Ablation laser ciblée dans l’embryon de Saccharina latissima

Résumé

La destruction de cellules spécifiques dans l’embryon est un outil puissant pour étudier les interactions cellulaires impliquées dans le destin cellulaire. Le présent protocole décrit les techniques d’ablation au laser de cellules ciblées dans l’embryon précoce de l’algue brune Saccharina latissima.

Résumé

Chez Saccharina latissima, l’embryon se développe sous la forme d’une feuille cellulaire monocouche appelée la lame ou lame. Chaque cellule embryonnaire est facile à observer, facilement reconnaissable de ses voisines et peut être ciblée individuellement. Pendant des décennies, l’ablation au laser a été utilisée pour étudier le développement embryonnaire. Ici, un protocole d’ablation au laser spécifique aux cellules a été développé pour les embryons précoces de l’algue brune S. latissima. Les travaux présentés comprennent: (1) la préparation d’embryons de Saccharina , avec une description des paramètres critiques, y compris les conditions de culture, (2) les paramètres d’ablation au laser, et (3) la surveillance de la croissance ultérieure de l’embryon irradié à l’aide de la microscopie time-lapse. En outre, des détails sont fournis sur les conditions optimales pour le transport des embryons de la plate-forme d’imagerie vers le laboratoire, ce qui peut affecter profondément le développement ultérieur des embryons. Les algues appartenant à l’ordre des Laminariales présentent des schémas d’embryogenèse similaires à saccharina; ce protocole peut ainsi être facilement transféré à d’autres espèces de ce taxon.

Introduction

L’ablation au laser est utilisée depuis des décennies pour étudier le développement embryonnaire. L’irradiation des cellules embryonnaires à l’aide d’un faisceau laser permet de surveiller le potentiel de régénération et la modification de la lignée cellulaire au cours de l’embryogenèse et d’étudier l’impact de l’ablation ciblée sur la division cellulaire et le devenir cellulaire. Les organismes modèles utilisés dans les méthodes d’ablation au laser sont généralement des animaux, tels que les insectes ^1,2, les nématodes ^3,4, les vertébrés ^5,6 et parfois les plantes ^7,8. De plus, une approche de micro-ablation au laser a été utilisée sur l’algue brune Fucus en 1994 et 1998 pour démontrer le rôle de la paroi cellulaire dans la photopolarisation de l’embryon précoce ^9,10.

Les algues brunes appartiennent au groupe des Stramenopiles, qui ont divergé à la racine de l’arbre eucaryote il y a 1,6 milliard d’années. En conséquence, ils sont phylogénétiquement indépendants des autres organismes multicellulaires, tels que les animaux et les plantes¹¹. Saccharina latissima appartient à l’ordre des Laminariales, plus communément appelés varechs, et ils sont parmi les plus grands organismes sur terre, atteignant des tailles de plus de 30 m. Saccharina sp. est une grande algue utilisée pour de nombreuses applications telles que l’alimentation humaine et animale, et ses polysaccharides sont extraits pour être utilisés dans les industries agricoles, pharmacologiques et cosmétiques du monde entier^{12, 13}. Sa culture, principalement en Asie et plus récemment en Europe, nécessite la préparation d’embryons dans des écloseries avant de relâcher des juvéniles en pleine mer. Comme tous les varechs, il a un cycle de vie biphasique composé d’une phase gamétophytique microscopique, au cours de laquelle un gamétophyte haploïde se développe et produit des gamètes pour la fécondation, et d’une phase sporophytique macroscopique diploïde, où une grande lame plane se développe à partir de sa retenue attachée au fond marin ou aux rochers. Le sporophyte libère des spores haploïdes à maturité, complétant ainsi le cycle de vie 14,15,16.

S. latissima présente des caractéristiques morphologiques intéressantes¹⁷. Son embryon se développe sous la forme d’une feuille plane monocouche 15,18,19 avant d’acquérir une structure multicouche coïncidant avec l’émergence de différents types de tissus. De plus, Laminariales est l’un des seuls taxons d’algues brunes dont les embryons restent attachés à leur tissu gamétophyte maternel (Desmarestiales et Sporochnales en font trop¹⁵). Cette fonctionnalité offre l’occasion d’étudier le rôle du tissu maternel dans ce processus de développement et de comparer les mécanismes de contrôle maternel chez les algues brunes avec ceux des animaux et des plantes.

Cet article présente le premier protocole complet pour l’ablation au laser dans un embryon de varech précoce. Ce protocole impliquant la technique UV ns-pulsed entraîne la destruction spécifique de cellules embryonnaires individuelles pour étudier leurs rôles respectifs au cours de l’embryogenèse. La procédure offre une approche fiable pour étudier les interactions cellulaires et le devenir cellulaire au cours de l’embryogenèse chez les laminariales.

Protocole

1. Production de Saccharina latissima gametophytes

1. Recueillir des sporophytes matures de S. latissima dans la nature comme décrit précédemment^20,21. Assurez-vous que les sporophytes sélectionnés sont dépourvus d’épiphytes (petits organismes visibles à la surface de la lame) ou de parasites internes (présents dans les zones blanchies ou les taches sur la lame).
2. À l’aide d’un scalpel, coupez la partie la plus sombre au centre de la lame (tissu fertile producteur de^{spores 22}) en 1 à 5 morceaux carrés (1 cm²), en évitant toute tache blanchie, le cas échéant.
3. Enlevez les épiphytes restants en nettoyant doucement les morceaux coupés avec le dos d’un scalpel et du papier absorbant.
4. Placez les morceaux nettoyés dans un plat en verre rempli d’eau de mer naturelle stérile (voir tableau des matériaux) pendant 45 minutes pour libérer des spores à la suite du rapport²² publié précédemment.
5. Retirez les morceaux de lame et filtrez l’eau de mer à travers une passoire cellulaire de 40 μm pour éliminer les débris ou les organismes indésirables.
6. Diluer les spores dans le filtrat à une concentration de 20-40 spores/mL dans des boîtes de Petri en plastique²².
7. Placer la solution de spores dans une armoire de culture (voir Tableau des matériaux) configurée avec les conditions de culture optimales (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, photopériode 16:8 L:D).
8. Laissez les spores germer et se développer en gamétophytes.
   REMARQUE: La germination des spores est visible après 2 jours dans l’armoire et la première division cellulaire des cellules gamétophytes se produit généralement dans les 48 heures suivantes.
9. Remplacer le milieu de croissance après 5 jours par de l’eau de mer naturelle microfiltrée enrichie d’une solution de Provasoli 0,5x (NSW1/2) (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE: Pour éviter de répéter ces étapes, des gamétophytes mâles et femelles spécifiques peuvent être sélectionnés et propagés végétativement pendant plusieurs mois. Les gamétophytes restent végétatifs lorsqu’ils sont cultivés sous lumière rouge (4 μE.m-2.s-1 avec une longueur d’onde d’au moins 580 nm)²³ dans les mêmes conditions de culture décrites ci-dessus (étape 1.7).

2. Fragmentation et induction de l’oogenèse

1. Récoltez les gamétophytes avec un grattoir cellulaire.
2. À l’aide d’un petit pilon en plastique, écrasez les gamétophytes collectés dans un tube de 1,5 mL en morceaux de 4 à 5 cellules.
3. Remplissez le tube avec 1 mL NSW1/2 (étape 1.9).
4. Ajouter 2,5 μL de la solution de gamétophyte broyée dans 3 mL d’eau de mer naturelle enrichie de 1x solution de Provasoli (NSW) et les placer dans une boîte de Pétri.
   REMARQUE: Une boîte de Petri à fond de verre de 25 mm est recommandée pour une manipulation plus facile.
5. Placer les plats préparés dans une armoire de culture et induire la gamétogenèse à 13 °C sous une lumière blanche d’une intensité de 24 μE.m-2.s-1 (lumière tamisée, photopériode 16:8 L:D).
   REMARQUE: La première gametangia (oogonie femelle et archégonie mâle) peut être observée après 5 jours. Le mâle est hyper-ramifié avec de petites cellules, et la femelle est composée de cellules plus grandes formant de longs filaments^15,22. Les premiers œufs sont observés ~ 10 jours plus tard, et la première division de zygotes se produit généralement dans les 2 jours suivants.
6. Six jours après avoir observé les premiers œufs, transférer la vaisselle dans des conditions de lumière blanche plus vive : 50 μE.m-2.s-1, photopériode 16:8 L:D, toujours à 13 °C.

3. Acquisition d’images pour la sélection d’embryons à ablation et le suivi de la croissance ultérieure

1. Imagez l’ensemble de la boîte de Pétri pour (re)localiser les embryons sélectionnés lors de l’étape d’ablation (pas besoin de renvoyer la boîte au microscope oculaire) et surveiller le développement ultérieur des embryons sélectionnés.
   REMARQUE: Utilisez un microscope confocal à balayage laser inversé (voir tableau des matériaux) pour l’imagerie (Figure 1), et l’ablation au laser est décrite à l’étape 5.
2. Placez la boîte de Petri sur la scène et orientez-la avec une marque visuelle (par exemple, tracez une ligne avec un marqueur permanent).
3. Utilisez l’objectif 10x/0,45 pour vous concentrer sur un embryon. Notez la position des quatre points cardinaux de la boîte de Pétri.
4. Lancez l’analyse des vignettes. Acquérir des images transmises/fluorescentes de l’ensemble de la boîte de Petri à basse résolution : 256 x 256 pixels, un temps de séjour en pixels de 1,54 μs avec balayage bidirectionnel et un zoom numérique de 0,6x à l’aide d’un laser de 561 nm à 1,2 % de transmission.
   REMARQUE: Le temps de numérisation pour une boîte de Petri entière de 2,5 cm est d’environ 6 min pour 225 tuiles (Figure 2). Ici, le laser 561 nm a été utilisé pour l’imagerie par transmission et fluorescence. Le signal de fluorescence a été collecté entre 580 et 720 nm sur les photomultiplicateurs confocaux (PMT) et la lumière transmise a été collectée sur les PMT transmis. Le laser 561 nm peut également surveiller la chlorophylle à cette étape, mais il est inutile car il aide seulement à distinguer correctement le bruit du signal et les organismes.
5. Enregistrez l’image de numérisation par vignette et gardez-la ouverte dans la fenêtre du logiciel d’acquisition d’images (voir Tableau des matériaux).
6. Changez l’objectif, ne retirez pas la boîte de Pétri.
   REMARQUE: L’objectif d’eau 40x / 1.2 a été déplacé sur le côté de la scène afin que le milieu d’immersion (eau) puisse être ajouté à l’objectif sans déplacer la boîte de Petri de sa position initiale.
7. Parcourez l’image de numérisation de tuile précédemment acquise pour sélectionner l’embryon approprié. Une fois qu’un embryon a été identifié sur cette image, déplacez la scène à la position exacte de l’embryon et acquérez des images transmises / fluorescentes de cet embryon à haute résolution.
   REMARQUE: Paramètres haute résolution: 512 x 512 pixels, 0,130 μm / pixel, temps de séjour de 0,208 μs pixel avec balayage monodirectionnel et zoom numérique 2x à l’aide d’un laser 561 nm à 0,9% de transmission.
8. Annotez l’image de balayage par tuile pour chaque embryon candidat à l’ablation au laser (Figure 2B) et passez à l’étape d’ablation au laser.

4. Calibrage laser

1. Calibrez le laser et synchronisez le logiciel d’acquisition d’images avec le logiciel du pilote laser en mode " Click & Fire " et un laser pulsé de 355 nm.
   REMARQUE: Cette étape est cruciale pour assurer une synchronisation parfaite entre la position du curseur de la souris dans le logiciel du pilote laser (voir Tableau des matériaux) et la position dans l’image en direct du logiciel d’acquisition.
2. Ouvrez le progiciel du pilote laser et cliquez sur Live in the image acquisition software package.
3. Synchronisez les deux progiciels en cliquant sur Démarrer l’acquisition dans le progiciel du pilote laser. L’image en direct est désormais également enregistrée dans le logiciel de pilote laser UV.
4. Définissez une zone d’intérêt (AOI) en cliquant sur le bouton Choisir AOI et en cliquant sur les bords de l’image (droite, gauche, haut et bas) dans le progiciel du pilote laser UV.
   REMARQUE: Après cette étape d’étalonnage, les paramètres de taille de pixel, de format d’image et de zoom dans le progiciel d’acquisition doivent rester constants.
5. Sélectionnez une zone vide sur le plat et abaissez le niveau de la scène à 20 μm sous le plan focal de l’échantillon pour vous concentrer sur le fond en verre.
6. Réglez les trajectoires du laser d’ablation et du laser d’imagerie en cliquant sur Démarrer l’étalonnage et choisissez Étalonnage manuel.
7. Sélectionnez une puissance laser suffisamment élevée pour voir un point noir au centre de l’image en direct correspondant au trou dans le couvercle en verre (tous les volets doivent être ouverts).
8. Cliquez sur ce point noir central avec le curseur de la souris et cliquez sur 18 points supplémentaires proposés par le logiciel pour compléter la procédure d’alignement.
9. Vérifiez l’étalonnage en « Mode Click & Fire » sur le même couvercle.
   REMARQUE: L’étalonnage laser dépend des paramètres d’imagerie. Une fois le laser étalonné, assurez-vous que les paramètres d’imagerie (c.-à-d. 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel avec balayage monodirectionnel et zoom numérique 2x) n’ont pas changé.

5. Ablation au laser

1. Sélectionnez un embryon d’intérêt. Démarrez un enregistrement en accéléré dans le logiciel d’acquisition d’images.
2. Acquérir des images transmises/fluorescence avec un objectif de 40x/1,2 W à haute résolution (c.-à-d. 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 1,54 μs pixel de temps d’arrêt avec balayage monodirectionnel et zoom numérique 2x à l’aide d’un laser de 561 nm à 0,9 % de transmission). Acquérir l’enregistrement en accéléré à la vitesse maximale.
3. Effectuez un zoom arrière sur la zone au début de l’enregistrement en accéléré. Zoomez sur l’AOI.
4. Utilisez la fonction « Click & Fire » du logiciel de pilote laser pour appliquer l’irradiation dommageable sur la cellule d’intérêt de l’embryon. Utilisez les paramètres suivants : 45 % de transmission laser (correspondant à un maximum de 40 μW) et une durée d’impulsion de 1 ms (étape 4).
   REMARQUE: L’enregistrement vidéo pendant la prise de vue laser est recommandé.
5. Sous 688 nm, surveiller l’éjection des chloroplastes autofluorescents du cytoplasme.
6. Si le contenu de la cellule reste dans la cellule, utilisez à nouveau la fonction « Click & Fire » pour augmenter la taille de la brèche dans la cellule. Répétez l’opération, en maintenant le nombre de tirs au minimum jusqu’à ce que la plupart du contenu de la cellule ait été libéré.
7. Arrêtez l’enregistrement en accéléré une fois que l’embryon s’est stabilisé (c’est-à-dire qu’aucun autre mouvement intracellulaire ne peut être détecté (~ 1-5 min).
8. Mettez à jour l’annotation sur l’image de numérisation de vignette, si nécessaire.

6. Surveillance de la croissance des embryons irradiés

REMARQUE: La surveillance est effectuée sur plusieurs jours.

1. Déterminez le taux de survie en surveillant le nombre d’embryons qui se développent après l’ablation au laser et comparez-les à ceux qui meurent.
   REMARQUE: Certains embryons meurent immédiatement après l’ablation pour diverses raisons. Un taux de mortalité élevé et rapide est généralement le signe de paramètres laser inappropriés ou d’une exposition plus élevée ou plus longue au stress pendant l’expérience ou le transport ultérieur.
2. Déterminez le retard de croissance en mesurant la longueur des embryons tirés au laser chaque jour et en la comparant à des embryons intacts.
   REMARQUE: Le taux de croissance des organismes à tir laser est généralement plus lent que celui des organismes non traités. Cependant, certains réglages laser (inappropriés) peuvent inhiber la croissance pendant plus d’une semaine, la croissance reprenant après cela.
3. Découvrez les dommages adjacents en surveillant la réaction des cellules adjacentes aux cellules ablées. Dans certains cas, la dépressurisation post-éclatement peut provoquer l’éclatement des cellules voisines.
4. Vérifiez s’il y a des contaminations microbiennes. Surveiller la croissance des microalgues et des bactéries dans le milieu. Si un niveau inhabituel de microbes est présent dans le plat, jetez-le et répétez le protocole de l’étape 2 ou de l’étape 3.
   REMARQUE: Après l’ablation au laser, les embryons de S. latissima endommagés sont déjà très stressés et un stress externe supplémentaire peut entraîner une mortalité accrue. Des épidémies bactériennes ou virales sont possibles parce que les embryons traités ne peuvent pas se développer dans des conditions axeniques.
5. Vérifier le développement global des organismes grenailleux en étudiant le phénotype et en comprenant le rôle dans le développement de la région ciblée.

Résultats

Des gamétophytes de S. latissima ont été cultivés et la gamétogenèse a été induite pour produire des zygotes et des embryons. Douze jours après l’induction de la gamétogenèse, les embryons ont subi une ablation au laser. Ici, l’expérience visait à évaluer le rôle de cellules spécifiques dans le développement global des embryons de S. latissima . Les cellules les plus apicales, les cellules les plus basales et les cellules médianes ont été ciblées. Après le balayage des carreaux...

Discussion

L’ablation laser cellulaire locale permet une ablation temporelle et spatiale avec un haut niveau de précision. Cependant, son efficacité peut être entravée par la non-accessibilité des cellules cibles; par exemple, toutes les cellules sont d’un embryon tridimensionnel. Ce protocole a été développé sur l’embryon de l’algue Saccharina latissima, qui développe une lame monocouche dans laquelle toutes les cellules peuvent être facilement distinguées et détruites individuellement avec un faiscea...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm glass bottom petri dish	NEST	801001
Autoclaved sea water	-		Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper	MED 2	83.3951
Cell strainer 40 µm	Corning / Falcon	352340
Culture cabinets	Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01		Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles	Sigma Aldrich	Z359947	Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement	-		Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel	Paramount	PDSS 11
SysCon software	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany		Laser-driver software
ZEN software	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version