靶向激光消融术在乳酸杆菌胚胎中的应用

摘要

胚胎中特定细胞的破坏是研究参与细胞命运的细胞相互作用的有力工具。本方案描述了用于在褐藻裂殖质的早期胚胎中激光消融靶细胞 的技术。

摘要

在 裂殖质中，胚胎发育为称为层或叶片的单层细胞片。每个胚胎细胞都易于观察，很容易与其邻居区分开来，并且可以单独靶向。几十年来，激光消融一直用于研究胚胎发育。在这里，为褐藻狭 长链球菌的早期胚胎开发了细胞特异性激光消融方案。所介绍的工作包括:（1） 糖精 胚胎的制备，描述关键参数，包括培养条件，（2）激光消融设置，以及（3）使用延时显微镜监测受照射胚胎的后续生长。此外，还提供了有关将胚胎从成像平台运输回实验室的最佳条件的详细信息，这可能会对随后的胚胎发育产生深远的影响。属于海带目藻的藻类显示出类似于 糖精的 胚胎发生模式，因此该方案可以很容易地转移到该分类群中的其他物种。

引言

激光消融已经使用了几十年来研究胚胎发育。用激光束照射胚胎细胞可以监测胚胎发生过程中细胞系的再生电位和修饰，并研究靶向消融对细胞分裂和细胞命运的影响。激光消融方法中使用的模式生物通常是动物，如昆虫^1，2，线虫^3，4，脊椎动物^5，6，偶尔植物^7，8。此外，1994年和1998年在褐藻 墨角上 使用了激光微消融方法，以证明细胞壁在早期胚胎^9，10的光极化中的作用。

褐藻属于星云藻类，在16亿年前在真核生物树的根部分化。因此，它们在系统发育上独立于其他多细胞生物，例如动物和植物¹¹。糖精属於海带目，通常被称为海带，它们是地球上最大的生物之一，大小超过30米。 ¹³.其养殖主要在亚洲，最近在欧洲，需要在孵化场准备胚胎，然后在公海释放幼鱼。像所有海带一样，它具有一个双相生命周期，由微观配子体阶段组成，在此期间，单倍体配子体生长并产生配子用于受精，以及二倍体宏观孢子体阶段，其中大型平面叶片从附着在海底或岩石上的固定物发展而来。孢子体在成熟时释放单倍体孢子，从而完成生命周期^14，15，16。

裂头孢子虫 呈现出一些有趣的形态特征¹⁷.它的胚胎发育成单层平面片^15，18，19，然后获得多层结构，与不同组织类型的出现相吻合。此外，海带是仅有的褐藻类群之一，其胚胎仍然附着在母体配子体组织上（去角膜动物和孢子囊藻也这样做¹⁵）。该特征提供了研究母体组织在这一发育过程中的作用的机会，并将褐藻中的母体控制机制与动物和植物中的母体控制机制进行比较。

本文介绍了早期海带胚胎中激光消融的第一个完整的方案。该协议涉及UV ns脉冲技术，导致单个胚胎细胞的特定破坏，以研究它们在胚胎发生过程中各自的作用。该程序为研究海带胚胎发生过程中的细胞相互作用和细胞命运提供了一种可靠的方法。

研究方案

1. 配子体甘草的产生

1. 从野外收集乳突鱼的成熟孢子植物，如前所述^20，21。确保选定的孢子植物没有附生植物（在叶片表面上可见的小生物）或内部寄生虫（在叶片的漂白区域或斑点中发现）。
2. 使用手术刀，将刀片中心最暗的部分（可育孢子产生组织²²）切成1-5个正方形（1cm²），避免任何漂白的斑点（如果存在）。
3. 用手术刀背面和一些吸水纸轻轻清洁切割的碎片，以去除任何剩余的附生植物。
4. 将清洁后的碎片放入装有无菌天然海水（见 材料表）的玻璃盘中45分钟，以释放先前发布的报告²²后的孢子。
5. 取下刀片片，通过40μm细胞过滤器过滤海水，以清除碎屑或不需要的生物体。
6. 将滤液中的孢子稀释至塑料培养皿22中的20-40 sor / mL^浓度。
7. 将孢子溶液置于具有最佳培养条件（13°C，24μE.m-2.s-1，光周期16:8 L:D）的培养柜中（参见材料表）。
8. 让孢子萌发并发育成配子体。
   注意:孢子在柜中2天后可见，配子体细胞的第一次细胞分裂通常发生在随后的48小时内。
9. 5天后用微滤的天然海水替换生长培养基，其中富含0.5x Provasoli溶液（NSW1 / 2）（参见 材料表）。
   注意:为了避免重复这些步骤，可以选择特定的雄性和雌性配子体并无性繁殖数月。在上述相同培养条件下（4 μE.m-2.s-1，波长至少为580nm）23（步骤1.7）²³下生长时，配子体保持营养。

2. 卵子发生的破碎和诱导

1. 用细胞刮刀收获配子体。
2. 使用小塑料杵，将收集的配子体在1.5 mL管中粉碎成4-5个细胞块。
3. 用1 mL NSW1 / 2填充管（步骤1.9）。
4. 将2.5μL粉碎的配子体溶液加入富含1x Provasoli溶液（NSW）的3mL天然海水中，并将其置于培养皿中。
   注意:建议使用 25 mm 的玻璃底培养皿，以便于操作。
5. 将准备好的菜肴放入培养柜中，并在13°C下以24μE.m-2.s-1（暗光，光周期16:8 L:D）的白光诱导配子发生。
   注意:第一个配子体（雌性卵形和雄性弓形）可以在5天后观察到。雄性是超支化的，有小细胞，雌性由较大的细胞组成，形成长丝^15，22。第一个卵子在大约10天后被观察到，受精卵的第一次分裂通常发生在接下来的2天内。
6. 观察第一个鸡蛋六天后，将培养皿转移到较亮的白光条件下:50μE.m-2.s-1，光周期16:8 L:D，仍保持在13°C。

3. 图像采集，用于选择胚胎进行消融并监测随后的生长

1. 对整个培养皿进行成像，以（重新）定位在消融步骤中选择的胚胎（无需将培养皿返回到眼部显微镜），并监测所选胚胎的后续发育。
   注意:使用倒置激光扫描共聚焦显微镜（参见 材料表）进行成像（图1），并在步骤5中描述了激光消融。
2. 将培养皿放在舞台上，并用视觉标记定向（例如，用永久标记画一条线）。
3. 使用10x/0.45物镜聚焦于胚胎。记录培养皿的四个基点的位置。
4. 开始磁贴扫描。以低分辨率采集整个培养皿的透射/荧光图像:256 x 256像素，双向扫描时像素停留时间为1.54 μs，使用561 nm激光以1.2%透射率为0.6x的数字变焦。
   注意:对于225块瓷砖，整个2.5厘米培养皿的扫描时间约为6分钟（图2）。在这里，561 nm激光器用于透射和荧光成像。在共聚焦光电倍增管（PMT）上收集580-720 nm之间的荧光信号，并在透射PMT上收集透射光。561nm激光也可以在此步骤中监测叶绿素，但这是不必要的，因为它只有助于正确区分信号噪声和生物体。
5. 保存图块扫描图像，并在图像采集软件（参见 材料表）窗口中保持打开状态。
6. 改变目标，不要取下培养皿。
   注意:40x/1.2水物镜被移动到载物台的一侧，以便可以将浸入介质（水）添加到物镜中，而无需将培养皿从其初始位置移开。
7. 浏览先前获取的瓷砖扫描图像以选择合适的胚胎。一旦在此图像上鉴定出胚胎，将载物台移动到胚胎的确切位置，并以高分辨率获得该胚胎的透射/荧光图像。
   注:高分辨率设置:512 x 512 像素、0.130 μm/像素、0.208 μs 像素停留时间（单向扫描）和 2 倍数字变焦（使用 561 nm 激光，透射率为 0.9%）。
8. 注释每个候选激光消融胚胎的切片扫描图像（图2B），然后继续进行激光消融步骤。

4. 激光校准

1. 校准激光器，并在"点击&射击模式"下将图像采集软件与激光驱动软件以及脉冲355 nm激光器同步。
   注:此步骤对于确保激光驱动器软件中的鼠标光标位置（参见 材料表）与采集软件实时图像中的位置完美同步至关重要。
2. 打开激光驱动软件包，在图像采集软件包中单击 Live 。
3. 通过单击激光驱动程序软件包中的 "开始采集"来 同步两个软件包。实时图像现在也记录在紫外激光驱动器软件中。
4. 通过单击"选择AOI"按钮并单击紫外激光驱动程序软件包中的图像边缘（右侧，左侧，顶部和底部）来定义感兴趣区域（ AOI ）。
   注:完成此校准步骤后，采集软件包中的像素大小、图像格式和放大设置必须保持不变。
5. 选择培养皿上的空白区域，并将载物台的水平降低到样品焦平面下方20μm，以聚焦在玻璃底部。
6. 通过单击开始校准并选择手动校准来设置烧蚀激光器和成像激光轨迹。
7. 选择足够高的激光功率，以便在实时图像的中心看到一个黑点，对应于玻璃盖玻片上的孔（所有百叶窗必须打开）。
8. 用鼠标光标单击此中央黑点，然后单击软件建议的 另外18个点 以完成对齐过程。
9. 在同一盖玻片上的"单击>射击模式"中检查校准。
   注:激光校准取决于成像参数。校准激光后，确保成像参数（即 512 x 512 像素、0.130 μm/像素、单向扫描和 2 倍数字变焦时的 0.208 μs 像素停留时间）未发生更改。

5. 激光烧蚀

1. 选择感兴趣的胚胎。在图像采集软件中开始延时录制。
2. 使用40x/1.2 W物镜以高分辨率（即512 x 512像素，0.130μm/像素，单向扫描1.54μs像素停留时间）采集透射/荧光图像，并使用561 nm激光以0.9%透射率进行2倍数字变焦）。以最大速度获取延时录制。
3. 缩小延时拍摄开始时的区域。放大自动操作系统。
4. 使用激光驱动软件的"咔哒声"功能对胚胎中感兴趣的细胞施加破坏性照射。使用以下参数:45%激光透射率（相当于最大40 μW）和1 ms脉冲持续时间（步骤4）。
   注:建议在激光拍摄期间进行视频录制。
5. 在688nm下，监测细胞质中自发荧光叶绿体的射出。
6. 如果单元格内容保留在单元格中，请再次使用"单击&触发"功能来增加单元格中违规的大小。重复此步骤，将拍摄次数保持在最低限度，直到大部分细胞内容被释放。
7. 在胚胎稳定后停止延时记录（即，不能检测到进一步的细胞内运动（约1-5分钟）。
8. 如有必要，请更新切片扫描图像上的批注。

6. 监测受辐照胚胎的生长

注意:监视在几天内进行。

1. 通过监测激光消融后发育的胚胎数量并确定存活率，并将其与死亡胚胎进行比较。
   注意:由于各种原因，一些胚胎在消融后立即死亡。高而快速的死亡率通常是在实验或随后的运输过程中激光参数不合适或更高/更长时间暴露于应力的迹象。
2. 通过每天测量激光注射胚胎的长度并将其与完整胚胎进行比较来确定生长延迟。
   注意:激光照射生物的生长速度通常比未经治疗的生物体慢。然而，一些（不适当的）激光设置可以抑制生长超过一周，之后生长恢复。
3. 通过监测与消融细胞相邻的细胞的反应来找出相邻的损伤。在某些情况下，突发后减压可能导致邻近细胞破裂。
4. 检查微生物污染。监测培养基中微藻和细菌的生长。如果培养皿中存在异常水平的微生物，则将其丢弃并重复步骤2或步骤3中的方案。
   注意:激光消融后，受损 的乳突乳突鱼 胚胎已经受到高度压力，额外的外部压力会导致死亡率增加。细菌或病毒爆发是可能的，因为治疗过的胚胎不能在轴轭条件下生长。
5. 通过研究表型并了解在目标区域发育中的作用，检查注射生物的全球发育。

结果

生长 裂 头孢子体，诱导配子发生产生受精卵和胚胎。在配子发生诱导后12天，胚胎接受了激光消融。在这里，实验旨在评估特定细胞在 乳突乳酸链球菌 胚胎整体发育中的作用。靶向最顶端的细胞，最基底细胞和正中细胞。在瓷砖扫描后，整个培养皿（图2A），一个感兴趣的胚胎，被确定为适合激光射击的候选者（图2B）。选择该胚胎的特...

讨论

局部细胞激光消融允许以高精度进行时间和空间消融。然而，其效率可能会受到靶细胞不可及性的阻碍;例如，所有细胞都是三维胚胎。该协议是在藻类 裂殖质的胚胎上开发的，该胚胎发育出单层层，其中所有细胞都可以很容易地用激光束单独区分和破坏。

激光功率和波长
NIR fs脉冲激光通常用于动物的发育研究^24，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm glass bottom petri dish	NEST	801001
Autoclaved sea water	-		Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper	MED 2	83.3951
Cell strainer 40 µm	Corning / Falcon	352340
Culture cabinets	Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01		Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles	Sigma Aldrich	Z359947	Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement	-		Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel	Paramount	PDSS 11
SysCon software	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany		Laser-driver software
ZEN software	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version