사카리나 라티시마 배아의 표적 레이저 절제

요약

배아에서 특정 세포의 파괴는 세포 운명과 관련된 세포 상호 작용을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 본 프로토콜은 갈색 알가 사카리나 라티시마의 초기 배아에서 표적화된 세포의 레이저 절제술을 위한 기술을 기술한다.

초록

Saccharina latissima에서 배아는 lamina 또는 블레이드라고 불리는 단층 세포 시트로 발전합니다. 각 배아 세포는 관찰하기 쉽고, 이웃과 쉽게 구별 할 수 있으며, 개별적으로 타겟팅 될 수 있습니다. 수십 년 동안 레이저 절제는 배아 발달을 연구하는 데 사용되어 왔습니다. 여기서, 갈색 알가 S. 라티시마의 초기 배아를 위해 세포 특이적 레이저 절제를위한 프로토콜이 개발되었다. 제시된 연구에는 (1) 배양 조건을 포함한 중요한 매개 변수에 대한 설명과 함께 사카리나 배아의 준비, (2) 레이저 절제 설정, (3) 타임랩스 현미경을 사용하여 조사 된 배아의 후속 성장 모니터링이 포함됩니다. 또한, 이미징 플랫폼에서 실험실로 배아를 다시 운반하기위한 최적의 조건에 대한 세부 사항이 제공되며, 이는 후속 배아 발달에 중대한 영향을 줄 수 있습니다. Laminariales 순서에 속하는 조류는 Saccharina와 유사한 배아 발생 패턴을 표시하며; Algae belonging to the order Laminariales display embryogenesis pattern similar to Saccharina; 따라서 이 프로토콜은 이 분류에서 다른 종으로 쉽게 옮겨질 수 있다.

서문

레이저 절제는 배아 발달을 연구하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 레이저 빔으로 배아 세포를 조사하면 배아 발생 동안 세포 계보의 재생 잠재력 및 변형을 모니터링하고 세포 분열 및 세포 운명에 대한 표적 절제의 영향을 조사 할 수 있습니다. 레이저 절제 방법에 사용되는 모델 유기체는 전형적으로 동물, 예컨대 곤충 ^1,2, 선충류 ^3,4, 척추동물 ^5,6, 및 때때로 식물 ^7,8이다. 또한, 레이저 미세 절제 접근법이 초기 배아 ^9,10의 광분극에서 세포벽의 역할을 입증하기 위해 1994 년과¹⁹⁹⁸ 년에 갈색 알가 푸쿠스에 사용되었다.

갈색 조류는 1.6 억 년 전에 진핵 나무의 뿌리에서 갈라진 Stramenopiles 그룹에 속합니다. 결과적으로, 이들은 동물 및 식물(¹¹)과 같은 다른 다세포 유기체와 계통유전학적으로 독립적이다. Saccharina latissima는 다시마로 더 일반적으로 알려진 Laminariales 순서에 속하며 지구상에서 가장 큰 유기체 중 하나이며 30m 이상의 크기에 도달합니다. Saccharina sp.는 식품 및 사료와 같은 많은 응용 분야에 사용되는 대형 해초이며 다당류는 전 세계 농업, 약리학 및 화장품 산업에 사용하기 위해 추출됩니다^{12, 13}. 주로 아시아에서, 그리고 최근에는 유럽에서 재배를하기 위해서는 바다에서 청소년을 방출하기 전에 부화장에서 배아를 준비해야합니다. 모든 켈프와 마찬가지로, 그것은 반수체 gametophyte가 성장하고 수정을위한 게이머를 생산하는 현미경 게임 토피틱 단계로 구성된 이단계 생활주기와 큰 평면 블레이드가 해저 또는 암석에 부착 된 홀드 패스트에서 발달하는 이배체 거시적 인 산포 성 단계. 스포로피테는 성숙 시에 반수체 포자를 방출하여 수명주기^14,15,16을 완료한다.

S. latissima는 몇 가지 흥미로운 형태학적 특징을 제시한다¹⁷. 그것의 배아는 다른 조직 유형의 출현과 일치하는 다층 구조를 획득하기 전에 단층 평면 시트^15,18,19로 발전합니다. 또한, Laminariales는 배아가 모성 게임 피텍 조직에 붙어있는 갈색 조류의 유일한 택시 중 하나입니다 (Desmarestiales와 Sporochnales도¹⁵ 세입니다). 이 기능은이 발달 과정에서 모성 조직의 역할을 연구하고 갈조류의 모성 조절 메커니즘을 동식물의 모성 조절 메커니즘과 비교할 수있는 기회를 제공합니다.

이 기사는 초기 다시마 배아에서 레이저 절제를위한 최초의 완전한 프로토콜을 제시합니다. UV ns-펄스 기술을 포함하는 이 프로토콜은 배아 발생 동안 각각의 역할을 연구하기 위해 개별 배아 세포의 특이적 파괴를 초래한다. 이 절차는 Laminariales에서 배아 발생 중 세포 상호 작용과 세포 운명을 조사하기위한 신뢰할 수있는 접근법을 제공합니다.

프로토콜

1. 사카리나 라티시마 게임토피테스의 생산

1. 앞서 기술한 바와 같이 야생으로부터 S. latissima의 성숙한 포자피테를 수집한다^20,21. 선택된 sporophytes에 epiphytes (블레이드 표면에 보이는 작은 유기체) 또는 내부 기생충 (블레이드의 표백 된 부위 또는 반점에서 발견됨)이 없는지 확인하십시오.
2. 메스를 사용하여 블레이드 중앙의 가장 어두운 부분 (비옥 한 포자 생성 조직²²)을 1-5 정사각형 조각 (1cm²)으로 자르고 표백 된 반점이있는 경우 피하십시오.
3. 메스 뒷면과 일부 흡수성 종이로 절단 된 조각을 부드럽게 청소하여 남아있는 epiphytes를 제거하십시오.
4. 청소된 조각을 멸균된 천연 바닷물로 채워진 유리 접시에 45분 동안 넣어 이전에 발표된 보고서²²에 따라 포자를 방출한다.
5. 블레이드 조각을 제거하고 40 μm 세포 스트레이너를 통해 바닷물을 여과하여 파편이나 원치 않는 유기체를 제거합니다.
6. 여과액의 포자를 플라스틱 페트리 접시 22에 20-40 포자 / mL 농도로 희석^{하십시오.}
7. 포자 용액을 최적의 배양 조건(13°C, 24 μE.m-2.s-1, 광주기 16:8 L:D)으로 구성된 배양 캐비닛(자료표 참조)에 놓는다.
8. 포자가 발아하여 게임 토피트로 발전하도록하십시오.
   참고 : 포자 발아는 캐비닛에서 2 일 후에 볼 수 있으며 게임 토피 세포의 첫 번째 세포 분열은 일반적으로 다음 48 시간 이내에 발생합니다.
9. 5일 후 성장 배지를 0.5x Provasoli 용액(NSW1/2)으로 농축된 미세 여과된 천연 해수로 교체 한다(표 참조).
   참고 : 이러한 단계를 반복하지 않기 위해 특정 남성과 여성 gametophytes를 선택하고 몇 달 동안 식물적으로 전파 할 수 있습니다. 게임토피테스는 전술한 동일한 배양 조건에서 적색광(4 μE.m-2.s-1 이상의 파장을 갖는 580 nm)²³ 하에서 성장할 때 식물성으로 남아있다(단계 ^1.7).

2. 난생의 단편화 및 유도

1. 세포 스크레이퍼로 gametophytes를 수확하십시오.
2. 작은 플라스틱 유모차를 사용하여 수집 된 gametophytes를 1.5 mL 튜브에서 4-5 셀 조각으로 분쇄하십시오.
3. 튜브를 1mL NSW1/2로 채웁니다(단계 1.9).
4. 분쇄된 게임토피테 용액 2.5μL를 1x 프로바솔리 용액(NSW)이 풍부한 천연 바닷물 3mL에 넣고 페트리 접시에 넣습니다.
   참고: 취급이 용이하도록 25mm의 유리 바닥 페트리 접시를 사용하는 것이 좋습니다.
5. 준비된 접시를 배양 캐비닛에 놓고 24 μE.m-2.s-1 (희미한 빛, 광주기 ¹⁶:8 L:D)의 강도를 갖는 백색광 하에서 13°C에서 게임토제네시스를 유도한다.
   참고 : 첫 번째 gametangia (여성 oogonia 및 남성 archegonia)는 5 일 후에 관찰 될 수 있습니다. 수컷은 작은 세포로 과분형이며, 암컷은 긴 필라멘트^15,22를 형성하는 더 큰 세포로 구성됩니다. 첫 번째 알은 ~ 10 일 후에 관찰되며, zygotes의 첫 번째 분열은 보통 다음 2 일 이내에 발생합니다.
6. 첫 번째 달걀을 관찰 한 지 6 일 후, 접시를 더 밝은 백색광 조건으로 옮깁니다 : 50 ^μE.m-2.s-1, 광주기 16 : 8 L : D, 여전히 13 °C에서.

3. 절제를위한 배아 선택 및 후속 성장 모니터링을위한 이미지 수집

1. 전체 페트리 접시를 이미지화하여 절제 단계 동안 선택된 배아를 (재)위치시키고(접시를 안구 현미경으로 되돌릴 필요가 없음) 선택된 배아의 후속 발달을 모니터링한다.
   참고: 이미징을 위해 거꾸로 된 레이저 스캐닝 공초점 현미경( 재료 표 참조)을 사용하고(그림 1), 레이저 절제술은 5단계에서 설명합니다.
2. 페트리 접시를 무대에 놓고 시각적 인 표시로 방향을 잡으십시오 (예 : 영구 마커가있는 선을 그립니다).
3. 배아에 초점을 맞추기 위해 10x/0.45 목표를 사용하십시오. 페트리 접시의 네 가지 기본 포인트의 위치를 기록하십시오.
4. 타일 스캔을 시작합니다. 256 x 256 픽셀, 양방향 스캐닝을 통한 1.54 μs의 픽셀 체류 시간, 1.2% 전송에서 561nm 레이저를 사용하여 0.6x의 디지털 줌 등 전체 페트리 접시의 전송/형광 이미지를 저해상도로 획득할 수 있습니다.
   참고: 전체 2.5cm 페트리 접시의 스캔 시간은 225타일의 경우 최대 6분입니다(그림 2). 여기서, 561 nm 레이저를 투과 및 형광 이미징에 사용하였다. 형광 신호는 공초점 광배수 (PMT)에서 580-720 nm 사이에서 수집되었고 투과 된 빛은 투과 된 PMT에서 수집되었습니다. 561nm 레이저는이 단계에서 엽록소를 모니터링 할 수도 있지만 신호 잡음과 유기체를 올바르게 구별하는 데 도움이되기 때문에 불필요합니다.
5. 타일 스캔 이미지를 저장하고 이미지 수집 소프트웨어( 자료 표 참조) 창에서 열어 둡니다.
6. 목표를 변경하고, 페트리 접시를 제거하지 마십시오.
   참고: 40x/1.2 물 목표는 스테이지 측면으로 이동되어 페트리 접시를 초기 위치에서 움직이지 않고도 침지 매체(물)를 목표에 추가할 수 있었습니다.
7. 이전에 획득한 타일 스캔 이미지를 탐색하여 적절한 배아를 선택합니다. 이 이미지에서 배아가 확인되면 단계를 배아의 정확한 위치로 이동하고 해당 배아의 전송 / 형광 이미지를 고해상도로 획득하십시오.
   참고: 고해상도 설정: 512 x 512 픽셀, 0.130 μm/픽셀, 단방향 스캐닝을 통한 0.208 μs 픽셀 체류 시간 및 0.9% 전송에서 561nm 레이저를 사용하는 2x 디지털 줌.
8. 레이저 절제를 위해 각 배아 후보에 대한 타일 스캔 이미지에 주석을 달고(도 2B) 레이저 절제 단계를 진행한다.

4. 레이저 교정

1. 레이저를 교정하고 이미지 수집 소프트웨어를 "Click & Fire 모드"의 레이저 드라이버 소프트웨어 및 펄스 355nm 레이저와 동기화합니다.
   참고: 이 단계는 레이저 드라이버 소프트웨어에서 마우스 커서의 위치( 자료 표 참조)와 획득 소프트웨어의 라이브 이미지 위치 간의 완벽한 동기화를 보장하는 데 매우 중요합니다.
2. 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지를 열고 이미지 수집 소프트웨어 패키지에서 라이브 를 클릭하십시오.
3. 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지에서 획득 시작 을 클릭하여 두 소프트웨어 패키지를 동기화합니다. 라이브 이미지는 이제 UV 레이저 드라이버 소프트웨어에도 기록됩니다.
4. AOI 선택 버튼을 클릭하고 UV 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지에서 이미지의 가장자리(오른쪽, 왼쪽, 위쪽 및 아래쪽)를 클릭하여 관심 영역( AOI )을 정의합니다.
   참고: 이 보정 단계 후에는 획득 소프트웨어 패키지의 픽셀 크기, 이미지 형식 및 확대/축소에 대한 설정이 일정하게 유지되어야 합니다.
5. 접시에서 빈 영역을 선택하고 스테이지 레벨을 샘플 초점면 아래 20μm로 낮추어 유리 바닥에 초점을 맞춥니다.
6. 교정 시작 을 클릭하여 절제 레이저 및 이미징 레이저 궤적을 설정하고 수동 교정을 선택합니다.
7. 유리 커버슬립의 구멍에 해당하는 라이브 이미지 중앙에 검은 점이 보이도록 충분히 높은 레이저 파워를 선택합니다(모든 셔터는 열려 있어야 함).
8. 마우스 커서로이 중앙 검은 점을 클릭하고 소프트웨어에서 제안한 18 개의 추가 점을 클릭하여 정렬 절차를 완료하십시오.
9. 동일한 커버슬립의 "Click & Fire 모드"에서 보정을 확인하십시오.
   참고: 레이저 보정은 이미징 파라미터에 따라 다릅니다. 레이저가 보정되면 이미징 파라미터(예: 단방향 스캐닝 및 2x 디지털 줌을 사용한 512 x 512픽셀, 0.130μm/픽셀, 0.208μs 픽셀 체류 시간)가 변경되지 않았는지 확인하십시오.

5. 레이저 절제

1. 관심있는 배아를 선택하십시오. 이미지 수집 소프트웨어에서 타임랩스 녹화를 시작합니다.
2. 고해상도에서 40x/1.2W 대물렌즈로 전송/형광 이미지를 획득합니다(즉, 512 x 512 픽셀, 0.130 μm/픽셀, 단방향 스캐닝을 통한 1.54μs 픽셀 체류 시간 및 0.9% 전송에서 561nm 레이저를 사용한 2x 디지털 줌). 최대 속도로 타임랩스 레코딩을 획득합니다.
3. 타임랩스 녹화가 시작될 때 영역을 축소합니다. AOI를 확대합니다.
4. 레이저 드라이버 소프트웨어의 "Click & Fire" 기능을 사용하여 배아에 관심 있는 세포에 손상 조사를 적용합니다. 45% 레이저 투과율(최대 40μW에 해당) 및 1ms 펄스 시간 지속 시간(단계 4)과 같은 파라미터를 사용합니다.
   참고: 레이저 촬영 중 비디오 녹화를 권장합니다.
5. 688 nm 하에서, 세포질로부터 자가형광 엽록체의 배출을 모니터링한다.
6. 셀 내용이 셀에 남아 있으면 "Click & Fire" 기능을 다시 한 번 사용하여 셀의 위반 크기를 늘리십시오. 대부분의 셀 내용이 해제될 때까지 샷 수를 최소한으로 유지하면서 반복하십시오.
7. 배아가 안정화된 후에 타임랩스 기록을 중단한다(즉, 더 이상의 세포내 이동은 검출될 수 없다(∼1-5분).
8. 필요한 경우 타일 스캔 이미지의 주석을 업데이트합니다.

6. 조사된 배아의 성장 모니터링

참고: 모니터링은 며칠 동안 수행됩니다.

1. 레이저 절제 후 발생하는 배아의 수를 모니터링하여 생존율을 결정하고 죽는 배아와 비교하십시오.
   참고 : 일부 배아는 여러 가지 이유로 절제 직후에 사망합니다. 높고 빠른 사망률은 일반적으로 부적절한 레이저 매개 변수 또는 실험 또는 후속 운송 중 스트레스에 더 높거나 더 오래 노출된다는 신호입니다.
2. 매일 레이저 샷 배아의 길이를 측정하고 손상되지 않은 배아와 비교하여 성장 지연을 결정하십시오.
   참고 : 레이저 샷 유기체의 성장 속도는 일반적으로 처리되지 않은 유기체의 성장 속도보다 느립니다. 그러나 일부 (부적절한) 레이저 설정은 일주일 이상 성장을 억제 할 수 있으며 그 후에 성장이 재개됩니다.
3. 절제된 세포에 인접한 세포의 반응을 모니터링함으로써 인접한 손상을 알아내라. 어떤 경우에는 파열 후 감압으로 인해 이웃 세포가 파열될 수 있습니다.
4. 미생물 오염을 확인하십시오. 배지에서 미세조류와 박테리아의 성장을 모니터링합니다. 접시에 비정상적인 수준의 미생물이 있으면 폐기하고 2 단계 또는 3 단계의 프로토콜을 반복하십시오.
   참고: 레이저 절제 후, 손상된 S. latissima 배아는 이미 높은 스트레스를 받고 있으며, 추가적인 외부 스트레스로 인해 사망률이 증가할 수 있습니다. 박테리아 또는 바이러스 발생은 치료 된 배아가 축 상태에서 자랄 수 없기 때문에 가능합니다.
5. 표현형을 연구하고 표적 부위의 발달에 대한 역할을 이해함으로써 샷 유기체의 글로벌 개발을 확인하십시오.

결과

S. latissima의 Gametophytes가 성장되었고, gametogenesis는 zygotes와 embryos를 생산하도록 유도되었다. 게임 발생의 유도 후 열두 일, 배아는 레이저 절제를 받았다. 여기서, 실험은 S. latissima 배아의 전반적인 발달에서 특정 세포의 역할을 평가하는 것을 목표로했다. 가장 정점 세포, 가장 기저 세포, 및 중앙값 세포를 표적으로 삼았다. 타일 스캐닝 후, 관심있는 배아인 페트리 접시 전체(도

토론

국소 세포 레이저 절제술은 높은 수준의 정밀도로 시간적, 공간적 절제를 허용합니다. 그러나, 그의 효율은 표적 세포의 접근성 불능에 의해 방해받을 수 있다; 예를 들어, 모든 세포는 입체 배아로 되어 있다. 이 프로토콜은 alga Saccharina latissima의 배아에서 개발되었으며, 모든 세포를 쉽게 구별하고 레이저 빔으로 개별적으로 파괴 할 수있는 단층 라미나를 개발합니다.

...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm glass bottom petri dish	NEST	801001
Autoclaved sea water	-		Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper	MED 2	83.3951
Cell strainer 40 µm	Corning / Falcon	352340
Culture cabinets	Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01		Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles	Sigma Aldrich	Z359947	Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement	-		Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel	Paramount	PDSS 11
SysCon software	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany		Laser-driver software
ZEN software	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version