중심 미엘린의 튜불린 의존성 결함 연구를 위한 무표지 비선형 광학

요약

이 기사에서는 간단하고 혁신적인 2차 고조파 생성 현미경 접근 방식을 통해 세뇨관병증 모델에서 미세소관 로딩 희소돌기아교세포를 검출하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

뇌의 세포 골격 구성 요소를 만족스럽게 시각화하는 것은 어려운 일입니다. 모든 신경 조직에서 미세소관, 미세필라멘트 및 중간 필라멘트 네트워크의 유비쿼터스 분포와 형광 단백질 융합 전략의 결과의 가변성 및 발색단 비히클로서의 항체 및 약물의 동적 연구에 대한 제한된 적용 가능성으로 인해 고전적인 광학 접근 방식은 다른 단백질만큼 효과적이지 않습니다. 튜 불린을 연구해야 할 때, 2 차 고조파의 표지없는 생성은 분자의 비 중심 대칭 조직으로 인해 매우 적합한 옵션입니다. 이 기술은 현미경에 접합 될 때 생물학적 샘플에서 평행 한 미세 소관 다발의 체적 분포를 정 성적으로 설명 할 수 있으며 고정되지 않고 투과되지 않은 신선한 조직으로 작업 할 수있는 추가적인 이점이 있습니다. 이 연구는 최근에 기술된 미엘린 장애인 기저핵 및 소뇌(H-ABC) 세뇨관 병증의 위축을 동반한 저수초화에서와 같이 희소돌기아교세포의 튜불린이 풍부한 구조에서 미세소관을 강조하기 위해 상업용 2차 고조파 생성 현미경 설정으로 튜불린을 이미지화하는 방법을 설명합니다.

서문

조직 및 장기 준비에서 세포 골격 구조의 광학 이미징은 쉬운 일이 아닙니다. 세포골격 필라멘트는 어디에나 있으므로 예를 들어 상피 샘플의 알파-튜불린 또는 베타-액틴 또는 잠재적으로 케라틴에 대해 일반적인 염색을 수행하는 경우 신호는 샘플 전체에 다소 균일하게 분포될 수 있습니다. 염색을 세포 성분의 보다 의미 있는 하위 집합으로 제한하기 위해, 표적 발현¹을 갖는 형질전환 마우스를 사용하거나 이소형 특이적 항체를 사용할 계획을 세울 수 있다. 후자 중 극소수가 시장에 나와 있지만(^2,3,4에는 거의 존재하지 않음) 형질전환 동물 모델을 사용할 수 있습니다. 그러나 실험실에서 구입하여 프로세스에 관련된 모든 비용과 함께 적절하게 보관해야 합니다. 특정 항체 또는 화학 물질, 예를 들어 팔로이딘 또는 파클리탁셀과 같은 형광단 접합 약물은 살아있는 세포 또는 조직에서의 사용과 부분적으로 또는 완전히 양립할 수 없으므로 고정 샘플에 대한 연구에만 적용할 수 있습니다.

튜 불린의 경우, 고정에 대한 폴리머의 민감도 인 추가 측면을 고려해야합니다. 포름 알데히드에 의한 종래의 화학적 고정은 미세 소관의 완전성을 최적으로 보존하기에 적합하지 않은 것으로 알려져 있습니다⁵. 또한 최근 보고서에 따르면 포름 알데히드 가교는 GTP⁶과 같은 일부 약물 또는 생리 학적 분자의 결합에서 발생하는 것과 유사하게 미세 소관의 미세 구조에 미묘한 변화를 유도합니다.

따라서 염색되지 않고 고정되지 않은 샘플에서 미세소관을 직접 시각화하는 것이 종종 바람직합니다. 이를 달성하기 위한 한 가지 기술적 솔루션은 2차 고조파 생성(SHG) 현미경⁷로, 이는 병렬 미세소관 다발이 하모노포어 역할을 하고 강렬한 펄스 적외선 레이저로 적절하게 조명될 때 주파수 이중 빛을 방출하는 능력을 기반으로 합니다. 더 강력하고 안정적인 2차 고조파 신호가 주파수 배가가 가능한 것으로 알려진 유일한 다른 두 가지 생물학적 물질인 콜라겐과 미오신에서 생성될 수 있지만, 튜불린의 신호는 지금까지 주로 유사분열 방추 재배열 ^8,9,10 및 축삭 미세소관 형태 ^11,12,13을 연구하는 데 사용되었습니다.

이 연구에서 우리는 튜불린 베타 4 A (TUBB4A) 세뇨관 병증의 영향을받는 중추 신경계 (CNS) 조직을 건강한 대응^{물 14}와 구별하기위한 진단 도구로서 SHG 현미경의 새로운 사용을 소개합니다. 기저핵과 소뇌 (H-ABC)의 저 수초화 및 위축을 유발하는 것과 같은이 주로 신경 이형 튜 불린에서 발생하는 돌연변이 중 일부는 희소 돌기 아교 세포에서 미세 소관 과충진을 유도합니다^15,16; 세포 골격 변화는 차례로 운동 및 감각 경로^16,17,18,19의 심오한 손상과 함께 수초화와 같은 하류 효과와 관련이 있습니다. 이 작업에 사용 된 taiep 쥐 모델은 희소 돌기 아교 세포에서 비정상적인 미세 소관 함량을 표시하고 H-ABC 환자¹⁷의 감각 운동 증상의 대부분을 요약합니다. 이 프로토콜은 건강한 조직과 돌연변이 조직 간의 SH 신호의 차이를 강조하기 위해 일반적으로 고도로 수초화되고 인간 환자와 taiep ^{rat 19}에서 심하게 영향을받는 뇌량과 소뇌로 구조를 이미지화하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

설명 된 모든 절차는 멕시코 정부의 건강 연구에 관한 일반 보건법 규정 (NOM-062-ZOO-1999)의 일곱 번째 제목에서 승인 된 법률 및 코드와 실험 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드의 권고에 따라 수행되었으며 과나후아토 대학교 및 베네메리타 대학교 연구에서 생명 윤리 기관위원회의 승인을 받았습니다. 푸에블라.

1. 현미경 설정

1. 현미경 시스템을 켭니다.
2. 펄스 레이저를 켜서 샘플 추출 및 준비 후 최적의 안정적인 전력 수준으로 레이싱할 준비가 되었는지 확인하십시오.
3. 레이저를 810nm로 조정하십시오. 적정 미세 소관을 연구하기 위해 사용 가능한 레이저 출력의 10 % -20 %가 사용되며, 이는 설명 된 시스템에서 대물 렌즈의 후면 초점면에서 측정 된 13-26mW에 해당합니다.
4. 현미경이 SHG 이미징에 사용될 대물렌즈와 함께 Köhler(보충 파일 1)로 정렬되었는지 확인하십시오.
   알림: 이 작업에 사용된 상용 설정에서 감지는 전송 모드와 콘덴서를 통해 수행되기 때문에 중요합니다.
5. 광학 감지 경로에서 원치 않는 필터를 제거합니다(그림 1A).
6. 이 수준에서 불필요하게 빛이 멈추지 않도록 콘덴서 다이어프램이 완전히 열려 있는지 확인하십시오.
7. 렌즈에 액침 오일을 약간 떨어뜨려 25x/0.8 개구수(NA) 오일 이멀젼 대물렌즈를 준비합니다.
   참고: 이 대물렌즈는 콘덴서 NA와 가장 잘 일치하는 데 사용되었으며, 이는 0.55(이상적으로는 NA_조건≥ NA_obj)였습니다.

2. 현미경 예비 제어

참고: 설정을 수정하지 않는 한 예비 현미경 제어를 한 번 수행하십시오.

1. 레이저 편광 방향을 나타내는 SHG 이미지를 생성하기 위해 SHG 매개변수가 있는 유리 슬라이드 사이에 건조 옥수수 전분을 끼운 이미지. 옥수수 전분의 경우 2% 미만인 레이저 출력을 제외하고 보충 파일 5에 보고된 단계를 따르십시오.
2. 희박한 옥수수 전분 입자의 이미지 하나를 찍고 xy 평면에서 SHG 소엽의 방향을 표시합니다. 이 배향은 레이저 배향에 해당합니다(그림 2A).
3. 대조군으로 동일한 샘플의 다른 이미지를 가져와 광학 경로에 반파장판( 그림 1A에 표시된 위치)을 삽입하여 레이저의 진동 방향을 변경합니다. 결과 이미지는 회전된 SHG 신호 소엽을 표시합니다(그림 2B, C).
4. SHG에 다른 유형의 대역 통과 필터를 사용하는 경우 라인 스캔을 따라 이미지(그림 2D, E)와 신호 강도를 픽셀 단위로 비교하여 최적의 전송 특성을 갖는지 확인합니다(그림 2F).

3. 조직 추출

알림: 수술 절차를 수행하려면 항상 깨끗한 도구를 사용하십시오.

1. 6-12 개월 된 taiep 쥐와 연령이 일치하는 Sprague-Dawley 대조군 (WT)을 사용하십시오.
2. 0.9% 멸균 NaCl 용액에 희석한 케타민-자일라진(0.125mg/Kg 및 5mg/Kg) 혼합물의 i.p. 주사로 동물을 마취합니다.
   1. 통증 반사를 확인하고 결석 한 경우에만 진행하십시오.
3. 참수를 통해 동물을 희생하십시오.
4. 머리가 분리되면 상단의 가장 꼬리 지점에서 코쪽으로, 안와 구멍에서 정중선으로, 그리고 가장 꼬리 지점에서 뇌와 소뇌 아래까지 정중선을 따라 두개골 금고의 뼈를 조심스럽게 엽니 다.
   알림: 뼈 절단기와 Rongeurs는 뇌 구조를 손상시키지 않고 머리 뼈를 적절하게 제거 할 수 있습니다.
5. 뼈에서 뇌와 소뇌를 풀어줍니다. 두 반구는 분리 될 수 있습니다. 반구가 분할된 경우 절반을 SHG 이미징에 사용하고 나머지 절반은 후속 절단 및 염색을 위해 화학 후드 내부에 20분 동안 인산염 완충 식염수(PBS)의 3.7% 파라포름알데히드로 고정합니다.

4. 비브라톰 절편

1. 따뜻한(37°C) 행크스 밸런스드 소금 용액(HBSS)으로 채워진 비브라톰 버퍼 트레이를 준비합니다.
2. 마스킹 테이프 조각을 통해 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 뇌를 표본 플레이트에 고정시킵니다. 가장 꼬리 부분 / 영역이 접착제와 접촉하여 반대쪽의 부분에서 사용 가능한 관상 섹션을 절단 할 수 있습니다.
   1. 샘플의 효과적인 부착을 얻기 위해 접착제가 중합될 때까지 ~10초를 허용합니다.
      참고: 최상의 결과는 블레이드가 "좌우로"가 아니라 "위에서 아래로" 절단되도록 뇌의 방향을 지정할 때 얻을 수 있습니다(그림 1B).
3. 시편 플레이트를 버퍼 트레이 내부의 자기 지지대로 옮깁니다.
4. 생성 된 조각이 뇌의 전체 표면을 포함 할 때까지 300-500 μm 섹션을 자르기 시작합니다.
5. 이 시점에서 단면의 두께를 160μm로 줄이십시오.
6. 뇌량 수준에서 완전한 160μm 섹션이 절단되면 큰 화염 오리피스가 있는 수정된 유리 파스퇴르 피펫으로 복구합니다(그림 1C).
7. 따뜻한 새 HBSS가 있는 깨끗한 페트리 접시에 옮기거나 현미경 검사를 위해 유리 지지대(커버슬립 또는 유리 바닥 접시)에 직접 옮깁니다.
   참고: 설명된 실험 조건의 경우 샘플 위에 커버슬립을 추가하면 이미징에 해롭습니다.

5. 현미경으로 이동

1. 현미경이 다른 방에있는 경우 온도를 유지하면서 조직 섹션을 옮기기 위해 따뜻하게 한 젤 팩으로 단열 상자를 준비하십시오. 상자는 또한 이미지가 될 때까지 섹션을 따뜻하게 유지하는 역할을합니다.
2. 샘플을 현미경 아래에 놓고 투과광이 있는 접안렌즈를 통해 직접 관찰하여 대물렌즈 아래에 적절하게 배치되었는지 확인합니다.
   알림: 목표는 예측된 방출 구조를 레이저의 진동 방향과 정렬하여 방출된(따라서 감지된) SHG 신호를 최대화하는 것입니다.
3. 얇은 액체 필름이 전체 샘플을 덮을 수 있도록 과도한 HBSS를 제거합니다. 샘플의 과도한 증발 및 건조를 피하기 위해 몇 분마다 액체 필름을 육안으로 확인하십시오.
   알림: 설명 된 조건에서 섹션은 20 분 이상 사용되지 않습니다. 시료의 건조는 급격한 인공물 효과를 일으킨다(보충 그림 1A). 더 긴 이미징 시간이 필요한 경우 HBSS를 더 추가하는 대신 따뜻하고 신선한 매체에 섹션을 주기적으로 담그는 것이 좋습니다. 조직을 고정시키기 위해 관류 챔버와 접착제 또는 저 융점 아가 로스를 사용하는 것도 더 긴 실험을 수행 할 때 권장됩니다.
4. 어두운 배양 챔버의 모든 문을 닫거나 검은색 나일론 폴리우레탄 코팅 직물로 배양 챔버를 덮는 것을 포함할 수 있는 스캔되지 않은 이미징을 위한 현미경 단계를 준비합니다.

6. 이미징

1. 전송 경로를 따라 "스캔되지 않은" 이미징 모드를 선택합니다. 이렇게하면 튜 불린의 약한 SH 신호 캡처가 최적화됩니다.
2. LCI 플랜-네오플루아 25x/0.8 NA 대물렌즈를 선택합니다.
3. 13mW에서 26mW 사이의 레이저 출력을 설정하고 픽셀 체류 시간은 12.6μs입니다. 평균 획득 시간 약 15초 동안 속도 5, 평균 2로 512픽셀 x 512픽셀 이하의 이미지를 촬영합니다.
   알림: 더 높은 레이저 출력 및/또는 더 긴 체류 시간을 사용하면 샘플이 손상될 수 있습니다(보충 그림 1B).
4. 먼저 485nm 단거리 통과 필터(SP485)를 사용하여 이미지를 촬영하고 두 번째 단계에서 선명한 405nm 대역통과 필터(BP405; 그림 3). 보충 파일 2에 보고된 단계를 따릅니다.
   참고: 의사 명시야 이미지는 가시선의 잔류 레이저 광을 사용하여 동일한 검출기를 통해 촬영할 수 있습니다(405nm 또는 488nm 레이저가 가장 적합).

7. 소뇌의 처리

1. 먼저 메스로 소뇌를 두 개의 반구로 자른 다음 중간 부분 (절단 후 얻은 평평한 부분)으로 비브라 톰 지지대에 붙입니다.
2. 뇌에 대해 기술된 것과 동일한 방식으로 소뇌를 절편화하고 이미지화하였다(160 μm 절편, 동일한 비브라톰 설정, 동일한 블레이드, 동일한 현미경 설정 등).
   참고 : 소뇌의 해부학으로 인해 절편 순간의 방향은 중요하지 않습니다. 표면에서 멀리 떨어진 곳에서 생성 된 대부분의 조각에는 백질로 잘 절단 된 폴리아가 있습니다.

결과

이 방법론으로 얻은 이미지는 생물학적 조직에 존재하는 매우 제한된 수의 harmonophores로 인해 본질적으로 낮은 배경 수준을 가지며, 이는 방법의 중요한 장점 중 하나입니다.

뇌량의 섬유가 이미지화될 때, 섬유와 같은 짧은 구조와 둥근 요소는 taiep 뇌에서 일관되게 발견될 수 있는 반면(그림 3B), 대조 뇌의 뇌량은 뇌 영역 전체에 걸쳐 훨씬 더 이질적이고 등방성 신호를...

토론

SHG 현미경은 2광자 여기 현미경, 3차 고조파 생성 현미경 및 응집성 안티-스톡스 라만 산란 현미경을 포함하는 비선형 광학 기술 그룹의 일부로, 종래의 광학 현미경의 적용 범위를 생명 과학(²⁰)으로 확장하는 데 기여했습니다.

특히, SHG 현미경의 주요 강점과 약점은 동일한 조건과 관련이 있습니다 : 신호 발생기는 비 중심 대칭²¹입니다. 이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200