サッカリーナ・ラティッシマの胚における標的レーザーアブレーション

要約

胚中の特定の細胞の破壊は、細胞の運命に関与する細胞相互作用を研究するための強力なツールである。本プロトコールは、褐色藻類サッカリーナ・ラティッシマの初期胚における標的細胞のレーザーアブレーションのための技術を記載する。

要約

サッカリーナ・ラティッシマでは、胚は薄層または刃と呼ばれる単層細胞シートとして発達する。各胚細胞は観察が容易であり、その隣人と容易に区別でき、そして個別に標的化することができる。何十年もの間、レーザーアブレーションは胚発生を研究するために使用されてきました。ここでは、褐色藻類S. latissimaの初期胚について、細胞特異的レーザーアブレーションのプロトコルが開発された。提示された研究には、(1)サッカリナ胚の調製、培養条件を含む重要なパラメータの説明、(2)レーザーアブレーション設定、および(3)タイムラプス顕微鏡を用いた照射胚のその後の成長のモニタリングが含まれる。さらに、イメージングプラットフォームからラボに胚を輸送するための最適な条件に関する詳細が提供されており、その後の胚発生に深く影響する可能性があります。ラミナリア目に属する藻類は、サッカリナに似た胚発生パターンを示すため、このプロトコルはこの分類群の他の種に容易に転移することができる。

概要

レーザーアブレーションは、胚発生を研究するために何十年もの間使用されてきました。胚細胞にレーザー光を照射すると、胚発生中の再生能と細胞系譜の改変を監視し、標的アブレーションが細胞分裂と細胞運命に及ぼす影響を調べることができます。レーザーアブレーション法で使用されるモデル生物は、典型的には動物であり、例えば昆虫^1,2、線虫^3,4、脊椎動物^5,6、および時には植物^7,8である。さらに、1994年と1998年に褐色藻類のヒバコにレーザーマイクロアブレーションアプローチを使用して、初期胚の光偏光における細胞壁の役割を実証した^9,10。

褐藻類は、16億年前に真核生物の木の根元で発散したグループStramenopilesに属します。その結果、それらは、動植物¹¹などの他の多細胞生物から系統学的に独立している。Saccharina latissimaは、より一般的に昆布として知られているLaminarialesに属し、彼らは30メートル以上のサイズに達する、地球上で最大の生物の一つですサッカリナ属は、食品や飼料などの多くの用途に使用される大きな海藻であり、その多糖類は、世界中の農業、薬理学、化粧品産業で使用するために抽出されています^12、13。その栽培は、主にアジアで、そして最近ではヨーロッパで、外洋に幼体を放出する前に孵化場で胚を準備する必要があります。すべての昆布と同様に、それは、一倍体配偶子が成長し、受精のために配偶子を生成する微視的な配偶子植物期と、海底または岩石に取り付けられたホールドファストから大きな平面ブレードが発達する二倍体の巨視的胞子植物期からなる二相性ライフサイクルを有する。この胞子植物は成熟時に一倍体胞子を放出し、それによってライフサイクル14^、15、16を完了させる。

S. latissimaはいくつかの 興味深い形態学的特徴を提示する¹⁷。その胚は、異なる組織型の出現と一致する多層構造を獲得する前に、単層平面シート^15、18、19として発達する。さらに、ラミナリア目は褐藻類の唯一の分類群の1つであり、その胚は母体の配偶子植物組織に付着したままである(デスマレスティアレスとスポロクナレスも¹⁵)。この機能は、この発生過程における母体組織の役割を研究し、褐藻類の母体制御機構を動物および植物の制御機構と比較する機会を提供する。

この記事では、初期の昆布胚におけるレーザーアブレーションのための最初の完全なプロトコルを提示します。UV nsパルス技術を含むこのプロトコルは、胚発生中のそれぞれの役割を研究するために、個々の胚細胞の特異的な破壊をもたらす。この手順は、ラミナリア目における胚発生中の細胞相互作用および細胞運命を調査するための信頼できるアプローチを提供する。

プロトコル

1. サッカリーナ・ラティッシマ・ガメトフィテスの生産

1. S . latissima の成熟した胞子植物を野生から採取する^{(前述の20、21})。選択した胞子植物に着生植物(ブレードの表面に見える小さな生物)または内部寄生虫(漂白された領域またはブレード上の斑点に見られる)がないことを確認してください。
2. メスを使用して、刃の中央の最も暗い部分(肥沃な胞子産生組織²²)を1〜5個の正方形の部分(1cm²)に切断し、漂白された斑点がある場合は避ける。
3. メスと吸収紙で切り取った部分を優しくきれいにして、残りの着生植物を取り除きます。
4. 洗浄した小片を滅菌天然海水で満たされたガラス皿( 材料表を参照)に45分間置き、以前に発表された報告書²²に従って胞子を放出する。
5. ブレード片を取り外し、40μmのセルストレーナーで海水をろ過して、破片や不要な生物を除去します。
6. 濾液中の胞子をプラスチック製のシャーレ22中で20〜40胞子/mL濃度に希釈^する。
7. 胞子溶液を、最適な培養条件(13°C、24μE.m-2.s-1、明期¹⁶:8 L:D)で構成された培養キャビネット(材料表参照)に入れます。
8. 胞子が発芽して配偶子植物に発達するのを許します。
   注:胞子の発芽はキャビネット内で2日後に表示され、配偶子植物細胞の最初の細胞分裂は通常48時間以内に起こる。
9. 5日後に増殖培地を、0.5倍プロバソリ溶液(NSW1/2)で濃縮したマイクロろ過天然海水と交換する( 材料表を参照)。
   注:これらのステップを繰り返さないように、特定の男性と女性の配偶子植物を選択し、数ヶ月間栄養的に繁殖させることができます。配偶子植物は、赤色光(波長580nm以上の4μE.m-2.s-1)²³の下で上記と同じ培養条件下で増殖した場合、栄養状態のままである(ステップ^1.7)。

2. 卵子形成の断片化と誘導

1. セルスクレーパーで配偶子を収穫する。
2. 小さなプラスチック乳棒を使用して、収集した配偶子植物を1.5mLチューブで4〜5セルの断片に粉砕する。
3. チューブに 1 mL NSW1/2 を充填します (ステップ 1.9)。
4. 破砕した配偶子糸状菌溶液2.5 μLを、1xプロバソリ溶液(NSW)で濃縮した天然海水3 mLに加え、ペトリ皿に入れます。
   メモ:取り扱いを容易にするために、25 mmのガラス底のペトリ皿をお勧めします。
5. 惣菜を培養キャビネットに入れ、13°Cで24μE.m-2.s-1(薄暗い光、明期¹⁶:8 L:D)の白色光下で配偶子形成を誘導する。
   注:最初のガメタンジア(女性オオゴニアと男性アルケゴニア)は5日後に観察することができます。雄は小さな細胞で超分枝しており、雌は長いフィラメントを形成する大きな細胞で構成されています^15,22。最初の卵は〜10日後に観察され、接合子の最初の分割は通常2日以内に起こる。
6. 最初の卵を観察してから6日後、皿を明るい白色光条件(50μE.m-2.s-1、明期¹⁶:8 L:D、まだ13°C)に移します。

3. アブレーション用の胚を選別し、その後の成長をモニタリングするための画像取得

1. アブレーション工程中に選択された胚を(再)位置特定するためにシャーレ全体を画像化し(ディッシュを眼顕微鏡に戻す必要はない)、選択された胚のその後の発達を監視する。
   メモ:イメージングには倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡( 材料表を参照)を使用し(図1)、レーザーアブレーションはステップ5で説明します。
2. ペトリ皿をステージの上に置き、視覚的なマークで向きを変えます(例えば、永久マーカーで線を引く)。
3. 10x/0.45 の目的を使用して、胚に焦点を当てます。ペトリ皿の4つの基点の位置を記録する。
4. タイル スキャンを開始します。ペトリ皿全体の透過/蛍光画像を低解像度で取得します:256 x 256ピクセル、双方向スキャンで1.54 μsのピクセル滞留時間、1.2%の透過率で561 nmレーザーを使用して0.6倍のデジタルズーム。
   メモ:2.5cmのペトリ皿全体のスキャン時間は、225枚のタイルで約6分です(図2)。ここでは、透過および蛍光イメージングに561nmレーザーを使用した。蛍光シグナルは共焦点光電子増倍管(PMT)で580-720nmの間で収集され、透過光は透過PMTで収集された。561nmレーザーは、この段階でクロロフィルを監視することもできますが、信号ノイズと生物を正しく区別するのに役立つだけなので、不要です。
5. タイルスキャン画像を保存し、画像取得ソフトウェア( 材料表を参照)ウィンドウで開いたままにします。
6. 目的を変更し、ペトリ皿を取り外さないでください。
   注:40x/1.2水対物レンズはステージの側面に移動し、ペトリ皿を初期位置から動かさずに浸漬媒体(水)を対物レンズに追加できるようにしました。
7. 以前に取得したタイル スキャン イメージ内を移動して、適切な胚を選択します。この画像で胚が同定されたら、ステージを胚の正確な位置に移動し、その胚の透過/蛍光画像を高解像度で取得します。
   メモ:高解像度設定:512 x 512ピクセル、0.130 μm/ピクセル、0.208 μsピクセルの滞留時間(単方向スキャン付き)、および561 nmレーザーを使用した2倍デジタルズーム(透過率0.9%)。
8. レーザーアブレーション用の各胚候補のタイルスキャン画像に注釈を付け(図2B)、レーザーアブレーション工程に進む。

4. レーザーキャリブレーション

1. レーザーを較正し、画像取得ソフトウェアを「クリック&ファイアモード」のレーザードライバソフトウェアとパルス355nmレーザーと同期させます。
   メモ:この手順は、レーザードライバソフトウェア内のマウスカーソルの位置( 材料表を参照)と集録ソフトウェアのライブイメージ内の位置とが完全に同期するようにするために重要です。
2. レーザードライバソフトウェアパッケージを開き、画像集録ソフトウェアパッケージの[ Live ]をクリックします。
3. レーザードライバソフトウェアパッケージの 集録開始 をクリックして、両方のソフトウェアパッケージを同期します。ライブ画像は、UVレーザードライバーソフトウェアにも記録されるようになりました。
4. 関心領域(AOI)を定義するには、[ AOIの選択 ]ボタンをクリックし、UVレーザードライバソフトウェアパッケージの画像の端(右、左、上、下)をクリックします。
   メモ:このキャリブレーション手順の後、集録ソフトウェアパッケージのピクセルサイズ、画像形式、ズームの設定は一定にする必要があります。
5. 皿の空いている領域を選択し、ステージのレベルをサンプル焦点面の20 μm下に下げて、ガラス底に焦点を合わせます。
6. アブレーションレーザーとイメージングレーザー軌道を設定するには、[キャリブ レーションの開始 ]をクリックし、[ 手動キャリブレーション]を選択します。
7. ガラスカバースリップの穴に対応するライブ画像の中央に黒い点が表示されるほど高いレーザーパワーを選択します(すべてのシャッターが開いている必要があります)。
8. この中央の黒い点をマウスカーソルでクリックし、ソフトウェアによって提案された 18個の追加の点 をクリックして、位置合わせ手順を完了します。
9. 同じカバースリップの「クリック&ファイアモード」でキャリブレーションを確認します。
   メモ:レーザーキャリブレーションは、イメージングパラメータによって異なります。レーザーを較正したら、イメージングパラメータ(512 x 512ピクセル、0.130 μm/ピクセル、単方向スキャンと2倍デジタルズームによる0.208 μsピクセルの滞留時間)が変更されていないことを確認します。

5. レーザーアブレーション

1. 目的の胚を選択します。画像取得ソフトウェアでタイムラプス記録を開始します。
2. 40x/1.2 Wの対物レンズで透過/蛍光画像を高解像度(512 x 512ピクセル、0.130 μm/ピクセル、1.54 μsピクセルの滞留時間、単方向スキャン、2倍デジタルズーム、561 nmレーザーを使用した2倍デジタルズーム、0.9%の透過率)で取得します。タイムラプス記録を最高速度で取得します。
3. タイムラプス記録の開始時に領域からズームアウトします。AOI を拡大します。
4. レーザードライバソフトウェアの「クリック&ファイア」機能を使用して、胚の関心のある細胞に損傷を与える照射を適用します。次のパラメータを使用します:45%レーザー透過率(最大40μWに対応)と1msのパルス時間持続時間(ステップ4)。
   メモ:レーザー撮影中のビデオ録画をお勧めします。
5. 688nm下で、細胞質からの自己蛍光葉緑体の放出を監視する。
6. セルの内容がセルに残っている場合は、「クリック&ファイア」機能をもう一度使用して、セル内の違反のサイズを大きくします。繰り返して、ほとんどのセル内容物が解放されるまでショット数を最小限に抑えます。
7. 胚が安定化した後(すなわち、それ以上の細胞内運動が検出されない(〜1〜5分)後にタイムラプス記録を停止する。
8. 必要に応じて、タイル スキャン イメージの注釈を更新します。

6. 照射胚の成長のモニタリング

メモ: 監視は数日間にわたって実行されます。

1. レーザーアブレーション後に発生する胚の数を監視して生存率を決定し、それらを死んだ胚と比較します。
   注:いくつかの胚は、様々な理由でアブレーション直後に死ぬ。高くて急速な死亡率は、通常、不適切なレーザーパラメータまたは実験中またはその後の輸送中のストレスへのより高い/より長い曝露の兆候である。
2. レーザーショット胚の長さを毎日測定し、それを無傷の胚と比較することによって、成長遅延を決定する。
   注:レーザーショット生物の増殖速度は、一般に、未処理生物の増殖速度よりも遅い。しかし、一部の(不適切な)レーザー設定は、1週間以上成長を阻害し、その後成長が再開することがあります。
3. アブレーションされた細胞に隣接する細胞の反応を監視することによって、隣接する損傷を調べる。場合によっては、バースト後の減圧によって、隣接する細胞が破裂することがあります。
4. 微生物の汚染を確認します。培地中の微細藻類および細菌の増殖を監視する。異常なレベルの微生物が皿に存在する場合は、それを捨てて、ステップ2またはステップ3のプロトコルを繰り返します。
   注:レーザーアブレーション後、損傷した S. latissima 胚はすでに高いストレスを受けており、追加の外部ストレスは死亡率の増加を引き起こす可能性があります。細菌またはウイルスの発生は、処理された胚が軸索条件下で増殖することができないため、可能である。
5. 表現型を研究し、標的領域の発達における役割を理解することによって、ショット生物の世界的な発達をチェックする。

結果

S. latissimaの配偶子植物が増殖し、配偶子形成が誘導されて接合体および胚が産生された。配偶子形成の誘導の12日後、胚はレーザーアブレーションを受けた。ここで、実験は、S. latissima胚の全体的な発達における特定の細胞の役割を評価することを目的とした。最も頂端細胞、最も基底細胞、および中央値細胞を標的とした。タイルスキャン後、対象となる胚であるシャーレ全?...

ディスカッション

局所細胞レーザーアブレーションは、高い精度で時間的および空間的アブレーションを可能にします。しかし、その効率は、標的細胞のアクセス不能によって妨げられる可能性がある。例えば、すべての細胞は三次元胚のものである。このプロトコルは、レーザービームですべての細胞を簡単に区別して個別に破壊することができる単層薄層を発達させる藻 類Saccharina latissimaの胚で開?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm glass bottom petri dish	NEST	801001
Autoclaved sea water	-		Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper	MED 2	83.3951
Cell strainer 40 µm	Corning / Falcon	352340
Culture cabinets	Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01		Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles	Sigma Aldrich	Z359947	Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement	-		Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel	Paramount	PDSS 11
SysCon software	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany		Laser-driver software
ZEN software	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version