Нелинейная оптика без этикеток для изучения тубулин-зависимых дефектов в центральном миелине

Резюме

В этой статье мы представляем протокол обнаружения олигодендроцитов, нагруженных микротрубочками, в модели тубулинопатии с помощью простого, инновационного подхода к микроскопии второй гармонической генерации.

Аннотация

Удовлетворительная визуализация цитоскелетных компонентов в головном мозге является сложной задачей. Повсеместное распределение сетей микротрубочек, микрофиламентов и промежуточных нитей во всех нервных тканях вместе с изменчивостью результатов стратегий слияния флуоресцентных белков и их ограниченной применимостью к динамическим исследованиям антител и лекарств в качестве хромофорных носителей делают классические оптические подходы не такими эффективными, как для других белков. Когда тубулин необходимо изучить, генерация вторых гармоник без меток является очень подходящим вариантом из-за нецентросимметричной организации молекулы. Этот метод при сопряжении с микроскопией может качественно описать объемное распределение параллельных пучков микротрубочек в биологических образцах, с дополнительным преимуществом работы со свежими тканями, которые являются нефиксированными и неразрывноженными. В этой работе описывается, как изобразить тубулин с помощью коммерческой микроскопии второй гармонической генерации для выделения микротрубочек в обогащенных тубулином структурах олигодендроцитов, как при гипомиелинизации с атрофией базальных ганглиев и тубулинопатии мозжечка (H-ABC), недавно описанного расстройства миелина.

Введение

Оптическая визуализация цитоскелетных структур в тканях и препаратах органов – непростая задача. Цитоскелетные нити распространены повсеместно, поэтому, если общее окрашивание выполняется, например, против альфа-тубулина или бета-актина или потенциально кератина в образце эпителия, сигнал, вероятно, будет распределен довольно однородно по всему образцу. Чтобы ограничить окрашивание более значимым подмножеством клеточных компонентов, можно либо использовать трансгенных мышей с целевой экспрессией¹, либо планировать использование изоформ-специфических антител. В то время как очень немногие из последних представлены на рынке (и

протокол

Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с законами и кодексами, утвержденными в седьмом названии Положения Общего закона о здравоохранении, касающегося исследований в области здравоохранения правительства Мексики (NOM-062-ZOO-1999), и в соответствии с рекомендациями Руководства национальных институтов здравоохранения по уходу за экспериментальными животными и их использованию, и были одобрены институциональным комитетом по биоэтике в исследованиях Университета Гуанахуато и Автономного университета Бенемериты. Пуэбла.

1. Настройки микроскопа

1. Включите систему микроскопии.
2. Включите импульсный....

Результаты

Изображения, полученные с помощью данной методики, имеют внутренний низкий фоновый уровень из-за очень ограниченного количества гармоникофоров, присутствующих в биологических тканях, что является одним из существенных преимуществ метода.

Когда волокна мозолистого тел.......

Обсуждение

Микроскопия SHG является частью группы нелинейных оптических методов, которые включают в себя двухфотонную микроскопию возбуждения, микроскопию генерации третьей гармоники и когерентную рамановскую рассеянную микроскопию против Стокса, которые способствовали расширению спектра при.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200