Optique non linéaire sans marquage pour l’étude des défauts dépendants de la tubuline dans la myéline centrale

Résumé

Dans cet article, nous présentons un protocole pour détecter les oligodendrocytes chargés de microtubules dans un modèle de tubulopathie grâce à une approche simple et innovante de microscopie de deuxième génération harmonique.

Résumé

La visualisation satisfaisante des composants du cytosquelette dans le cerveau est difficile. La distribution omniprésente des réseaux de microtubules, de microfilaments et de filaments intermédiaires dans tous les tissus neuraux, ainsi que la variabilité des résultats des stratégies de fusion de protéines fluorescentes et leur applicabilité limitée aux études dynamiques des anticorps et des médicaments en tant que véhicules chromophores, rendent les approches optiques classiques moins efficaces que pour d’autres protéines. Lorsque la tubuline doit être étudiée, la génération sans étiquette de secondes harmoniques est une option très appropriée en raison de l’organisation non centrosymétrique de la molécule. Cette technique, lorsqu’elle est conjuguée à la microscopie, peut décrire qualitativement la distribution volumétrique de faisceaux parallèles de microtubules dans des échantillons biologiques, avec l’avantage supplémentaire de travailler avec des tissus frais non fixés et non perméabilisés. Ce travail décrit comment imager la tubuline avec une installation commerciale de microscopie de deuxième génération d’harmoniques pour mettre en évidence les microtubules dans les structures enrichies en tubuline des oligodendrocytes, comme dans l’hypomyélinisation avec atrophie des noyaux gris centraux et la tubulinopathie du cervelet (H-ABC), un trouble de la myéline récemment décrit.

Introduction

L’imagerie optique des structures cytosquelettiques dans les tissus et les préparations d’organes n’est pas une tâche facile. Les filaments cytosquelettiques sont omniprésents, donc si une coloration générique est effectuée, par exemple, contre l’alpha-tubuline ou la bêta-actine ou potentiellement la kératine dans un échantillon épithélial, le signal sera probablement distribué de manière assez homogène dans tout l’échantillon. Pour limiter la coloration à un sous-ensemble plus significatif de composants cellulaires, on peut soit utiliser des souris transgéniques avec une expression ciblée¹, soit envisager d’utiliser des anticorps spécifiques aux isoformes. Bien que très peu de ces derniers soient sur le marché (et très peu existent ^2,3,4), un modèle animal transgénique pourrait être disponible. Cependant, il doit être acquis par le laboratoire et correctement logé, avec toutes les dépenses impliquées dans le processus. Certains anticorps ou produits chimiques, par exemple les médicaments conjugués au fluorophore comme la phalloïdine ou le paclitaxel, peuvent être partiellement ou totalement incompatibles avec l’utilisation dans des cellules ou des tissus vivants, limitant ainsi leur applicabilité aux seules études d’échantillons fixes.

Dans le cas de la tubuline, un aspect supplémentaire doit être pris en considération, à savoir la sensibilité du polymère à la fixation. La fixation chimique conventionnelle avec le formaldéhyde est connue pour ne pas être adéquate pour préserver de manière optimale l’intégrité des microtubules⁵. De plus, un rapport récent confirme que la réticulation du formaldéhyde induit des changements subtils dans l’ultrastructure du microtubule, similaires à ce qui se passe avec la liaison de certains médicaments ou molécules physiologiques tels que GTP⁶.

La visualisation directe des microtubules dans des échantillons non colorés et non fixés est donc souvent souhaitable. Pour y parvenir, une solution technique est la microscopie de deuxième génération harmonique (SHG) 7, qui repose sur la capacité de faisceaux^de microtubules parallèles à agir comme des harmonophores et à émettre une lumière doublée en fréquence lorsqu’ils sont correctement éclairés avec un laser infrarouge intense et pulsé. Bien qu’un second signal harmonique plus fort et plus stable puisse être généré à partir du collagène et de la myosine, qui sont les deux seuls autres matériaux biologiques connus pour être capables de doubler la fréquence, le signal de la tubuline a été utilisé jusqu’à présent principalement pour étudier les réarrangements mitotiques^du fuseau 8,9,10 et la morphologie des microtubules axonaux^11,12,13.

Dans ce travail, nous introduisons une nouvelle utilisation de la microscopie SHG comme outil de diagnostic pour distinguer les tissus du système nerveux central (SNC) affectés par la tubuline bêta 4 A (TUBB4A) tubulopathie de leurs homologues sains¹⁴. Certaines des mutations survenant dans cette isoforme principalement neurale de la tubuline, comme celles provoquant l’hypomyélinisation et l’atrophie des noyaux gris centraux et du cervelet (H-ABC), induisent un surremplissage des microtubules dans les oligodendrocytes^15,16; Les altérations du cytosquelette, à leur tour, sont associées à des effets en aval comme la dysmyélinisation, avec une altération profonde des voies motrices et sensorielles^16,17,18,19. Le modèle murin de taiep utilisé dans ce travail présente une teneur anormale en microtubules dans les oligodendrocytes et récapitule la plupart des symptômes sensori-moteurs des patients H-ABC¹⁷. Le protocole explique comment imager des structures comme le corps calleux et le cervelet, qui sont généralement fortement myélinisés et qui sont gravement affectés chez les patients humains ainsi que chez le rat taiep ¹⁹, pour mettre en évidence les différences dans les signaux SH entre les tissus sains et mutants.

Protocole

Toutes les procédures décrites ont été effectuées conformément aux lois et codes approuvés dans le septième titre du règlement de la loi générale sur la santé concernant la recherche en santé du gouvernement mexicain (NOM-062-ZOO-1999) et conformément aux recommandations du Guide des instituts nationaux de santé pour le soin et l’utilisation des animaux d’expérimentation et ont été approuvées par le comité institutionnel de bioéthique dans la recherche de l’Université de Guanajuato et de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.

1. Réglages du microscope

1. Allumez le système de microscopie.
2. Allumez le laser pulsé pour garantir qu’il sera prêt à être lasé à un niveau de puissance optimal et constant après l’extraction et la préparation de l’échantillon.
3. Réglez le laser à 810 nm. Pour étudier les microtubules tissulaires, 10% à 20% de la puissance laser disponible est utilisée, ce qui, dans le système décrit, correspond à 13-26 mW mesurée au plan focal arrière de l’objectif.
4. Assurez-vous que le microscope est aligné sur Köhler (dossier supplémentaire 1), avec l’objectif qui sera utilisé pour l’imagerie SHG.
   NOTE: Ceci est important car, dans la configuration commerciale utilisée dans ce travail, la détection est effectuée en mode transmission et à travers le condensateur.
5. Retirez les filtres indésirables du chemin de détection optique (Figure 1A).
6. Assurez-vous que le diaphragme du condensateur est complètement ouvert pour vous assurer qu’aucune lumière n’est inutilement arrêtée à ce niveau.
7. Préparez un objectif d’immersion dans l’huile à ouverture numérique (NA) 25x/0,8 avec une petite goutte d’huile d’immersion dans l’objectif.
   REMARQUE: Cet objectif a été utilisé pour correspondre au mieux au condensateur NA, qui était de 0,55 (idéalement, NA_cond≥ NA_obj).

2. Contrôles préliminaires au microscope

REMARQUE: Effectuez les contrôles préliminaires du microscope une fois, sauf si la configuration est modifiée.

1. Image amidon de maïs sec pris en sandwich entre des lames de verre avec des paramètres SHG pour générer des images SHG qui révèlent la direction de polarisation laser. Suivez les étapes indiquées dans le dossier supplémentaire 2, sauf pour la puissance laser, qui est inférieure à 5 % pour l’amidon de maïs.
2. Prenez une image de grains clairsemés d’amidon de maïs et marquez l’orientation des lobules SHG dans le plan x-y. Cette orientation correspond à l’orientation laser (Figure 2A).
3. Comme contrôle, prendre une autre image du même échantillon, en insérant dans le chemin optique une plaque demi-onde (position montrée à la figure 1A) pour modifier la direction d’oscillation du laser. L’image résultante montre des lobules de signal SHG tournés (Figure 2B, C).
4. Si vous utilisez un autre type de filtre passe-bande pour le SHG, assurez-vous qu’il possède des propriétés de transmission optimales en comparant les images (Figure 2D, E) et les intensités du signal pixel par pixel le long d’un balayage linéaire (Figure 2F).

3. Extraction tissulaire

REMARQUE: Utilisez toujours des outils propres pour effectuer les interventions chirurgicales.

1. Utilisez des rats taiep âgés de 6 à 12 mois et des témoins Sprague-Dawley appariés selon l’âge (WT).
2. Anesthésier les animaux par injection intraveineuse d’un mélange de kétamine-xylazine (0,125 mg/kg et 5 mg/kg) dilué dans une solution de NaCl stérile à 0,9 %.
   1. Vérifiez les réflexes douloureux et ne procédez que s’ils sont absents.
3. Sacrifiez l’animal par décapitation.
4. Une fois la tête isolée, ouvrez soigneusement les os de la voûte crânienne le long de la ligne médiane, en partant du point le plus caudale en haut vers le nez, des cavités orbitaires vers la ligne médiane, puis du point le plus caudale au-dessous du cerveau et du cervelet.
   REMARQUE: Les coupe-os et les rongeurs permettent d’enlever correctement les os de la tête sans endommager les structures cérébrales.
5. Libérez le cerveau et le cervelet de l’os. Les deux hémisphères pourraient être séparés. Si les hémisphères sont divisés, utiliser une moitié pour l’imagerie SHG et fixer l’autre moitié dans du paraformaldéhyde à 3,7% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 20 minutes à l’intérieur d’une hotte chimique pour la section et la coloration ultérieures.

4. Sectionnement du vibratome

1. Préparez un plateau tampon vibratome rempli de solution saline équilibrée de Hank’s (HBSS) tiède (37 °C).
2. Fixez le cerveau à la plaque d’échantillon à l’aide de colle cyanoacrylate via un morceau de ruban de masquage. La partie / région la plus caudale entre en contact avec la colle afin que les sections coronales utilisables de la partie opposée, rostrale, puissent être coupées.
   1. Laisser ~10 s pour que la colle polymérise afin d’obtenir une fixation efficace de l’échantillon.
      REMARQUE : Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque le cerveau est orienté de manière à ce que la lame coupe « de haut en bas » plutôt que « d’un côté à l’autre » (Figure 1B).
3. Transférer la plaque d’échantillon sur son support magnétique à l’intérieur du plateau tampon.
4. Commencez à couper des sections de 300 à 500 μm jusqu’à ce que les tranches produites englobent toute la surface du cerveau.
5. À ce stade, réduisez l’épaisseur de la section à 160 μm.
6. Une fois qu’une section complète de 160 μm est découpée au niveau du corps calleux, la récupérer à l’aide d’une pipette Pasteur en verre modifiée avec un grand orifice enflammé (figure 1C).
7. Transférez-le dans une boîte de Petri propre avec un nouveau HBSS chaud ou directement sur le support en verre pour la microscopie (lamelle de couverture ou boîte à fond de verre).
   REMARQUE : Pour les conditions expérimentales décrites, l’ajout d’une lamelle de couverture au-dessus de l’échantillon est préjudiciable à l’imagerie.

5. Transfert au microscope

1. Si le microscope se trouve dans une autre pièce, préparez une boîte isotherme avec des sachets de gel chauffés pour transférer les sections de tissu tout en maintenant la température. La boîte sert également à garder les sections au chaud jusqu’à ce qu’elles soient imagées.
2. Placez l’échantillon au microscope et assurez-vous qu’il est correctement positionné sous l’objectif par observation directe à travers les oculaires avec lumière transmise.
   REMARQUE: L’objectif est d’aligner les structures émettrices prévues avec la direction d’oscillation du laser afin de maximiser le signal SHG émis (et, par conséquent, détecté).
3. Retirez l’excès HBSS de sorte qu’un film liquide mince recouvre tout l’échantillon. Vérifiez visuellement le film liquide toutes les quelques minutes pour éviter une évaporation et un séchage excessifs de l’échantillon.
   NOTE: Dans les conditions décrites, une section est utilisée pendant 20 minutes au maximum. Le séchage de l’échantillon provoque des effets artificiels drastiques (figure supplémentaire 1A). Plutôt que d’ajouter plus de HBSS, un trempage périodique de la section dans un milieu chaud et frais est recommandé si des temps d’imagerie plus longs sont nécessaires. L’utilisation de chambres de perfusion et de colle ou d’agarose à bas point de fusion pour immobiliser le tissu est également recommandée lorsque des expériences plus longues doivent être effectuées.
4. Préparez l’étape du microscope pour l’imagerie non numérisée, ce qui peut inclure la fermeture de toutes les portes de la chambre d’incubation sombre ou le recouvrement de la chambre d’incubation avec un tissu enduit de polyuréthane en nylon noir.

6. Imagerie

1. Sélectionnez le mode d’imagerie « non numérisé » le long du chemin de transmission. De cette façon, la capture du faible signal SH de la tubuline sera optimisée.
2. Sélectionnez l’objectif LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. Définissez une puissance laser comprise entre 13 mW et 26 mW, avec un temps de séjour en pixels de 12,6 μs. Prenez des images ne dépassant pas 512 pixels x 512 pixels, avec une vitesse de 5 et une moyenne de 2, pour un temps d’acquisition moyen d’environ 15 s.
   REMARQUE : L’utilisation de puissances laser plus élevées et/ou de temps de séjour plus longs peut endommager l’échantillon (figure supplémentaire 1B).
4. Prenez d’abord des images à l’aide d’un filtre passe-court de 485 nm (SP485) et, dans un deuxième temps, ajoutez un filtre passe-bande de 405 nm (BP405; Graphique 3). Suivez les étapes indiquées dans le dossier supplémentaire 2.
   REMARQUE: Les images pseudo-fond clair peuvent être prises à travers le même détecteur en utilisant la lumière laser résiduelle d’une ligne visible (les lasers 405 nm ou 488 nm fonctionnent mieux).

7. Traitement du cervelet

1. Tout d’abord, coupez le cervelet avec un scalpel en deux hémisphères, puis collez-les au support du vibratome par la partie centrale (la partie plate obtenue après la coupe).
2. Couper et imager le cervelet de la même manière que celle décrite pour le cerveau (coupes de 160 μm, mêmes réglages de vibratome, même lame, mêmes réglages de microscope, etc.).
   NOTE: En raison de l’anatomie du cervelet, son orientation au moment de la section n’est pas critique; Dans la plupart des tranches générées loin de la surface, il y aura des folias sectionnées bien dans la substance blanche.

Résultats

Les images obtenues avec cette méthodologie ont un niveau de fond intrinsèquement bas en raison du nombre très limité de harmonophores présents dans les tissus biologiques, ce qui est l’un des avantages significatifs de la méthode.

Lorsque les fibres du corps calleux sont imagées, des structures courtes ressemblant à des fibres et des éléments arrondis peuvent être trouvés de manière cohérente dans le cerveau taiep (Figure 3B), tandis que le corps calleux du cerveau t?...

Discussion

La microscopie SHG fait partie d’un groupe de techniques d’optique non linéaire, qui comprennent la microscopie à excitation à deux photons, la microscopie de troisième génération harmonique et la microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente, qui ont contribué à élargir la gamme d’applications de la microscopie optique conventionnelle aux sciences de la vie²⁰.

Plus précisément, la force et la faiblesse majeures de la microscopie SHG sont liées...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200