Таргетная лазерная абляция у эмбриона Saccharina latissima

Резюме

Разрушение специфических клеток в эмбрионе является мощным инструментом для изучения клеточных взаимодействий, участвующих в судьбе клеток. Настоящий протокол описывает методы лазерной абляции клеток-мишеней в раннем зародыше бурой водоросли Saccharina latissima.

Аннотация

У Saccharina latissima эмбрион развивается как монослойный клеточный лист, называемый пластинкой или лезвием. Каждая эмбриональная клетка легко наблюдается, легко отличима от своих соседей и может быть индивидуально нацелена. На протяжении десятилетий лазерная абляция использовалась для изучения развития эмбриона. Здесь был разработан протокол клеточно-специфической лазерной абляции для ранних эмбрионов бурой водоросли S. latissima. Представленная работа включает: (1) подготовку эмбрионов сахарины с описанием критических параметров, включая условия культивирования, (2) настройки лазерной абляции и (3) мониторинг последующего роста облученного эмбриона с помощью покадровой микроскопии. Кроме того, приводятся подробные сведения об оптимальных условиях транспортировки эмбрионов с платформы визуализации обратно в лабораторию, что может глубоко повлиять на последующее развитие эмбриона. Водоросли, принадлежащие к отряду Laminariales, демонстрируют паттерны эмбриогенеза, похожие на Saccharina; таким образом, этот протокол может быть легко перенесен на другие виды в этом таксоне.

Введение

Лазерная абляция использовалась в течение десятилетий для изучения развития эмбрионов. Облучение клеток эмбриона лазерным лучом позволяет контролировать регенеративный потенциал и модификацию клеточной линии во время эмбриогенеза и исследовать влияние целенаправленной абляции на деление клеток и их судьбу. Модельными организмами, используемыми в методах лазерной абляции, обычно являются животные, такие как насекомые ^1,2, нематоды ^3,4, позвоночные ^5,6 и иногда растения ^7,8. Кроме того, лазерный подход микроабляции был использован на бурой водоросли Fucus в 1994 и 1998 годах для демонстрации роли клеточной стенки в фотополяризации раннего эмбриона ^9,10.

Бурые водоросли относятся к группе Stramenopiles, разошлись у корня эукариотического дерева 1,6 миллиарда лет назад. В результате они филогенетически независимы от других многоклеточных организмов, таких как животные и растения¹¹. Saccharina latissima принадлежит к отряду Laminariales, более известному как kelps, и они являются одними из крупнейших организмов на земле, достигая размеров более 30 м. Saccharina sp. - это большие морские водоросли, используемые для многих применений, таких как пища и корма, а ее полисахариды извлекаются для использования в сельскохозяйственной, фармакологической и косметической промышленности во всем мире^{12, 13.} Его культивирование, главным образом в Азии и в последнее время в Европе, требует подготовки эмбрионов в инкубаториях перед выпуском молоди в открытое море. Как и все водоросли, он имеет двухфазный жизненный цикл, состоящий из микроскопической гаметофитной фазы, во время которой гаплоидный гаметофит растет и производит гаметы для оплодотворения, и диплоидной макроскопической спорофитной фазы, где большая плоская лопатка развивается из своего удержания, прикрепленного к морскому дну или скалам. Спорофит высвобождает гаплоидные споры при созревании, тем самым завершая жизненный цикл 14,15,16.

S. latissima представляет некоторые интересные морфологические особенности¹⁷. Его зародыш развивается как монослойный плоский лист 15,18,19 до приобретения многослойной структуры, совпадающей с появлением различных типов тканей. Кроме того, Laminariales является одним из немногих таксонов бурых водорослей, чьи эмбрионы остаются прикрепленными к их материнской гаметофитной ткани (Desmarestiales и Sporochnales слишком¹⁵). Эта особенность дает возможность изучить роль материнской ткани в этом процессе развития и сравнить механизмы материнского контроля у бурых водорослей с механизмами у животных и растений.

В этой статье представлен первый полный протокол лазерной абляции у раннего эмбриона ламинарии. Этот протокол, включающий метод UV ns-pulsed, приводит к специфическому разрушению отдельных эмбриональных клеток для изучения их соответствующих ролей во время эмбриогенеза. Процедура предлагает надежный подход к исследованию клеточных взаимодействий и клеточной судьбы во время эмбриогенеза в Laminariales.

протокол

1. Производство гаметофитов Saccharina latissima

1. Собирают зрелых спорофитов S. latissima из дикой природы, как описано ранее^20,21. Убедитесь, что выбранные спорофиты лишены эпифитов (мелких организмов, видимых на поверхности лезвия) или внутренних паразитов (обнаруженных в обесцвеченных участках или пятнах на лезвии).
2. Используя скальпель, разрежьте самую темную часть в центре лезвия (плодородную спорообразующую ткань²²) на 1-5 квадратных кусочков (1 см²), избегая любых обесцвеченных пятен, если таковые имеются.
3. Удалите все оставшиеся эпифиты, аккуратно очистив разрезанные кусочки обратной стороной скальпеля и немного абсорбирующей бумаги.
4. Поместите очищенные кусочки в стеклянную посуду, наполненную стерильной природной морской водой (см. Таблицу материалов) в течение 45 минут, чтобы освободить споры в соответствии с ранее опубликованным отчетом²².
5. Извлеките кусочки лезвия и отфильтруйте морскую воду через 40-мкм клеточный ситечко для удаления мусора или нежелательных организмов.
6. Развести споры в фильтрате до концентрации 20-40 спор/мл в пластиковых чашках Петри²².
7. Поместите споровый раствор в культуральный шкаф (см. Таблицу материалов), сконфигурированный с оптимальными условиями культивирования (13 °C, 24 мкЕ.м-2.с-1, фотопериод 16:8 Л:Д).
8. Позвольте спорам прорасти и развиться в гаметофиты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прорастание спор видно через 2 дня в шкафу, а первое деление клеток гаметофитных клеток обычно происходит в течение следующих 48 ч.
9. Замените питательную среду через 5 дней микрофильтрованной природной морской водой, обогащенной 0,5x раствором Provasoli (NSW1/2) (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать повторения этих шагов, конкретные мужские и женские гаметофиты могут быть выбраны и вегетативно размножаются в течение нескольких месяцев. Гаметофиты остаются вегетативными при выращивании под красным светом (4 мкЭ.м-2.с-1 с длиной волны не менее 580 нм)²³ в тех же условиях культивирования, описанных выше (этап 1.7).

2. Фрагментация и индукция оогенеза

1. Заготавливайте гаметофиты с помощью клеточного скребка.
2. Используя небольшой пластиковый пестик, измельчите собранные гаметофиты в пробирке объемом 1,5 мл на 4-5-клеточные кусочки.
3. Наполните пробирку 1 мл NSW1/2 (шаг 1.9).
4. Добавьте 2,5 мкл измельченного раствора гаметофита в 3 мл природной морской воды, обогащенной 1x раствором Provasoli (NSW), и поместите их в чашку Петри.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для упрощения обработки рекомендуется 25-миллиметровая чашка Петри со стеклянным дном.
5. Поместите приготовленные блюда в культурологический шкаф и индуцируйте гаметогенез при 13 °C под белым светом с интенсивностью 24 мкЕ.м-2.с-1 (тусклый свет, фотопериод 16:8 Л:Д).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первая гаметангия (женская оогония и мужская архегония) может наблюдаться через 5 дней. Самец гиперветвлен мелкими клетками, а самка состоит из более крупных клеток, образующих длинные^{нити 15,22}. Первые яйца наблюдаются ~10 дней спустя, а первое деление зигот обычно происходит в течение следующих 2 дней.
6. Через шесть дней после наблюдения за первыми яйцами перенесите посуду в более яркие условия белого света: 50 мкЕ.м-2.с-1, фотопериод 16:8 Л:Д, все еще при 13 °C.

3. Получение изображения для отбора эмбрионов для абляции и мониторинга последующего роста

1. Визуализируйте всю чашку Петри, чтобы (пере)локализовать эмбрионы, выбранные на этапе абляции (нет необходимости возвращать чашку в глазной микроскоп) и контролировать последующее развитие выбранных эмбрионов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инвертированный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (см. Таблицу материалов) для визуализации (рисунок 1), и лазерная абляция описана на шаге 5.
2. Поместите чашку Петри на сцену и сориентируйте ее визуальным знаком (например, проведите линию постоянным маркером).
3. Используйте объектив 10x/0.45, чтобы сосредоточиться на эмбрионе. Запишите положение четырех сторон света чашки Петри.
4. Запустите сканирование плитки. Получайте передаваемые/флуоресцентные изображения всей чашки Петри с низким разрешением: 256 x 256 пикселей, время выдержки пикселя 1,54 мкс при двунаправленном сканировании и цифровой зум 0,6x с использованием лазера 561 нм при передаче 1,2%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время сканирования для всей чашки Петри размером 2,5 см составляет ~6 минут для 225 плиток (рисунок 2). Здесь лазер 561 нм использовался для передачи и флуоресцентной визуализации. Флуоресцентный сигнал собирался между 580-720 нм на конфокальных фотоумножителях (PMT), а проходящий свет собирался на передаваемый PMT. Лазер 561 нм также может контролировать хлорофилл на этом этапе, но в этом нет необходимости, потому что он только помогает правильно различать сигнальный шум и организмы.
5. Сохраните изображение сканирования плитки и оставьте его открытым в окне программного обеспечения для получения изображений (см. Таблица материалов).
6. Измените цель, не убирайте чашку Петри.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Водный объектив 40x/1.2 был перемещен в сторону сцены таким образом, чтобы погружная среда (вода) могла быть добавлена к объективу без перемещения чашки Петри из ее первоначального положения.
7. Перейдите по ранее полученному изображению плитки, чтобы выбрать подходящий эмбрион. После того, как эмбрион был идентифицирован на этом изображении, переместите стадию в точное положение эмбриона и приобретите передаваемые / флуоресцентные изображения этого эмбриона с высоким разрешением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки высокого разрешения: 512 x 512 пикселей, 0,130 мкм / пиксель, время выдержки пикселя 0,208 мкс с однонаправленным сканированием и 2-кратным цифровым зумом с использованием лазера 561 нм при передаче 0,9%.
8. Аннотируйте изображение сканирования плитки для каждого эмбриона-кандидата на лазерную абляцию (рисунок 2B) и переходите к этапу лазерной абляции.

4. Лазерная калибровка

1. Откалибруйте лазер и синхронизируйте программное обеспечение для получения изображений с программным обеспечением лазерного драйвера в режиме «Click & Fire» и импульсным лазером 355 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения идеальной синхронизации между положением курсора мыши в программном обеспечении лазерного драйвера (см. Таблицу материалов) с положением в живом изображении программного обеспечения для сбора.
2. Откройте пакет программного обеспечения драйвера лазера и нажмите Live в пакете программного обеспечения для получения изображений.
3. Синхронизируйте оба пакета программного обеспечения, нажав кнопку Начать сбор в пакете программного обеспечения лазерного драйвера. Живое изображение теперь также записывается в программном обеспечении UV laser-driver.
4. Определите область интересов (AOI), нажав на кнопку Выбрать AOI и нажав на края изображения (справа, слева, сверху и снизу) в программном пакете УФ-лазерного драйвера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага калибровки настройки размера пикселя, формата изображения и масштабирования в пакете программного обеспечения для сбора данных должны оставаться постоянными.
5. Выберите пустую область на тарелке и опустите уровень сцены на 20 мкм ниже фокальной плоскости образца, чтобы сфокусироваться на дне стекла.
6. Установите траектории абляционного лазера и лазера визуализации, щелкнув Начать калибровку и выбрав Ручная калибровка.
7. Выберите мощность лазера, достаточно высокую, чтобы увидеть черную точку в центре живого изображения, соответствующую отверстию в стеклянной крышке (все жалюзи должны быть открыты).
8. Нажмите на эту центральную черную точку курсором мыши и нажмите на 18 дополнительных точек, предложенных программным обеспечением для завершения процедуры выравнивания.
9. Проверьте калибровку в режиме «Click & Fire» на том же крышке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная калибровка зависит от параметров изображения. После калибровки лазера убедитесь, что параметры изображения (например, 512 x 512 пикселей, 0,130 мкм/пиксель, время ожидания пикселя 0,208 мкс при однонаправленном сканировании и 2-кратном цифровом зуме) не изменились.

5. Лазерная абляция

1. Выберите интересующий эмбрион. Запустите покадровую запись в программном обеспечении для сбора изображений.
2. Получайте передаваемые/флуоресцентные изображения с объективом 40x/1,2 Вт с высоким разрешением (т.е. 512 x 512 пикселей, 0,130 мкм/пиксель, время выдержки пикселя 1,54 мкс при однонаправленном сканировании и 2-кратный цифровой зум с использованием лазера 561 нм при передаче 0,9%). Приобретайте покадровую запись на максимальной скорости.
3. Уменьшите масштаб области в начале покадровой записи. Увеличьте масштаб AOI.
4. Используйте функцию «Click & Fire» программного обеспечения лазерного драйвера для нанесения повреждающего облучения на клетку, представляющую интерес для эмбриона. Используйте следующие параметры: 45% лазерной передачи (что соответствует максимуму 40 мкВт) и длительность импульса 1 мс (шаг 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется запись видео во время лазерной съемки.
5. Под 688 нм контролируют выброс автофлуоресцентных хлоропластов из цитоплазмы.
6. Если содержимое ячейки остается в ячейке, используйте функцию «Click & Fire» еще раз, чтобы увеличить размер нарушения в ячейке. Повторите, сводя количество выстрелов к минимуму до тех пор, пока большая часть содержимого клеток не будет освобождена.
7. Остановите покадровую запись после стабилизации эмбриона (т.е. дальнейшее внутриклеточное движение не может быть обнаружено (~1-5 мин).
8. При необходимости обновите аннотацию на изображении сканирования плитки.

6. Мониторинг роста облученных эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг осуществляется в течение нескольких дней.

1. Определите выживаемость, контролируя количество эмбрионов, которые развиваются после лазерной абляции и сравнивайте их с теми, которые умирают.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые эмбрионы умирают сразу после абляции по разным причинам. Высокий и быстрый уровень смертности обычно является признаком неподходящих параметров лазера или более высокого / длительного воздействия стресса во время эксперимента или последующего переноса.
2. Определите задержку роста, измеряя длину эмбрионов с лазерной съемкой каждый день и сравнивая ее с неповрежденными эмбрионами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость роста организмов с лазерным выстрелом, как правило, медленнее, чем у необработанных организмов. Тем не менее, некоторые (неуместные) лазерные установки могут ингибировать рост более недели, после чего рост возобновляется.
3. Выясните соседние повреждения, наблюдая за реакцией клеток, прилегающих к абляционным клеткам. В некоторых случаях разгерметизация после разрыва может привести к разрыву соседних клеток.
4. Проверьте наличие микробных загрязнений. Следите за ростом микроводорослей и бактерий в среде. Если в блюде присутствует необычный уровень микробов, то выбросьте его и повторите протокол из шага 2 или шага 3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После лазерной абляции поврежденные эмбрионы S. latissima уже подвергаются сильному стрессу, и дополнительный внешний стресс может вызвать повышенную смертность. Бактериальные или вирусные вспышки возможны, потому что обработанные эмбрионы не могут расти в аксенических условиях.
5. Проверить глобальное развитие дробеструйных организмов, изучив фенотип и понимая роль в развитии целевого региона.

Результаты

Были выращены гаметофиты S. latissima , и гаметогенез был индуцирован для производства зигот и эмбрионов. Через двенадцать дней после индукции гаметогенеза эмбрионы подверглись лазерной абляции. Здесь эксперимент был направлен на оценку роли специфических клеток в общем развитии эм...

Обсуждение

Локальная клеточная лазерная абляция позволяет проводить временную и пространственную абляцию с высоким уровнем точности. Однако его эффективность может быть затруднена недоступностью клеток-мишеней; например, все клетки принадлежат трехмерному эмбриону. Этот протокол был разработ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm glass bottom petri dish	NEST	801001
Autoclaved sea water	-		Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper	MED 2	83.3951
Cell strainer 40 µm	Corning / Falcon	352340
Culture cabinets	Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01		Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles	Sigma Aldrich	Z359947	Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement	-		Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel	Paramount	PDSS 11
SysCon software	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany		Laser-driver software
ZEN software	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version