JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تدمير خلايا معينة في الجنين هو أداة قوية لدراسة التفاعلات الخلوية المشاركة في مصير الخلية. يصف هذا البروتوكول تقنيات الاستئصال بالليزر للخلايا المستهدفة في الجنين المبكر للطحالب البنية Saccharina latissima.

Abstract

في Saccharina latissima، يتطور الجنين كورقة خلية أحادية الطبقات تسمى الصفيحة أو الشفرة. من السهل ملاحظة كل خلية جنينية ، ويمكن تمييزها بسهولة عن جيرانها ، ويمكن استهدافها بشكل فردي. لعقود من الزمان ، تم استخدام الاستئصال بالليزر لدراسة تطور الجنين. هنا ، تم تطوير بروتوكول للاستئصال بالليزر الخاص بالخلايا للأجنة المبكرة للطحالب البنية S. latissima. يتضمن العمل المعروض: (1) إعداد أجنة السكرينا ، مع وصف للمعلمات الحرجة ، بما في ذلك ظروف الزرع ، (2) إعدادات الاستئصال بالليزر ، و (3) مراقبة النمو اللاحق للجنين المشعع باستخدام المجهر بفاصل زمني. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير تفاصيل حول الظروف المثلى لنقل الأجنة من منصة التصوير إلى المختبر ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل عميق على تطور الجنين اللاحق. الطحالب التي تنتمي إلى رتبة Laminariales تعرض أنماط تكوين جنيني مشابهة ل Saccharina ؛ وبالتالي يمكن نقل هذا البروتوكول بسهولة إلى أنواع أخرى في هذا التصنيف.

Introduction

تم استخدام الاستئصال بالليزر لعقود لدراسة تطور الجنين. إن تشعيع خلايا الجنين بشعاع ليزر يجعل من الممكن مراقبة إمكانات التجدد وتعديل سلالة الخلية أثناء تكوين الجنين والتحقيق في تأثير الاستئصال المستهدف على انقسام الخلايا ومصير الخلية. الكائنات الحية النموذجية المستخدمة في طرق الاستئصال بالليزر هي عادة ، مثل الحشرات 1,2 ، والديدان الخيطية3,4 ، والفقاريات5,6 ، وأحيانا النباتات 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام نهج الاستئصال الدقيق بالليزر على الطحالب البنية Fucus في عامي 1994 و 1998 لإثبات دور جدار الخلية في الاستقطاب الضوئي للجنين المبكر 9,10.

تنتمي الطحالب البنية إلى مجموعة Stramenopiles ، التي تباعدت في جذر شجرة حقيقية النواة منذ 1.6 مليار سنة. ونتيجة لذلك ، فهي مستقلة من الناحية الفيلولوجية عن الكائنات الحية متعددة الخلايا الأخرى ، مثل الحيوانات والنباتات11. ينتمي Saccharina latissima إلى رتبة Laminariales ، والمعروفة أكثر باسم عشب البحر ، وهي من بين أكبر الكائنات الحية على وجه الأرض ، حيث تصل أحجامها إلى أكثر من 30 مترا. Saccharina sp. هي أعشاب بحرية كبيرة تستخدم للعديد من التطبيقات مثل الأغذية والأعلاف ، ويتم استخراج السكريات المتعددة لاستخدامها في الصناعات الزراعية والدوائية والتجميلية في جميع أنحاء العالم12 ، 13. وتتطلب زراعته، وخاصة في آسيا ومؤخرا في أوروبا، إعداد الأجنة في المفرخات قبل إطلاق الأحداث في البحر المفتوح. مثل جميع عشب البحر ، لديها دورة حياة ثنائية الطور تتكون من مرحلة أمشاج مجهرية ، تنمو خلالها أمشاج فردية وتنتج أمشاج للإخصاب ، ومرحلة بوغية مجهرية ثنائية الصبغيات ، حيث تتطور شفرة مستوية كبيرة من ثباتها المرتبط بقاع البحر أو الصخور. يطلق البوغي جراثيم فردية عند النضج ، وبالتالي يكمل دورة الحياة 14،15،16.

يقدم S. latissima بعض الميزات المورفولوجية المثيرة للاهتمام17. يتطور جنينها كورقة مستوية أحادية الطبقات15،18،19 قبل الحصول على بنية متعددة الطبقات تتزامن مع ظهور أنواع مختلفة من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، Laminariales هي واحدة من الأصناف الوحيدة من الطحالب البنية التي تظل أجنتها مرتبطة بأنسجتها الأمومية (Desmarestiales و Sporochnales تفعل15 أيضا). توفر هذه الميزة الفرصة لدراسة دور أنسجة الأمهات في هذه العملية التنموية ومقارنة آليات مراقبة الأم في الطحالب البنية مع تلك الموجودة في الحيوانات والنباتات.

تقدم هذه المقالة أول بروتوكول كامل للاستئصال بالليزر في جنين عشب البحر المبكر. ينتج عن هذا البروتوكول الذي يتضمن تقنية نبضات الأشعة فوق البنفسجية NS تدميرا محددا لخلايا الجنين الفردية لدراسة أدوار كل منها أثناء تكوين الجنين. يوفر هذا الإجراء نهجا موثوقا به للتحقيق في تفاعلات الخلايا ومصير الخلايا أثناء التكوين الجنيني في Laminariales.

Protocol

1. إنتاج Saccharina latissima gametophytes

  1. جمع النباتات البوغية الناضجة من S. latissima من البرية كما هو موضح سابقا20,21. تأكد من أن النباتات البوغية المختارة خالية من النباتات النباتية (الكائنات الحية الصغيرة المرئية على سطح الشفرة) أو الطفيليات الداخلية (الموجودة في المناطق المبيضة أو البقع على الشفرة).
  2. باستخدام مشرط ، قم بقطع الجزء الأكثر قتامة في وسط الشفرة (الأنسجة المنتجة للبوغ الخصيب22) إلى 1-5 قطع مربعة (1 سم مربع) ، وتجنب أي بقع مبيضة ، إن وجدت.
  3. قم بإزالة أي نباتات متبقية عن طريق تنظيف القطع المقطوعة بلطف باستخدام الجزء الخلفي من مشرط وبعض الورق الماص.
  4. ضع القطع النظيفة في طبق زجاجي مملوء بمياه البحر الطبيعية المعقمة (انظر جدول المواد) لمدة 45 دقيقة لإطلاق الجراثيم بعد التقرير22 المنشور سابقا.
  5. قم بإزالة قطع الشفرة وتصفية مياه البحر من خلال مصفاة خلايا 40 ميكرومتر لإزالة الحطام أو الكائنات الحية غير المرغوب فيها.
  6. تمييع الجراثيم في الترشيح إلى تركيز 20-40 جراثيم / مل في أطباق بتري البلاستيكية22.
  7. ضع محلول البوغ في خزانة استزراع (انظر جدول المواد) تم تكوينها مع ظروف الاستزراع المثلى (13 درجة مئوية ، 24 μE.m-2.s-1 ، الفترة الضوئية 16: 8 L: D).
  8. اسمح للجراثيم أن تنبت وتتطور إلى نباتات مشيمة.
    ملاحظة: إنبات بوغ مرئي بعد 2 أيام في الخزانة ، وعادة ما يحدث الانقسام الخلوي الأول للخلايا الأمشاج خلال 48 ساعة التالية.
  9. استبدل وسط النمو بعد 5 أيام بمياه البحر الطبيعية المصفاة الدقيقة المخصبة بمحلول بروفاسولي 0.5x (NSW1/2) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: لتجنب تكرار هذه الخطوات، يمكن اختيار نباتات أمشاج محددة من الذكور والإناث ونشرها نباتيا لعدة أشهر. وتظل النباتات المشيمية نباتية عندما تنمو تحت الضوء الأحمر (4 μE.m-2.s-1 بطول موجي لا يقل عن 580 نانومتر)23 في نفس ظروف الاستزراع الموصوفة أعلاه (الخطوة 1.7).

2. تجزئة وتحريض تكوين البويضات

  1. حصاد النباتات المشيمية مع مكشطة الخلية.
  2. باستخدام مدقة بلاستيكية صغيرة ، سحق النباتات المشيمة التي تم جمعها في أنبوب 1.5 مل إلى قطع 4-5 خلايا.
  3. املأ الأنبوب ب 1 مل NSW1/2 (الخطوة 1.9).
  4. أضف 2.5 ميكرولتر من محلول الأمشاج المسحوق إلى 3 مل من مياه البحر الطبيعية المخصبة بمحلول بروفاسولي 1x (نيو ساوث ويلز) وضعها في طبق بتري.
    ملاحظة: يوصى باستخدام طبق بتري ذو قاع زجاجي مقاس 25 مم لتسهيل التعامل معه.
  5. ضع الأطباق المعدة في خزانة الثقافة وحث تكوين الأمشاج عند 13 درجة مئوية تحت الضوء الأبيض بكثافة 24 μE.m-2.s-1 (الضوء الخافت ، الفترة الضوئية 16: 8 L: D).
    ملاحظة: يمكن ملاحظة أول gametangia (oogonia الإناث و archegonia الذكور) بعد 5 أيام. الذكر متفرع بشكل مفرط مع خلايا صغيرة ، وتتكون الأنثى من خلايا أكبر تشكل خيوط طويلة15,22. لوحظت البويضات الأولى ~ 10 أيام في وقت لاحق ، وعادة ما يحدث الانقسام الأول من الزيجوت في غضون يومين التاليين.
  6. بعد ستة أيام من مراقبة البيض الأول ، انقل الأطباق إلى ظروف إضاءة بيضاء أكثر إشراقا: 50 μE.m-2.s-1 ، الفترة الضوئية 16: 8 L: D ، لا تزال عند 13 درجة مئوية.

3. الحصول على صورة لاختيار الأجنة للاستئصال ومراقبة النمو اللاحق

  1. قم بتصوير طبق بتري بأكمله (إعادة) تحديد موقع الأجنة المختارة أثناء خطوة الاستئصال (لا حاجة لإعادة الطبق إلى مجهر العين) ومراقبة التطور اللاحق للأجنة المختارة.
    ملاحظة: استخدم المجهر البؤري المقلوب الموسع بالليزر (انظر جدول المواد) للتصوير (الشكل 1)، ويتم وصف الاستئصال بالليزر في الخطوة 5.
  2. ضع طبق بتري على المسرح ووجهه بعلامة مرئية (على سبيل المثال ، ارسم خطا بعلامة دائمة).
  3. استخدم هدف 10x/0.45 للتركيز على الجنين. سجل موضع النقاط الأساسية الأربع لطبق بيتري.
  4. ابدأ فحص البلاط. احصل على صور مرسلة / فلورسنت لطبق بتري بأكمله بدقة منخفضة: 256 × 256 بكسل ، ووقت بقاء بكسل يبلغ 1.54 ميكروثانية مع المسح الضوئي ثنائي الاتجاه ، وتكبير رقمي بمعدل 0.6x باستخدام ليزر 561 نانومتر عند إرسال 1.2٪.
    ملاحظة: وقت المسح الضوئي لطبق بتري كامل بحجم 2.5 سم هو ~ 6 دقائق ل 225 بلاطة (الشكل 2). هنا ، تم استخدام ليزر 561 نانومتر للانتقال والتصوير الفلوري. تم جمع إشارة التألق بين 580-720 نانومتر على المضاعفات الضوئية البؤرية (PMT) وتم جمع الضوء المرسل على PMT المرسل. يمكن لليزر 561 نانومتر أيضا مراقبة الكلوروفيل في هذه الخطوة ، لكنه غير ضروري لأنه يساعد فقط على التمييز بين ضوضاء الإشارة والكائنات الحية بشكل صحيح.
  5. احفظ صورة المسح الضوئي للتجانب واجعلها مفتوحة في نافذة برنامج الحصول على الصور (انظر جدول المواد).
  6. تغيير الهدف ، لا تقم بإزالة طبق بيتري.
    ملاحظة: تم نقل الهدف المائي 40x/1.2 إلى جانب المرحلة بحيث يمكن إضافة وسط الغمر (الماء) إلى الهدف دون تحريك طبق بتري من موضعه الأولي.
  7. انتقل عبر صورة مسح البلاط التي تم الحصول عليها مسبقا لتحديد الجنين المناسب. بمجرد تحديد الجنين على هذه الصورة ، انقل المرحلة إلى الموضع الدقيق للجنين واحصل على صور منقولة / فلورسنت لهذا الجنين بدقة عالية.
    ملاحظة: إعدادات عالية الدقة: 512 × 512 بكسل، 0.130 ميكرومتر/بكسل، 0.208 ميكروثانية بكسل وقت الإقامة مع المسح الضوئي أحادي الاتجاه والتكبير/التصغير الرقمي 2x باستخدام ليزر 561 نانومتر عند إرسال 0.9٪.
  8. قم بالتعليق على صورة مسح البلاط لكل جنين مرشح للاستئصال بالليزر (الشكل 2B) وانتقل إلى خطوة الاستئصال بالليزر.

4. معايرة الليزر

  1. قم بمعايرة الليزر ومزامنة برنامج الحصول على الصور مع برنامج تشغيل الليزر في "وضع Click & Fire" وليزر نبضي 355 نانومتر.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لضمان التزامن المثالي بين موضع مؤشر الماوس في برنامج تشغيل الليزر (انظر جدول المواد) مع الموضع في الصورة الحية لبرنامج الاقتناء.
  2. افتح حزمة برامج تشغيل الليزر وانقر على Live في حزمة برامج الحصول على الصور.
  3. قم بمزامنة حزمتي البرامج بالنقر فوق بدء الاستحواذ في حزمة برامج تشغيل الليزر. يتم تسجيل الصورة الحية الآن أيضا في برنامج تشغيل الليزر فوق البنفسجي.
  4. حدد مجال الاهتمام (AOI) من خلال النقر على زر اختيار AOI والنقر على حواف الصورة (اليمين واليسار والأعلى والأسفل) في حزمة برامج تشغيل ليزر الأشعة فوق البنفسجية.
    ملاحظة: بعد خطوة المعايرة هذه، يجب أن تظل إعدادات حجم البكسل وتنسيق الصورة والتكبير/التصغير في حزمة برامج الاكتساب ثابتة.
  5. حدد منطقة فارغة على الطبق واخفض مستوى المرحلة إلى 20 ميكرومتر أسفل المستوى البؤري للعينة للتركيز على القاع الزجاجي.
  6. اضبط مسارات ليزر الاستئصال والتصوير بالليزر بالنقر فوق بدء المعايرة واختر المعايرة اليدوية.
  7. حدد طاقة ليزر عالية بما يكفي لرؤية نقطة سوداء في وسط الصورة الحية المقابلة للثقب الموجود في الغطاء الزجاجي (يجب أن تكون جميع المصاريع مفتوحة).
  8. انقر فوق هذه النقطة السوداء المركزية باستخدام مؤشر الماوس وانقر فوق 18 نقطة إضافية اقترحها البرنامج لإكمال إجراء المحاذاة.
  9. تحقق من المعايرة في "وضع Click & Fire" على نفس الغطاء.
    ملاحظة: تعتمد معايرة الليزر على معلمات التصوير. بمجرد معايرة الليزر ، تأكد من أن معلمات التصوير (أي 512 × 512 بكسل ، 0.130 ميكرومتر / بكسل ، 0.208 ميكروثانية بكسل وقت الإقامة مع المسح الضوئي أحادي الاتجاه والتكبير الرقمي 2x) لم تتغير.

5. الاستئصال بالليزر

  1. اختر جنينا مثيرا للاهتمام. ابدأ التسجيل بفاصل زمني في برنامج الحصول على الصور.
  2. احصل على صور مرسلة / فلورية بهدف 40x / 1.2 W بدقة عالية (أي 512 × 512 بكسل ، 0.130 ميكرومتر / بكسل ، 1.54 ميكروثانية بكسل وقت الإقامة مع المسح الضوئي أحادي الاتجاه والتكبير الرقمي 2x باستخدام ليزر 561 نانومتر عند إرسال 0.9٪). احصل على تسجيل الفاصل الزمني بأقصى سرعة.
  3. قم بالتصغير من المنطقة في بداية تسجيل الفاصل الزمني. قم بتكبير الهيئة العربية للتصنيع.
  4. استخدم وظيفة "Click & Fire" لبرنامج تشغيل الليزر لتطبيق التشعيع الضار على الخلية ذات الأهمية في الجنين. استخدم المعلمات التالية: 45٪ من الإرسال بالليزر (المقابلة لحد أقصى 40 ميكروواط) ومدة النبض 1 مللي ثانية (الخطوة 4).
    ملاحظة: يوصى بتسجيل الفيديو أثناء التصوير بالليزر.
  5. تحت 688 نانومتر ، راقب طرد البلاستيدات الخضراء ذاتية الفلورسنت من السيتوبلازم.
  6. إذا بقيت محتويات الخلية في الخلية، فاستخدم وظيفة "Click & Fire" مرة أخرى لزيادة حجم الخرق في الخلية. كرر ذلك، مع الحفاظ على عدد اللقطات عند الحد الأدنى حتى يتم تحرير معظم محتويات الخلية.
  7. أوقف تسجيل الفاصل الزمني بعد استقرار الجنين (أي أنه لا يمكن اكتشاف أي حركة أخرى داخل الخلايا (~ 1-5 دقائق).
  8. قم بتحديث التعليق التوضيحي على صورة المسح الضوئي للتجانب، إذا لزم الأمر.

6. مراقبة نمو الأجنة المشععة

ملاحظة: تتم المراقبة على مدار عدة أيام.

  1. تحديد معدل البقاء على قيد الحياة من خلال مراقبة عدد الأجنة التي تتطور بعد الاستئصال بالليزر ومقارنتها بتلك التي تموت.
    ملاحظة: تموت بعض الأجنة مباشرة بعد الاستئصال لأسباب مختلفة. عادة ما يكون معدل الوفيات المرتفع والسريع علامة على معلمات الليزر غير المناسبة أو التعرض الأعلى / الطويل للإجهاد أثناء التجربة أو النقل اللاحق.
  2. تحديد تأخر النمو عن طريق قياس طول الأجنة التي يتم تصويرها بالليزر كل يوم ومقارنتها بالأجنة السليمة.
    ملاحظة: معدل نمو الكائنات الحية التي يتم تصويرها بالليزر أبطأ عموما من معدل نمو الكائنات الحية غير المعالجة. ومع ذلك ، يمكن لبعض إعدادات الليزر (غير المناسبة) أن تمنع النمو لأكثر من أسبوع ، مع استئناف النمو بعد ذلك.
  3. تعرف على الضرر المجاور من خلال مراقبة تفاعل الخلايا المجاورة للخلايا التي تم إزالتها. في بعض الحالات، قد يؤدي انخفاض الضغط بعد الانفجار إلى انفجار الخلايا المجاورة.
  4. تحقق من وجود تلوث الميكروبات. مراقبة نمو الطحالب الدقيقة والبكتيريا في الوسط. إذا كان هناك مستوى غير عادي من الميكروبات موجودة في الطبق ، فقم بالتخلص منه وكرر البروتوكول من الخطوة 2 أو الخطوة 3.
    ملاحظة: بعد الاستئصال بالليزر ، تكون أجنة S. latissima التالفة مجهدة للغاية بالفعل ، ويمكن أن يتسبب الإجهاد الخارجي الإضافي في زيادة معدل الوفيات. من الممكن حدوث فاشيات بكتيرية أو فيروسية لأن الأجنة المعالجة لا يمكن أن تنمو في ظروف محورية.
  5. التحقق من التطور العالمي للكائنات الملقحة من خلال دراسة النمط الظاهري وفهم الدور في تطوير المنطقة المستهدفة.

النتائج

نمت النباتات المشيمية من S. latissima ، وتم تحفيز تكوين الأمشاج لإنتاج الزيجوت والأجنة. بعد اثني عشر يوما من تحريض تكوين الأمشاج ، خضعت الأجنة للاستئصال بالليزر. هنا ، تهدف التجربة إلى تقييم دور خلايا محددة في التطور الشامل لأجنة S. latissima. تم استهداف الخلية الأكثر قمية ، والخلايا القاع?...

Discussion

يسمح الاستئصال بالليزر الخلوي المحلي بالاستئصال الزماني والمكاني بمستوى عال من الدقة. ومع ذلك ، يمكن أن تعرقل كفاءتها عدم إمكانية الوصول إلى الخلايا المستهدفة ؛ على سبيل المثال ، جميع الخلايا هي من جنين ثلاثي الأبعاد. تم تطوير هذا البروتوكول على جنين الطحالب Saccharina latissima، التي تطور صف...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يتم تمويل منحة الدكتوراه من S.B. من قبل Region Bretagne (رقم منحة ARED COH20020) وجامعة السوربون. يتم تمويل منحة الدكتوراه I.T.is من قبل Region Bretagne (رقم منحة ARED COH18020) وجامعة NMBU النرويجية. وقد تلقى هذا المشروع دعما ماليا من المركز الوطني للبحث العلمي من خلال برامج MITI المتعددة التخصصات. MRic هي عضو في البنية التحتية الوطنية France-BioImaging التي تدعمها الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-10-INBS-04).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
25 mm glass bottom petri dishNEST801001
Autoclaved sea water-Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraperMED 283.3951
Cell strainer 40 µmCorning / Falcon352340
Culture cabinetsSnijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscopeCarl Zeiss microscopy, Jena, GermanyAblation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestlesSigma AldrichZ359947Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement-Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
ScalpelParamountPDSS 11
SysCon softwareRapp OptoElectronic, Wedel, GermanyLaser-driver software
ZEN softwareCarl Zeiss microscopy, Jena, GermanyImaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version

References

  1. Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), 290-293 (1991).
  2. Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
  3. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
  4. Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
  5. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
  6. Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
  7. Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
  8. Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , 237-250 (1998).
  9. Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), 1421-1423 (1994).
  10. Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
  11. Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
  12. Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
  13. Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
  14. Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), 221-260 (1936).
  15. Fritsch, F. E. . The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , (1945).
  16. Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
  17. Theodorou, I., Charrier, B., Boutet, A., Schierwater, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. , 485 (2021).
  18. Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
  19. Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
  20. Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. , 37-59 (2018).
  21. Bartsch, I., Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. , 61-78 (2018).
  22. Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -. G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
  23. Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
  24. de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
  25. Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
  26. Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
  27. Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, &. #. 2. 0. 1. ;., Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved