אופטיקה לא ליניארית ללא תווית לחקר פגמים תלויי טובולין במיאלין המרכזי

Summary

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אוליגודנדרוציטים טעונים במיקרוטובולים במודל של טובולינופתיה באמצעות גישה פשוטה וחדשנית של מיקרוסקופיה הרמונית מהדור השני.

Abstract

ההדמיה המשביעת רצון של מרכיבים ציטוסקטליים במוח היא מאתגרת. ההתפלגות בכל מקום של רשתות של מיקרוטובולים, מיקרופילמנטים וחוטי ביניים בכל הרקמות העצביות, יחד עם השונות בתוצאות של אסטרטגיות היתוך חלבונים פלואורסצנטיים ויישומם המוגבל למחקרים דינמיים של נוגדנים ותרופות ככלי כרומופור, הופכים את הגישות האופטיות הקלאסיות ללא יעילות כמו עבור חלבונים אחרים. כאשר יש צורך לחקור טובולין, הדור ללא תווית של הרמוניות שניות הוא אופציה מתאימה מאוד בשל הארגון הלא צנטרוסימטרי של המולקולה. טכניקה זו, כאשר מצומדים למיקרוסקופיה, יכולה לתאר באופן איכותי את ההתפלגות הנפחית של צרורות מקבילים של מיקרוטובולים בדגימות ביולוגיות, עם היתרון הנוסף של עבודה עם רקמות טריות שאינן מסודרות ובלתי מנוצלות. עבודה זו מתארת כיצד לדמות טובולין עם מערך מיקרוסקופיה הרמוני מסחרי מהדור השני כדי להדגיש מיקרוטובולים במבנים המועשרים בטובולינים של האוליגודנדרוציטים, כמו בהיפומיאלינציה עם ניוון של הגרעינים הבסיסיים וטובולינופתיה של המוח הקטן (H-ABC), הפרעת מיאלין שתוארה לאחרונה.

Introduction

ההדמיה האופטית של מבנים ציטוסקטליים ברקמות ובהכנות איברים אינה משימה קלה. חוטים ציטוסקטליים נמצאים בכל מקום, כך שאם מבוצעת צביעה גנרית, למשל, נגד אלפא-טובולין או בטא-אקטין או אולי קרטין בדגימת אפיתל, סביר להניח שהאות יופץ בצורה הומוגנית למדי בכל רחבי הדגימה. כדי להגביל את הכתמים לתת-קבוצה משמעותית יותר של רכיבים תאיים, ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים עם ביטוי ממוקד¹ או לתכנן להשתמש בנוגדנים ספציפיים לאיזופורם. בעוד שמעט מאוד מהאחרונים נמצאים בשוק (ומעטים מאוד קיימים בכלל ^2,3,4), מודל של בעלי חיים מהונדסים עשוי להיות זמין. עם זאת, הוא צריך להירכש על ידי המעבדה ולשכן אותו כראוי, עם כל ההוצאות הכרוכות בתהליך. נוגדנים או כימיקלים מסוימים, לדוגמה, תרופות מצומדות פלואורופור כמו פלואידין או פקליטקסל, עשויים להיות לא תואמים באופן חלקי או מלא לשימוש בתאים חיים או ברקמות, ובכך להגביל את תחולתם רק למחקרים של דגימות קבועות.

במקרה של טובולין, יש לקחת בחשבון היבט נוסף, שהוא הרגישות של הפולימר לקיבוע. קיבוע כימי קונבנציונלי עם פורמלדהיד ידוע בכך שאינו מספיק לשמירה אופטימלית על שלמות המיקרוטובולים⁵. בנוסף, דו"ח שפורסם לאחרונה מאשר כי הצלבת פורמלדהיד גורמת לשינויים עדינים במבנה האולטרה-מבנה של המיקרוטובול, בדומה למה שקורה עם קשירה של תרופות מסוימות או מולקולות פיזיולוגיות כגון GTP⁶.

ההדמיה הישירה של מיקרוטובולים בדגימות לא מוכתמות ולא מתוקנות היא, אם כן, רצויה לעתים קרובות. כדי להשיג זאת, פתרון טכני אחד הוא מיקרוסקופיה שנייה של הדור ההרמוני (SHG)⁷, המבוססת על היכולת של צרורות של מיקרוטובולים מקבילים לפעול כהרמונופורים ולפלוט אור כפול תדר כאשר הוא מואר כראוי בלייזר אינפרא אדום אינטנסיבי ופועם. למרות שניתן להפיק אות הרמוני שני חזק ויציב יותר מקולגן וממיוזין, שהם שני החומרים הביולוגיים האחרים היחידים הידועים כבעלי יכולת להכפיל תדרים, האות מטובולין שימש עד כה בעיקר לחקר סידור מחדש של צירים מיטוטיים ^8,9,10 ומורפולוגיה של מיקרוטובולים אקסונאליים^11,12,13.

בעבודה זו, אנו מציגים שימוש חדשני במיקרוסקופיית SHG ככלי אבחון להבחנה בין רקמות מערכת העצבים המרכזית (CNS) המושפעות מטובולין בטא 4 A (TUBB4A) טובולינופתיה לבין עמיתיהן הבריאים¹⁴. חלק מהמוטציות המתרחשות באיזופורם העצבי הזה של טובולין, כמו אלה הגורמות להיתמיאלינציה וניוון של הגרעינים הבסיסיים והמוח הקטן (H-ABC), גורמות למילוי יתר של מיקרוטובול באוליגודנדרוציטים^15,16; השינויים הציטוסקטליים, בתורם, קשורים להשפעות במורד הזרם כמו דיסמיאלינציה, עם פגיעה עמוקה במסלולים המוטוריים והחושיים^16,17,18,19. מודל הטייפ מורין המשמש בעבודה זו מציג תכולת מיקרוטובולים חריגה באוליגודנדרוציטים ומשחזר את רוב הסימפטומים החושיים-מוטוריים של חולי H-ABC¹⁷. הפרוטוקול מסביר כיצד לדמות מבנים כמו קורפוס קלוסום והמוח הקטן, שהם בדרך כלל מאוד מיאלינים ואשר מושפעים קשות בחולים אנושיים, כמו גם בחולדה taiep ¹⁹, כדי להדגיש את ההבדלים באותות SH בין רקמות בריאות ומוטנטיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים המתוארים נעשו בהתאם לחוקים ולקודים שאושרו בכותרת השביעית של תקנת חוק הבריאות הכללי בנוגע למחקר בריאותי של ממשלת מקסיקו (NOM-062-ZOO-1999) ובהתאם להמלצות מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות ניסוי ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לביואתיקה במחקר של אוניברסיטת גואנחואטו ובנמריטה אוניברסידד אוטונומה דה פואבלה.

1. הגדרות מיקרוסקופ

1. הפעל את מערכת המיקרוסקופיה.
2. הפעל את הלייזר הפועם כדי להבטיח שהוא יהיה מוכן ללזיה ברמת הספק אופטימלית ויציבה לאחר מיצוי הדגימה והכנתה.
3. כוונן את הלייזר ל-810 ננומטר. כדי ללמוד microtubules tissular, 10%-20% של כוח הלייזר הזמין משמש, אשר, במערכת המתוארת, מתאים 13-26 mW נמדד במישור המוקד האחורי של המטרה.
4. ודא שהמיקרוסקופ מיושר על ידי Köhler (קובץ משלים 1), במטרה שתשמש להדמיית SHG.
   הערה: זה חשוב מכיוון שבמערך המסחרי המשמש בעבודה זו, הזיהוי מתבצע במצב שידור ודרך המעבה.
5. הסר מסננים לא רצויים מנתיב הגילוי האופטי (איור 1A).
6. ודא שדיאפרגמה המעבה פתוחה במלואה כדי להבטיח שאף אור לא ייעצר שלא לצורך ברמה זו.
7. הכינו יעד טבילת שמן עם מפתח צמצם מספרי (NA) של 25x/0.8 עם טיפה קטנה של שמן טבילה בעדשה.
   הערה: מטרה זו שימשה כדי להתאים בצורה הטובה ביותר את המעבה NA, שהיה 0.55 (באופן אידיאלי,_{NA cond}≥_{NA obj}).

2. בקרות ראשוניות במיקרוסקופ

הערה: בצע את פקדי המיקרוסקופ הראשוניים פעם אחת, אלא אם כן ההתקנה תשתנה.

1. תמונה עמילן תירס יבש דחוק בין שקופיות זכוכית עם פרמטרים SHG כדי ליצור תמונות SHG החושפות את כיוון קיטוב הלייזר. בצע את השלבים המדווחים בקובץ משלים 2, למעט עוצמת הלייזר, שהיא פחות מ-5% עבור עמילן תירס.
2. צלם תמונה אחת של גרגרי עמילן תירס דלילים, וסמן את הכיוון של אונות SHG במישור x-y. כיוון זה מתאים לכיוון הלייזר (איור 2A).
3. כבקרה, צלם תמונה נוספת של אותה דגימה, והכנס לנתיב האופטי לוח חצי גל (מיקום המוצג באיור 1A) כדי לשנות את כיוון התנודה של הלייזר. התמונה המתקבלת מציגה אונות אות SHG מסובבות (איור 2B, C).
4. אם אתם משתמשים בסוג אחר של מסנן פסים עבור SHG, ודאו שיש לו תכונות שידור אופטימליות על-ידי השוואת התמונות (איור 2D, E) ועוצמות האות פיקסל אחר פיקסל לאורך סריקת קו (איור 2F).

3. מיצוי רקמות

הערה: השתמש תמיד בכלים נקיים לביצוע ההליכים הכירורגיים.

1. השתמשו בחולדות טאייפ בנות 6-12 חודשים ובבקרות Sprague-Dawley (WT) תואמות גיל.
2. הרדימו את בעלי החיים בהזרקת i.p. של תערובת קטמין-קסילזין (0.125 מ"ג/ק"ג ו-5 מ"ג/ק"ג) מדוללת בתמיסת NaCl סטרילית של 0.9%.
   1. בדוק את רפלקסי הכאב, ולהמשיך רק אם הם נעדרים.
3. להקריב את החיה באמצעות עריפת ראשים.
4. לאחר בידוד הראש, פתחו בזהירות את עצמות קמרון הגולגולת לאורך קו האמצע, החל מהנקודה הקאודלית ביותר בחלק העליון לכיוון האף, מחללי המסלול לכיוון קו האמצע, ולאחר מכן מהנקודה הקאודלית ביותר אל מתחת למוח ולמוח הקטן.
   הערה: חותכי עצם ורונג'ורס מאפשרים הסרה נכונה של עצמות הראש מבלי לפגוע במבני המוח.
5. שחררו את המוח ואת המוח הקטן מהעצם. ניתן היה להפריד בין שתי ההמיספרות. אם חצאי הכדור מחולקים, השתמשו בחצי אחד להדמיית SHG, וקבעו את החצי השני ב-3.7% פרפורמלדהיד בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) למשך 20 דקות בתוך מכסה מנוע כימי לחיתוך והכתמה הבאים.

4. חתך ויברטום

1. הכינו מגש חיץ רטט מלא בתמיסת מלח מאוזנת חמה (37 מעלות צלזיוס) של האנק (HBSS).
2. הצמידו את המוח לצלחת הדגימה באמצעות דבק ציאנואקרילט באמצעות פיסת סרט מיסוך. החלק/האזור הקאודלי ביותר יוצר קשר עם הדבק כך שניתן לחתוך את החלקים הקורונליים השמישים מהחלק ההפוך, הרוסטרלי.
   1. אפשר ~ 10 s עבור הדבק כדי להתפלמר כדי לקבל חיבור יעיל של הדגימה.
      הערה: התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר המוח מכוון כך שהלהב חותך "מלמעלה למטה" ולא "מצד לצד" (איור 1B).
3. העבירו את לוחית הדגימה לתמיכה המגנטית שלה בתוך מגש החיץ.
4. התחילו לחתוך חתכים של 300-500 מיקרומטר עד שהפרוסות המיוצרות יקיפו את כל פני השטח של המוח.
5. בשלב זה, להקטין את עובי הקטע ל 160 מיקרומטר.
6. לאחר שחתך שלם של 160 מיקרומטר נחתך ברמה של קורפוס קלוסום, שחזר אותו עם פיפטה פסטר מזכוכית מותאמת עם פתח גדול ובוער (איור 1C).
7. העבירו אותו לצלחת פטרי נקייה עם HBSS חדש וחם או ישירות על תמיכת הזכוכית למיקרוסקופיה (כיסוי או צלחת תחתית זכוכית).
   הערה: עבור תנאי הניסוי המתוארים, הוספת כיסוי מעל הדגימה מזיקה להדמיה.

5. העברה למיקרוסקופ

1. אם המיקרוסקופ נמצא בחדר אחר, הכינו קופסה מבודדת עם חבילות ג'ל מחוממות להעברת חלקי הרקמה תוך שמירה על הטמפרטורה. הקופסה משמשת גם כדי לשמור על חום החלקים עד שהם מצולמים.
2. שים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ, וודא שהיא ממוקמת כראוי מתחת למטרה על ידי תצפית ישירה דרך העיניים עם האור המועבר.
   הערה: המטרה היא ליישר את המבנים הפולטים החזויים עם כיוון התנודה של הלייזר כדי למקסם את אות ה- SHG הנפלט (ולכן זוהה).
3. הסר את עודף HBSS כך שסרט נוזלי דק יכסה את כל הדגימה. בדוק חזותית את הסרט הנוזלי כל כמה דקות כדי למנוע אידוי יתר וייבוש של הדגימה.
   הערה: בתנאים המתוארים, נעשה שימוש בקטע למשך לא יותר מ-20 דקות. ייבוש הדגימה גורם להשפעות ארטיפקטיות דרסטיות (איור משלים 1A). במקום להוסיף עוד HBSS, מומלץ להשרות את החתך במדיום חם וטרי אם יש צורך בזמני הדמיה ארוכים יותר. השימוש בתאי זלוף ודבק או אגרוז נמס נמוך כדי לשתק את הרקמה מומלץ גם כאשר יש לבצע ניסויים ארוכים יותר.
4. הכינו את שלב המיקרוסקופ להדמיה לא מיואשת, שעשויה לכלול סגירה של כל הדלתות של תא הדגירה הכהה או כיסוי תא הדגירה בבד מצופה פוליאוריתן ניילון שחור.

6. הדמיה

1. בחר את מצב ההדמיה "non-descanned" לאורך נתיב השידור. בדרך זו, לכידת אות SH חלש של טובולין יהיה מותאם.
2. בחר את המטרה LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. הגדר עוצמת לייזר בין 13 mW ל- 26 mW, עם זמן שהייה של פיקסל של 12.6 μs. צלם תמונות בגודל שאינו עולה על 512 פיקסלים x 512 פיקסלים, עם מהירות 5 וממוצע של 2, לזמן רכישה ממוצע של כ-15 שניות.
   הערה: שימוש בעוצמות לייזר גבוהות יותר ו/או זמני שהייה ארוכים יותר עלולים לגרום נזק לדגימה (איור משלים 1B).
4. צלם תמונות תחילה באמצעות מסנן פס קצר של 485 ננומטר (SP485), ובשלב שני, הוסף מסנן פס פס חד של 405 ננומטר (BP405; איור 3). בצע את השלבים המדווחים בקובץ משלים 2.
   הערה: ניתן לצלם תמונות שדה פסאודו-בהירות דרך אותו גלאי באמצעות אור הלייזר השיורי של קו נראה לעין (לייזרים של 405 ננומטר או 488 ננומטר פועלים בצורה הטובה ביותר).

7. עיבוד המוח הקטן

1. ראשית, לחתוך את המוח הקטן עם אזמל לשני חצאי כדור, ולאחר מכן להדביק אותם לתמיכה ויברטום על ידי החלק האמצעי (החלק השטוח המתקבל לאחר חיתוך).
2. חתך ותמונה של המוח הקטן באותו אופן כפי שתואר עבור המוח (160 מיקרומטר מקטעים, אותן הגדרות ויברטום, אותו להב, אותן הגדרות מיקרוסקופ וכו ').
   הערה: בשל האנטומיה של המוח הקטן, האוריינטציה שלו ברגע החתך אינה קריטית; ברוב הפרוסות הנוצרות מפני השטח, תהיה פוליה חתוכה היטב לתוך החומר הלבן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לתמונות המתקבלות במתודולוגיה זו יש רמת רקע נמוכה מהותית בשל המספר המצומצם מאוד של הרמונופורים הקיימים ברקמות ביולוגיות, וזה אחד היתרונות המשמעותיים של השיטה.

כאשר מדמיינים את הסיבים של קורפוס קלוסום, מבנים קצרים דמויי סיבים ואלמנטים מעוגלים יכולים להימצא באופן עקבי במוח <...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מיקרוסקופיית SHG היא חלק מקבוצה של טכניקות אופטיקה לא ליניאריות, הכוללות מיקרוסקופיית עירור של שני פוטונים, מיקרוסקופיה של הדור ההרמוני השלישי ומיקרוסקופיית פיזור קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן, שתרמו להרחבת מגוון היישומים של מיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית למדעי החיים²⁰.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200