Нелинейная оптика без этикеток для изучения тубулин-зависимых дефектов в центральном миелине

Резюме

В этой статье мы представляем протокол обнаружения олигодендроцитов, нагруженных микротрубочками, в модели тубулинопатии с помощью простого, инновационного подхода к микроскопии второй гармонической генерации.

Аннотация

Удовлетворительная визуализация цитоскелетных компонентов в головном мозге является сложной задачей. Повсеместное распределение сетей микротрубочек, микрофиламентов и промежуточных нитей во всех нервных тканях вместе с изменчивостью результатов стратегий слияния флуоресцентных белков и их ограниченной применимостью к динамическим исследованиям антител и лекарств в качестве хромофорных носителей делают классические оптические подходы не такими эффективными, как для других белков. Когда тубулин необходимо изучить, генерация вторых гармоник без меток является очень подходящим вариантом из-за нецентросимметричной организации молекулы. Этот метод при сопряжении с микроскопией может качественно описать объемное распределение параллельных пучков микротрубочек в биологических образцах, с дополнительным преимуществом работы со свежими тканями, которые являются нефиксированными и неразрывноженными. В этой работе описывается, как изобразить тубулин с помощью коммерческой микроскопии второй гармонической генерации для выделения микротрубочек в обогащенных тубулином структурах олигодендроцитов, как при гипомиелинизации с атрофией базальных ганглиев и тубулинопатии мозжечка (H-ABC), недавно описанного расстройства миелина.

Введение

Оптическая визуализация цитоскелетных структур в тканях и препаратах органов – непростая задача. Цитоскелетные нити распространены повсеместно, поэтому, если общее окрашивание выполняется, например, против альфа-тубулина или бета-актина или потенциально кератина в образце эпителия, сигнал, вероятно, будет распределен довольно однородно по всему образцу. Чтобы ограничить окрашивание более значимым подмножеством клеточных компонентов, можно либо использовать трансгенных мышей с целевой экспрессией¹, либо планировать использование изоформ-специфических антител. В то время как очень немногие из последних представлены на рынке (и очень немногие из них существуют вообще ^2,3,4), трансгенная модель животных может быть доступна. Тем не менее, он должен быть приобретен лабораторией и должным образом размещен, со всеми расходами, связанными с процессом. Некоторые антитела или химические вещества, например, флуорофор-конъюгированные препараты, такие как фаллоидин или паклитаксел, могут быть частично или полностью несовместимы с использованием в живых клетках или тканях, что ограничивает их применимость только к исследованиям фиксированных образцов.

В случае тубулина необходимо учитывать дополнительный аспект, которым является чувствительность полимера к фиксации. Традиционная химическая фиксация формальдегидом известна тем, что не является адекватной для оптимального сохранения целостности микротрубочек⁵. Кроме того, недавний отчет подтверждает, что сшивание формальдегида вызывает тонкие изменения в ультраструктуре микротрубочек, аналогичные тому, что происходит при связывании некоторых лекарств или физиологических молекул, таких как GTP⁶.

Поэтому прямая визуализация микротрубочек в незапятнанных, неповрежденных образцах часто желательна. Для достижения этого одним из технических решений является микроскопия второй гармонической генерации (SHG)⁷, которая основана на способности пучков параллельных микротрубочек действовать как гармониофоры и излучать удвоенный по частоте свет при правильном освещении интенсивным импульсным инфракрасным лазером. Хотя более сильный и стабильный второй гармонический сигнал может быть получен из коллагена и миозина, которые являются единственными двумя другими биологическими материалами, которые, как известно, способны к удвоению частоты, сигнал от тубулина до сих пор использовался в основном для изучения митотических перестроек веретена ^8,9,10 и морфологии аксональных микротрубочек 11,12,13.

В этой работе мы представляем новое использование микроскопии SHG в качестве диагностического инструмента для различения тканей центральной нервной системы (ЦНС), пораженных тубулинопатией бета-4 А (TUBB4A), от их здоровых аналогов¹⁴. Некоторые из мутаций, происходящих в этой преимущественно нейронной изоформе тубулина, например, вызывающие гипомиелинизацию и атрофию базальных ганглиев и мозжечка (H-ABC), вызывают переполнение микротрубочек в олигодендроцитах^15,16; цитоскелетные изменения, в свою очередь, связаны с последующими эффектами, такими как дисмиелинизация, с глубоким нарушением двигательных и сенсорных путей 16,17,18,19. Модель тайеповых мышей, используемая в этой работе, отображает аномальное содержание микротрубочек в олигодендроцитах и повторяет большинство сенсорно-моторных симптомов пациентов h-ABC¹⁷. Протокол объясняет, как визуализировать такие структуры, как мозолистое тело и мозжечок, которые обычно сильно миелинизированы и которые серьезно страдают у пациентов на людях, а также у крысы тайепа ¹⁹, чтобы подчеркнуть различия в сигналах SH между здоровыми и мутантными тканями.

протокол

Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с законами и кодексами, утвержденными в седьмом названии Положения Общего закона о здравоохранении, касающегося исследований в области здравоохранения правительства Мексики (NOM-062-ZOO-1999), и в соответствии с рекомендациями Руководства национальных институтов здравоохранения по уходу за экспериментальными животными и их использованию, и были одобрены институциональным комитетом по биоэтике в исследованиях Университета Гуанахуато и Автономного университета Бенемериты. Пуэбла.

1. Настройки микроскопа

1. Включите систему микроскопии.
2. Включите импульсный лазер, чтобы гарантировать, что он будет готов к работе на оптимальном и устойчивом уровне мощности после извлечения и подготовки образца.
3. Настройте лазер на 810 нм. Для исследования тиссулярных микротрубочек используется 10%-20% доступной мощности лазера, что в описываемой системе соответствует 13-26 мВт, измеренным на задней фокальной плоскости объектива.
4. Убедитесь, что микроскоп выровнен по Келеру (дополнительный файл 1) с целью, которая будет использоваться для визуализации SHG.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно, поскольку в коммерческой установке, используемой в этой работе, обнаружение выполняется в режиме передачи и через конденсатор.
5. Удалите нежелательные фильтры из оптического пути обнаружения (рисунок 1A).
6. Убедитесь, что диафрагма конденсатора полностью открыта, чтобы гарантировать, что свет не останавливается без необходимости на этом уровне.
7. Подготовьте масляный объектив с числовой диафрагмой (NA) с небольшой каплей погружного масла в объектив.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта цель была использована, чтобы наилучшим образом соответствовать конденсатору NA, который составлял 0,55 (в идеале, NA_cond≥ NA_obj).

2. Предварительный контроль микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните предварительное управление микроскопом один раз, если настройка не изменена.

1. Изображение сухого кукурузного крахмала, зажатого между стеклянными слайдами с параметрами SHG для получения изображений SHG, которые показывают направление лазерной поляризации. Выполните действия, описанные в дополнительном файле 2, за исключением мощности лазера, которая составляет менее 5% для кукурузного крахмала.
2. Сделайте одно изображение разреженных зерен кукурузного крахмала и отметьте ориентацию долек SHG в плоскости x-y. Эта ориентация соответствует лазерной ориентации (рисунок 2А).
3. В качестве элемента управления возьмите другое изображение того же образца, вставив в оптический путь полуволновую пластину (положение, показанное на рисунке 1А) для изменения направления колебаний лазера. Полученное изображение отображает повернутые дольки сигнала SHG (рисунок 2B, C).
4. Если используется другой тип полосового фильтра для SHG, убедитесь, что он обладает оптимальными свойствами передачи, сравнивая изображения (рисунок 2D, E) и интенсивность сигнала пиксель за пикселем вдоль линейного сканирования (рисунок 2F).

3. Извлечение тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте чистые инструменты для выполнения хирургических процедур.

1. Используйте 6-12-месячных крыс тайепа и соответствующие возрасту контрольные группы Sprague-Dawley (WT).
2. Обезболивают животных в/инъекцией смеси кетамина-ксилазина (0,125 мг/кг и 5 мг/кг), разведенной в 0,9% стерильном растворе NaCl.
   1. Проверьте болевые рефлексы, и приступайте только в том случае, если они отсутствуют.
3. Приносить животное в жертву путем обезглавливания.
4. Как только голова изолирована, осторожно откройте кости свода черепа вдоль средней линии, начиная с самой хвостовой точки наверху к носу, от орбитальных полостей к средней линии, а затем от самой хвостовой точки до нижней части мозга и мозжечка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Костяные резаки и Rongeurs позволяют правильно удалять кости головы, не повреждая структуры мозга.
5. Освободите мозг и мозжечок от кости. Два полушария могут быть разделены. Если полушария разделены, используйте одну половину для визуализации SHG, а другую половину зафиксируйте в 3,7% параформальдегиде в фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS) в течение 20 минут внутри химической вытяжки для последующего сечения и окрашивания.

4. Вибратомное секционирование

1. Подготовьте буферный лоток для вибратома, наполненный теплым (37 °C) сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS).
2. Закрепите мозг на пластине образца с помощью цианоакрилатного клея через кусок маскировочной ленты. Наибольшая каудальная часть/ область контактирует с клеем, так что пригодные для использования корональные участки из противоположной ростральной части могут быть разрезаны.
   1. Дайте ~10 с для полимеризации клея для получения эффективного прикрепления образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшие результаты получаются, когда мозг ориентирован так, что лезвие режет «сверху вниз», а не «из стороны в сторону» (рисунок 1B).
3. Перенесите пластину образца на магнитную опору внутри буферного лотка.
4. Начните резать 300-500 мкм срезов до тех пор, пока полученные срезы не охватят всю поверхность мозга.
5. В этот момент уменьшите толщину сечения до 160 мкм.
6. После того, как полный срез размером 160 мкм разрезан на уровне мозолистого тела, восстановите его с помощью модифицированной стеклянной пипетки Пастера с большим пламенным отверстием (рисунок 1C).
7. Переложите его в чистую чашку Петри с новым теплым HBSS или непосредственно на стеклянную опору для микроскопии (крышку или стеклянную тарелку).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для описанных экспериментальных условий добавление крышки над образцом наносит ущерб визуализации.

5. Перенос в микроскоп

1. Если микроскоп находится в другом помещении, подготовьте изолированную коробку с подогретыми гелевыми компрессами для переноса участков ткани при сохранении температуры. Коробка также служит для поддержания разделов в тепле до тех пор, пока они не будут изображены.
2. Поместите образец под микроскоп и убедитесь, что он правильно расположен под объективом, путем непосредственного наблюдения через глаз с пропускаемым светом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы выровнять прогнозируемые излучающие структуры с направлением колебаний лазера для максимизации излучаемого (и, следовательно, обнаруженного) сигнала SHG.
3. Удалите избыток HBSS так, чтобы тонкая жидкая пленка покрывала весь образец. Визуально проверяйте жидкую пленку каждые несколько минут, чтобы избежать чрезмерного испарения и высыхания образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В описанных условиях секция используется не более 20 мин. Высыхание образца вызывает резкие артефактные эффекты (дополнительный рисунок 1А). Вместо того, чтобы добавлять больше HBSS, рекомендуется периодическое замачивание участка в теплой, свежей среде, если требуется более длительное время визуализации. Использование перфузионных камер и клея или низкоплавкой агарозы для иммобилизации ткани также рекомендуется при проведении более длительных экспериментов.
4. Подготовьте стадию микроскопа для неосканированной визуализации, которая может включать закрытие всех дверей темной инкубационной камеры или покрытие инкубационной камеры черной нейлоновой полиуретановой тканью.

6. Визуализация

1. Выберите режим «неотсканированной» визуализации вдоль пути передачи. Таким образом, захват слабого сигнала SH тубулина будет оптимизирован.
2. Выберите цель LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. Установите мощность лазера от 13 мВт до 26 мВт со временем выдержки пикселя 12,6 мкс. Делайте снимки размером не более 512 x 512 пикселей со скоростью 5 и средним значением 2 для среднего времени съемки около 15 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование более высокой мощности лазера и/или более длительного времени выдержки может повредить образец (дополнительный рисунок 1B).
4. Сначала сделайте снимки с помощью фильтра коротких частот 485 нм (SP485), а на втором этапе добавьте резкий полосовой фильтр 405 нм (BP405; Рисунок 3). Выполните действия, описанные в дополнительном файле 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения псевдоярчего поля могут быть получены через тот же детектор с использованием остаточного лазерного света видимой линии (лучше всего работают лазеры 405 нм или 488 нм).

7. Обработка мозжечка

1. Сначала разрезают мозжечок скальпелем на две полусферы, а затем приклеивают их к вибратомной опоре средней частью (плоской частью, полученной после разреза).
2. Сечение и изображение мозжечка таким же образом, как было описано для мозга (160 мкм срезов, те же настройки вибратома, то же лезвие, те же настройки микроскопа и т.д.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за анатомии мозжечка его ориентация в момент сечения не является критической; в большинстве срезов, образующихся вдали от поверхности, фолиевы будут хорошо разделены на белое вещество.

Результаты

Изображения, полученные с помощью данной методики, имеют внутренний низкий фоновый уровень из-за очень ограниченного количества гармоникофоров, присутствующих в биологических тканях, что является одним из существенных преимуществ метода.

Когда волокна мозолистого тел...

Обсуждение

Микроскопия SHG является частью группы нелинейных оптических методов, которые включают в себя двухфотонную микроскопию возбуждения, микроскопию генерации третьей гармоники и когерентную рамановскую рассеянную микроскопию против Стокса, которые способствовали расширению спектра при...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200