia coerente de espalhamento Raman anti-Stokes, que contribuíram para expandir a gama de aplicações da microscopia óptica convencional para as ciências da vida²⁰.

Especificamente, a maior força e fraqueza da microscopia SHG referem-se à mesma condição: o gerador de sinal é n?.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200