Merkezi Miyelin'de Tubuline Bağlı Kusurların İncelenmesi için Etiketsiz Doğrusal Olmayan Optikler

Özet

Bu makalede, basit, yenilikçi bir ikinci harmonik nesil mikroskopi yaklaşımı ile bir tübülinopati modelinde mikrotübül yüklü oligodendrositleri tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Beyindeki sitoiskelet bileşenlerinin tatmin edici bir şekilde görselleştirilmesi zordur. Tüm sinir dokularında mikrotübüller, mikrofilamentler ve ara filamentlerin ağlarının her yerde bulunması, floresan protein füzyon stratejilerinin sonuçlarındaki değişkenlik ve bunların kromofor araçları olarak antikorların ve ilaçların dinamik çalışmalarına sınırlı uygulanabilirliği ile birlikte, klasik optik yaklaşımları diğer proteinler kadar etkili kılmamaktadır. Tubulinin incelenmesi gerektiğinde, ikinci harmoniklerin etiketsiz üretimi, molekülün merkez-simetrik olmayan organizasyonu nedeniyle çok uygun bir seçenektir. Bu teknik, mikroskopiye konjuge edildiğinde, biyolojik örneklerdeki paralel mikrotübül demetlerinin hacimsel dağılımını, sabitlenmemiş ve geçirgenleşmemiş taze dokularla çalışmanın ek avantajıyla niteliksel olarak tanımlayabilir. Bu çalışma, yakın zamanda tanımlanmış bir miyelin bozukluğu olan bazal gangliyon ve serebellum (H-ABC) tübülinopatisinin atrofisi ile hipomiyelinasyonda olduğu gibi, oligodendrositlerin tübülinle zenginleştirilmiş yapılarındaki mikrotübülleri vurgulamak için ticari bir ikinci harmonik nesil mikroskopi kurulumuyla tübülinin nasıl görüntüleneceğini açıklamaktadır.

Giriş

Dokulardaki ve organ preparatlarındaki sitoiskelet yapılarının optik olarak görüntülenmesi kolay bir iş değildir. Sitoiskelet filamentleri her yerde bulunur, bu nedenle jenerik boyama yapılırsa, örneğin, bir epitel örneğinde alfa-tübülin veya beta-aktin veya potansiyel olarak keratine karşı, sinyal muhtemelen numunenin her tarafına homojen bir şekilde dağıtılacaktır. Boyama işlemini hücresel bileşenlerin daha anlamlı bir alt kümesiyle sınırlamak için, hedeflenen ekspresyon¹ ile transgenik fareler kullanılabilir veya izoforma özgü antikorlar kullanmayı planlayabilir. İkincisinin çok azı piyasada olsa da (ve çok azı ^2,3,4'te mevcut), transgenik bir hayvan modeli mevcut olabilir. Bununla birlikte, laboratuvar tarafından satın alınması ve sürece dahil olan tüm masraflarla birlikte uygun şekilde barındırılması gerekir. Bazı antikorlar veya kimyasallar, örneğin, faloidin veya paklitaksel gibi florofor konjuge ilaçlar, canlı hücrelerde veya dokularda kullanımla kısmen veya tamamen uyumsuz olabilir, bu nedenle uygulanabilirliklerini yalnızca sabit numunelerin çalışmalarına sınırlandırır.

Tübülin durumunda, polimerin fiksasyona duyarlılığı olan ek bir husus dikkate alınmalıdır. Formaldehit ile konvansiyonel kimyasal fiksasyonun, mikrotübüllerin bütünlüğünü en iyi şekilde korumak için yeterli olmadığı bilinmektedir⁵. Ek olarak, yakın tarihli bir rapor, formaldehit çapraz bağlanmasının, bazı ilaçların veya GTP⁶ gibi fizyolojik moleküllerin bağlanmasıyla olanlara benzer şekilde, mikrotübülün ultrayapısında ince değişikliklere neden olduğunu doğrulamaktadır.

Bu nedenle, lekesiz, sabitlenmemiş numunelerde mikrotübüllerin doğrudan görselleştirilmesi genellikle arzu edilir. Bunu başarmak için, bir teknik çözüm, paralel mikrotübül demetlerinin harmonofor gibi davranma ve yoğun, darbeli bir kızılötesi lazerle uygun şekilde aydınlatıldığında frekansı iki katına çıkaran ışık yayma yeteneğine dayanan ikinci harmonik nesil (SHG) mikroskopi^7'dir. Frekans ikiye katlanabildiği bilinen diğer iki biyolojik materyal olan kollajen ve miyosin'den daha güçlü ve daha kararlı bir ikinci harmonik sinyal üretilebilse de, tübülinden gelen sinyal şimdiye kadar çoğunlukla mitotik iğ yeniden düzenlemelerini incelemek için kullanılmıştır ^8,9,10 ve aksonal mikrotübül morfolojisi^11,12,13.

Bu çalışmada, tübülin beta 4 A (TUBB4A) tübülinopatisinden etkilenen merkezi sinir sistemi (CNS) dokularını sağlıklı muadillerinden ayırt etmek için tanı aracı olarak SHG mikroskobunun yeni bir kullanımını tanıtıyoruz¹⁴. Tübülinin bu ağırlıklı olarak nöral izoformunda meydana gelen mutasyonlardan bazıları, bazal gangliyon ve serebellumun (H-ABC) hipomiyelinasyonuna ve atrofisine neden olanlar gibi, oligodendrositlerde mikrotübül aşırı dolgusunu indükler^15,16; sitoiskelet değişiklikleri, sırayla, dismiyelinasyon gibi aşağı akış etkileriyle, motor ve duyusal yolakların derin bozulmasıyla ilişkilidir^16,17,18,19. Bu çalışmada kullanılan taiep murin modeli, oligodendrositlerde anormal mikrotübül içeriği gösterir ve H-ABC hastalarının duyusal-motor semptomlarının çoğunu özetler¹⁷. Protokol, sağlıklı ve mutant dokular arasındaki SH sinyallerindeki farklılıkları vurgulamak için, genellikle yüksek oranda miyelinli olan ve insan hastalarında ve taiep sıçan^19'da ciddi şekilde etkilenen korpus kallozum ve beyincik olarak yapıların nasıl görüntüleneceğini açıklar.

Protokol

Açıklanan tüm prosedürler, Meksika Hükümeti Sağlık Araştırmalarına İlişkin Genel Sağlık Kanunu Yönetmeliği'nin yedinci başlığında (NOM-062-ZOO-1999) ve Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi'nin tavsiyelerine uygun olarak onaylanmış ve Universidad de Guanajuato ve Benemérita Universidad Autónoma de araştırmalarında kurumsal biyoetik komitesi tarafından onaylanmıştır. Puebla.

1. Mikroskop ayarları

1. Mikroskopi sistemini açın.
2. Numune ekstraksiyonu ve hazırlanmasından sonra optimum ve sabit bir güç seviyesinde lase yapmaya hazır olacağını garanti etmek için darbeli lazeri açın.
3. Lazeri 810 nm'ye ayarlayın. Tissular mikrotübülleri incelemek için, mevcut lazer gücünün% 10-20'si kullanılır, bu da tarif edilen sistemde, hedefin arka odak düzleminde ölçülen 13-26 mW'a karşılık gelir.
4. Mikroskopun SHG görüntülemesi için kullanılacak amaçla Köhler hizalı olduğundan emin olun (Ek Dosya 1).
   NOT: Bu önemlidir, çünkü bu çalışmada kullanılan ticari kurulumda, algılama iletim modunda ve kondenser aracılığıyla gerçekleştirilir.
5. İstenmeyen filtreleri optik algılama yolundan çıkarın (Şekil 1A).
6. Bu seviyede gereksiz yere hiçbir ışığın durmadığından emin olmak için kondenser diyaframının tamamen açıldığından emin olun.
7. Lense küçük bir damla daldırma yağı ile 25x/0,8 sayısal diyafram açıklığına (NA) yağ daldırma hedefi hazırlayın.
   NOT: Bu hedef, 0,55 olan NA≥ kondenserle en iyi eşleşmek için kullanılmıştır (ideal olarak, NA_cond NA_obj).

2. Mikroskop ön kontrolleri

NOT: Kurulum değiştirilmediği sürece ön mikroskop kontrollerini bir kez gerçekleştirin.

1. Görüntü kuru mısır nişastası, lazer polarizasyon yönünü ortaya çıkaran SHG görüntüleri oluşturmak için SHG parametreleri ile cam slaytlar arasına sıkıştırılmıştır. Mısır nişastası için% 5'ten az olan lazer gücü hariç, Ek Dosya 2'de bildirilen adımları izleyin.
2. Seyrek mısır nişastası tanelerinin bir görüntüsünü alın ve x-y düzleminde SHG lobüllerinin yönünü işaretleyin. Bu oryantasyon lazer oryantasyonuna karşılık gelir (Şekil 2A).
3. Kontrol olarak, lazerin salınım yönünü değiştirmek için optik yola yarım dalga plakası ( Şekil 1A'da gösterilen konum) ekleyerek aynı numunenin başka bir görüntüsünü alın. Elde edilen görüntüde döndürülmüş SHG sinyal lobülleri görüntülenir (Şekil 2B, C).
4. SHG için farklı türde bir bant geçişi filtresi kullanıyorsanız, görüntüleri (Şekil 2D, E) ve sinyal yoğunluklarını bir çizgi taraması boyunca piksel piksel karşılaştırarak en iyi iletim özelliklerine sahip olduğundan emin olun (Şekil 2F).

3. Doku ekstraksiyonu

NOT: Cerrahi prosedürleri gerçekleştirmek için daima temiz aletler kullanın.

1. 6-12 aylık taiep sıçanları ve yaşa uygun Sprague-Dawley kontrollerini (WT) kullanın.
2. Hayvanları,% 0.9'luk steril bir NaCl çözeltisi içinde seyreltilmiş bir ketamin-ksilazin karışımının (0.125 mg / Kg ve 5 mg / Kg) bir i.p. enjeksiyonu ile anestezi yapın.
   1. Ağrı reflekslerini kontrol edin ve sadece yoksa, devam edin.
3. Hayvanı kafasını keserek kurban et.
4. Kafa izole edildikten sonra, kafatası tonozunun kemiklerini, üstteki en kaudal noktadan buruna doğru, orbital boşluklardan orta hatta doğru ve daha sonra en kaudal noktadan beynin ve beyinciğin altına kadar orta hat boyunca dikkatlice açın.
   NOT: Kemik kesiciler ve Rongeur'lar, beyin yapılarına zarar vermeden kafa kemiklerinin uygun şekilde çıkarılmasını sağlar.
5. Beyni ve beyinciği kemikten serbest bırakın. İki yarımküre ayrılabilir. Yarımküreler bölünmüşse, SHG görüntüleme için bir yarısını kullanın ve diğer yarısını, sonraki bölümleme ve boyama için kimyasal bir başlık içinde 20 dakika boyunca fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 3.7 paraformaldehit içinde sabitleyin.

4. Vibratom kesitleme

1. Sıcak (37 °C) Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile doldurulmuş bir vibratom tampon tepsisi hazırlayın.
2. Beyni, bir parça maskeleme bandı aracılığıyla siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak numune plakasına sabitleyin. En kaudal kısım / bölge tutkalla temas eder, böylece karşıttan kullanılabilir koronal bölümler, rostral kısım kesilebilir.
   1. Numunenin etkili bir şekilde bağlanmasını sağlamak için tutkalın polimerize olması için ~ 10 s bekleyin.
      NOT: En iyi sonuçlar, beyin bıçağın "bir yandan diğer yana" yerine "yukarıdan aşağıya" keseceği şekilde yönlendirildiğinde elde edilir (Şekil 1B).
3. Numune plakasını tampon tepsisinin içindeki manyetik desteğine aktarın.
4. Üretilen dilimler beynin tüm yüzeyini kapsayana kadar 300-500 μm kesitleri kesmeye başlayın.
5. Bu noktada, bölümün kalınlığını 160 μm'ye düşürün.
6. Korpus kallozum seviyesinde tam bir 160 μm kesit kesildikten sonra, büyük, alevli bir deliğe sahip modifiye edilmiş bir cam Pasteur pipet ile geri kazanın (Şekil 1C).
7. Yeni sıcak HBSS ile temiz bir Petri kabına veya mikroskopi için doğrudan cam desteğine (kapak kayması veya cam tabanlı tabak) aktarın.
   NOT: Açıklanan deneysel koşullar için, numunenin üzerine bir kapak lipi eklemek görüntülemeye zararlıdır.

5. Mikroskopa aktarma

1. Mikroskop farklı bir odadaysa, sıcaklığı korurken doku bölümlerini aktarmak için ısıtılmış jel paketleriyle yalıtımlı bir kutu hazırlayın. Kutu ayrıca bölümleri görüntülenene kadar sıcak tutmaya da yarar.
2. Numuneyi mikroskop altına koyun ve iletilen ışıkla oküler boyunca doğrudan gözlem yaparak hedefin altına doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
   NOT: Amaç, yayılan (ve dolayısıyla algılanan) SHG sinyalini en üst düzeye çıkarmak için tahmin edilen yayan yapıları lazerin salınım yönüyle hizalamaktır.
3. İnce bir sıvı filmin tüm numuneyi kaplaması için fazla HBSS'yi çıkarın. Numunenin aşırı buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için sıvı filmi birkaç dakikada bir görsel olarak kontrol edin.
   NOT: Açıklanan koşullarda, bir bölüm en fazla 20 dakika kullanılır. Numunenin kurutulması ciddi yapay etkilere neden olur (Ek Şekil 1A). Daha fazla HBSS eklemek yerine, daha uzun görüntüleme sürelerine ihtiyaç duyulursa, bölümün periyodik olarak ılık, taze ortamda ıslatılması önerilir. Dokuyu hareketsiz hale getirmek için perfüzyon odalarının ve tutkal veya düşük erime noktalı agarozun kullanılması da daha uzun deneyler yapılacağında önerilir.
4. Mikroskop aşamasını, karanlık inkübasyon odasının tüm kapılarını kapatmayı veya kuluçka odasını siyah naylon poliüretan kaplı bir kumaşla kaplamayı içerebilecek taranmamış görüntüleme için hazırlayın.

6. Görüntüleme

1. İletim yolu boyunca "taranmamış" görüntüleme modunu seçin. Bu şekilde, tübülinin zayıf SH sinyalinin yakalanması optimize edilecektir.
2. LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA hedefini seçin.
3. 12,6 μs piksel bekleme süresiyle 13 mW ile 26 mW arasında bir lazer gücü ayarlayın. Ortalama 15 sn'lik bir yakalama süresi için 512 piksel x 512 pikselden daha büyük olmayan, hız 5 ve ortalama 2 olan görüntüler çekin.
   NOT: Daha yüksek lazer güçleri ve/veya daha uzun bekleme süreleri kullanmak numuneye zarar verebilir (Ek Şekil 1B).
4. Önce 485 nm kısa geçişli filtre (SP485) kullanarak görüntü alın ve ikinci adımda keskin bir 405 nm bant geçişi filtresi ekleyin (BP405; Şekil 3). Ek Dosya 2'de bildirilen adımları izleyin.
   NOT: Sahte parlak alan görüntüleri, görünür bir çizginin artık lazer ışığı kullanılarak aynı dedektör aracılığıyla alınabilir (405 nm veya 488 nm lazerler en iyi sonucu verir).

7. Beyinciğin işlenmesi

1. İlk olarak, beyinciği bir neşterle iki yarım küreye kesin ve daha sonra orta kısımla (kesimden sonra elde edilen düz kısım) vibratom desteğine yapıştırın.
2. Beyinciği beyin için tarif edildiği gibi kesit ve görüntü (160 μm kesitler, aynı vibratom ayarları, aynı bıçak, aynı mikroskop ayarları, vb.).
   NOT: Beyinciğin anatomisi nedeniyle, bölümleme anındaki yönü kritik değildir; yüzeyden uzakta üretilen dilimlerin çoğunda, beyaz maddeye iyi kesitlenmiş folia olacaktır.

Sonuçlar

Bu metodoloji ile elde edilen görüntüler, biyolojik dokularda bulunan çok sınırlı sayıda harmonofor nedeniyle içsel düşük bir arka plan seviyesine sahiptir ve bu da yöntemin önemli avantajlarından biridir.

Korpus kallozumun lifleri görüntülendiğinde, lif benzeri kısa yapılar ve yuvarlak elemanlar taiep beyninde tutarlı bir şekilde bulunabilir (Şekil 3B), kontrol beyninin korpus kallozumu beyin bölgesi boyunca çok daha heterojen ve izotropik bir sinyal göster...

Tartışmalar

SHG mikroskopisi, iki foton uyarma mikroskobu, üçüncü harmonik nesil mikroskopi ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılma mikroskobu içeren ve geleneksel optik mikroskopinin yaşam bilimlerine uygulama yelpazesinin genişletilmesine katkıda bulunan bir grup doğrusal olmayan optik tekniğin bir parçasıdır²⁰.

Spesifik olarak, SHG mikroskobunun ana gücü ve zayıflığı aynı durumla ilgilidir: sinyal üreteci merkez-simetrik olmayan^21'dir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200