Saccharina latissima Embriyosunda Hedefe Yönelik Lazer Ablasyonu

Özet

Embriyodaki spesifik hücrelerin yok edilmesi, hücre kaderinde yer alan hücresel etkileşimleri incelemek için güçlü bir araçtır. Mevcut protokol, kahverengi alg Saccharina latissima'nın erken embriyosundaki hedeflenen hücrelerin lazer ablasyonu için teknikleri açıklamaktadır.

Özet

Saccharina latissima'da embriyo, lamina veya bıçak adı verilen tek katmanlı bir hücre tabakası olarak gelişir. Her embriyo hücresinin gözlemlenmesi kolaydır, komşularından kolayca ayırt edilebilir ve ayrı ayrı hedeflenebilir. Onlarca yıldır, lazer ablasyon embriyo gelişimini incelemek için kullanılmıştır. Burada, kahverengi alg S. latissima'nın erken embriyoları için hücreye özgü lazer ablasyon için bir protokol geliştirilmiştir. Sunulan çalışma şunları içerir: (1) kültür koşulları da dahil olmak üzere kritik parametrelerin bir açıklaması ile Saccharina embriyolarının hazırlanması, (2) lazer ablasyon ayarları ve (3) ışınlanmış embriyonun sonraki büyümesinin hızlandırılmış mikroskopi kullanılarak izlenmesi. Ek olarak, embriyoların görüntüleme platformundan laboratuvara geri taşınması için en uygun koşullar hakkında ayrıntılar sağlanır ve bu da sonraki embriyo gelişimini derinden etkileyebilir. Laminariales takımına ait algler, Saccharina'ya benzer embriyogenez kalıpları gösterir; Bu protokol, bu taksondaki diğer türlere kolayca aktarılabilir.

Giriş

Lazer ablasyon, embriyo gelişimini incelemek için onlarca yıldır kullanılmaktadır. Embriyo hücrelerinin bir lazer ışını ile ışınlanması, embriyogenez sırasında rejeneratif potansiyeli ve hücre soyunun modifikasyonunu izlemeyi ve hedeflenen ablasyonun hücre bölünmesi ve hücre kaderi üzerindeki etkisini araştırmayı mümkün kılar. Lazer ablasyon yöntemlerinde kullanılan model organizmalar tipik olarak böcekler^1,2, nematodlar^3,4, omurgalılar^5,6 ve bazen de^{bitkiler 7,8} gibi hayvanlardır. Ek olarak, 1994 ve 1998 yıllarında kahverengi alg Fucus üzerinde bir lazer mikro-ablasyon yaklaşımı, hücre duvarının erken embriyonun fotopolarizasyonundaki rolünü göstermek için kullanılmıştır ^9,10.

Kahverengi algler, 1.6 milyar yıl önce ökaryotik ağacın kökünde ayrılan Stramenopiles grubuna aittir. Sonuç olarak, hayvanlar ve bitkiler gibi diğer çok hücreli organizmalardan filogenetik olarak bağımsızdırlar¹¹. Saccharina latissima, daha yaygın olarak yosun olarak bilinen Laminariales takımına aittir ve dünyadaki en büyük organizmalar arasındadır, 30 m'nin üzerindeki boyutlara ulaşırlar. Saccharina sp., gıda ve yem gibi birçok uygulama için kullanılan büyük bir deniz yosunudur ve polisakkaritleri dünya çapında tarım, farmakolojik ve kozmetik endüstrilerinde kullanılmak üzere ekstrakte edilir^{12, 13}. Özellikle Asya'da ve daha yakın zamanda Avrupa'da yetiştirilmesi, yavruları açık denizde serbest bırakmadan önce kuluçkahanelerde embriyoların hazırlanmasını gerektirir. Tüm kelpler gibi, bir haploid gametofitin büyüdüğü ve döllenme için gametler ürettiği mikroskobik bir gametofitik fazdan oluşan bifazik bir yaşam döngüsüne ve büyük bir düzlemsel bıçağın deniz tabanına veya kayalara tutturulmuş tutucusundan geliştiği diploid makroskopik bir sporofitik faza sahiptir. Sporofit, olgunlukta haploid sporları serbest bırakır, böylece yaşam döngüsü^14,15,16'yı tamamlar.

S. latissima bazı ilginç morfolojik özellikler sunar¹⁷. Embriyosu, farklı doku tiplerinin ortaya çıkmasıyla çakışan çok katmanlı bir yapı elde etmeden önce tek katmanlı bir düzlemsel tabaka^15,18,19 olarak gelişir. Ek olarak, Laminariales, embriyoları maternal gametofitik dokularına bağlı kalan kahverengi alglerin tek taksonlarından biridir (Desmarestiales ve Sporochnales de¹⁵). Bu özellik, maternal dokunun bu gelişimsel süreçteki rolünü inceleme ve kahverengi alglerdeki maternal kontrol mekanizmalarını hayvanlardaki ve bitkilerdeki mekanizmalarla karşılaştırma fırsatı sunar.

Bu makalede, erken bir kelp embriyosunda lazer ablasyon için ilk tam protokol sunulmaktadır. UV ns-pulsed tekniğini içeren bu protokol, embriyogenez sırasında kendi rollerini incelemek için bireysel embriyo hücrelerinin spesifik yıkımına neden olur. Prosedür, Laminariales'te embriyogenez sırasında hücre etkileşimlerini ve hücre kaderini araştırmak için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Protokol

1. Saccharina latissima gametophytes üretimi

1. S. latissima'nın olgun sporofitlerini daha önce tarif edildiği gibi vahşi doğadan toplayın^20,21. Seçilen sporofitlerin epifitlerden (bıçağın yüzeyinde görülebilen küçük organizmalar) veya iç parazitlerden (ağartılmış alanlarda veya bıçaktaki lekelerde bulunur) bulunmadığından emin olun.
2. Bir neşter kullanarak, bıçağın ortasındaki en koyu kısmı (verimli spor üreten doku²²) 1-5 kare parçaya (1 cm²) kesin, varsa ağartılmış lekelerden kaçının.
3. Kesilen parçaları bir neşterin arkası ve biraz emici kağıtla nazikçe temizleyerek kalan epifitleri çıkarın.
4. Temizlenmiş parçaları, daha önce yayınlanan rapor^22'yi takiben sporları serbest bırakmak için steril doğal deniz suyuyla dolu bir cam kaba (bakınız Malzeme Tablosu) 45 dakika boyunca yerleştirin.
5. Bıçak parçalarını çıkarın ve kalıntıları veya istenmeyen organizmaları temizlemek için deniz suyunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
6. Filtrat içindeki sporları plastik Petri kaplarında 20-40 spor / mL konsantrasyonuna kadar seyreltin²².
7. Spor çözeltisini, optimum kültür koşullarıyla (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperiyot 16:8 L:D) yapılandırılmış bir kültür kabinine (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirin.
8. Sporların çimlenmesine ve gametofitlere dönüşmesine izin verin.
   NOT: Spor çimlenmesi kabinde 2 gün sonra görülebilir ve gametofitik hücrelerin ilk hücre bölünmesi genellikle takip eden 48 saat içinde gerçekleşir.
9. 5 gün sonra büyüme ortamını, 0,5x Provasoli çözeltisi (NSW1/2) ile zenginleştirilmiş mikro filtrelenmiş doğal deniz suyuyla değiştirin (bkz.
   NOT: Bu adımların tekrarlanmasını önlemek için, belirli erkek ve dişi gametofitler seçilebilir ve birkaç ay boyunca vejetatif olarak çoğaltılabilir. Gametofitler, yukarıda açıklanan aynı kültür koşullarında kırmızı ışık altında (en az 580 nm dalga boyuna sahip 4 μE.m-2.s-1)²³ yetiştirildiğinde vejetatif kalır (adım ^1.7).

2. Oogenezin parçalanması ve indüksiyonu

1. Gametofitleri bir hücre kazıyıcı ile hasat edin.
2. Küçük bir plastik havane kullanarak, toplanan gametofitleri 1.5 mL'lik bir tüpte 4-5 hücreli parçalara ayırın.
3. Tüpü 1 mL NSW1/2 ile doldurun (adım 1.9).
4. 1x Provasoli çözeltisi (NSW) ile zenginleştirilmiş 3 mL doğal deniz suyuna 2,5 μL ezilmiş gametofit çözeltisi ekleyin ve bir Petri kabına yerleştirin.
   NOT: Daha kolay kullanım için 25 mm, cam tabanlı Petri kabı önerilir.
5. Hazırlanan yemekleri bir kültür dolabına yerleştirin ve 24 ^μE.m-2.s-1 (loş ışık, fotoperiyot 16:8 L:D) şiddetinde beyaz ışık altında ¹³ °C'de gametogenezi indükleyin.
   NOT: İlk gametangia (dişi oogonia ve erkek arkegoni) 5 gün sonra gözlemlenebilir. Erkek küçük hücrelerle hiper-dallıdır ve dişi uzun filamentler oluşturan daha büyük hücrelerden oluşur^15,22. İlk yumurtalar ~ 10 gün sonra gözlenir ve zigotların ilk bölünmesi genellikle takip eden 2 gün içinde gerçekleşir.
6. İlk yumurtaları gözlemledikten altı gün sonra, bulaşıkları daha parlak beyaz ışık koşullarına aktarın: 50 μE.m-2.s-1, fotoperiyot 16: 8 L: D, hala 13 ° C'de.

3. Ablasyon için embriyo seçimi ve sonraki büyümenin izlenmesi için görüntü elde etme

1. Ablasyon adımı sırasında seçilen embriyoları (yeniden) bulmak için tüm Petri kabını görüntüleyin (çanağı oküler mikroskopa geri döndürmeye gerek yoktur) ve seçilen embriyoların sonraki gelişimini izleyin.
   NOT: Görüntüleme için ters çevrilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın ( bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1) ve lazer ablasyonu adım 5'te açıklanmıştır.
2. Petri kabını sahneye yerleştirin ve görsel bir işaretle yönlendirin (örneğin; kalıcı bir işaretleyici ile bir çizgi çizin).
3. Bir embriyoya odaklanmak için 10x/0.45 hedefini kullanın. Petri kabının dört kardinal noktasının konumunu kaydedin.
4. Kutucuk taramasını başlatın. Tüm Petri kabının iletimli/floresan görüntülerini düşük çözünürlükte elde edin: 256 x 256 piksel, çift yönlü tarama ile 1,54 μs piksel bekleme süresi ve %1,2 iletimde 561 nm lazer kullanarak 0,6x dijital yakınlaştırma.
   NOT: 2,5 cm'lik bir Petri kabının tamamı için tarama süresi 225 karo için ~6 dakikadır (Şekil 2). Burada, iletim ve floresan görüntüleme için 561 nm lazer kullanıldı. Floresan sinyali, konfokal fotoçarpanlar (PMT) üzerinde 580-720 nm arasında toplandı ve iletilen ışık, iletilen PMT üzerinde toplandı. 561 nm lazer bu adımda klorofili de izleyebilir, ancak gereksizdir çünkü sadece sinyal gürültüsünü ve organizmaları doğru bir şekilde ayırt etmeye yardımcı olur.
5. Kutucuk tarama görüntüsünü kaydedin ve görüntü alma yazılımı penceresinde açık tutun (bkz.
6. Hedefi değiştirin, Petri kabını çıkarmayın.
   NOT: 40x/1.2 su hedefi, Petri kabını ilk konumundan hareket ettirmeden hedefe daldırma ortamının (su) eklenebilmesi için sahnenin yan tarafına taşındı.
7. Uygun embriyoyu seçmek için daha önce edinilen karo tarama görüntüsünde gezinin. Bu görüntüde bir embriyo tanımlandıktan sonra, sahneyi embriyonun tam konumuna getirin ve bu embriyonun iletilmiş / floresan görüntülerini yüksek çözünürlükte elde edin.
   NOT: Yüksek çözünürlüklü ayarlar: 512 x 512 piksel, 0,130 μm/piksel, tek yönlü tarama ile 0,208 μs piksel bekleme süresi ve %0,9 iletimde 561 nm lazer kullanarak 2x dijital yakınlaştırma.
8. Lazer ablasyon için her embriyo adayı için karo tarama görüntüsüne açıklama ekleyin (Şekil 2B) ve lazer ablasyon adımına geçin.

4. Lazer kalibrasyonu

1. Lazeri kalibre edin ve görüntü alma yazılımını "Click & Fire modu" ndaki lazer sürücüsü yazılımı ve darbeli 355 nm lazer ile senkronize edin.
   NOT: Bu adım, fare imlecinin lazer sürücüsü yazılımındaki konumu ( bkz. Malzeme Tablosu) ile edinme yazılımının canlı görüntüsündeki konumu arasında mükemmel senkronizasyon sağlamak için çok önemlidir.
2. Lazer sürücüsü yazılım paketini açın ve görüntü alma yazılım paketinde Canlı'ya tıklayın.
3. Lazer sürücüsü yazılım paketinde Edinmeyi başlat'a tıklayarak her iki yazılım paketini de senkronize edin. Canlı görüntü artık UV lazer sürücüsü yazılımına da kaydedilmektedir.
4. AOI Seç düğmesine tıklayarak ve UV lazer sürücüsü yazılım paketindeki görüntünün kenarlarına (sağ, sol, üst ve alt) tıklayarak bir ilgi alanı (AOI) tanımlayın.
   NOT: Bu kalibrasyon adımından sonra, edinme yazılım paketindeki piksel boyutu, görüntü formatı ve yakınlaştırma ayarları sabit kalmalıdır.
5. Çanak üzerinde boş bir alan seçin ve cam tabana odaklanmak için sahne alanının seviyesini numune odak düzleminin 20 μm altına indirin.
6. Kalibrasyonu başlat'a tıklayarak ablasyon lazerini ve görüntüleme lazer yörüngelerini ayarlayın ve Manuel kalibrasyon'u seçin.
7. Canlı görüntünün ortasında, cam kapak kapağındaki deliğe karşılık gelen siyah bir nokta görecek kadar yüksek bir lazer gücü seçin (tüm deklanşörler açık olmalıdır).
8. Fare imleci ile bu merkezi siyah noktaya tıklayın ve hizalama prosedürünü tamamlamak için yazılım tarafından önerilen 18 ek noktaya tıklayın.
9. Aynı kapak kapağındaki "Click & Fire modu"ndaki kalibrasyonu kontrol edin.
   NOT: Lazer kalibrasyonu görüntüleme parametrelerine bağlıdır. Lazer kalibre edildikten sonra, görüntüleme parametrelerinin (yani, 512 x 512 piksel, 0,130 μm / piksel, tek yönlü tarama ve 2x dijital yakınlaştırma ile 0,208 μs piksel bekleme süresi) değişmediğinden emin olun.

5. Lazer ablasyon

1. İlgilendiğiniz bir embriyoyu seçin. Görüntü alma yazılımında hızlandırılmış bir kayıt başlatın.
2. Yüksek çözünürlükte 40x/1,2 W objektifle iletilmiş/floresan görüntüler elde edin (yani, 512 x 512 piksel, 0,130 μm/piksel, mono-yönlü tarama ile 1,54 μs piksel bekleme süresi ve %0,9 iletimde 561 nm lazer kullanarak 2x dijital yakınlaştırma). Hızlandırılmış kaydı maksimum hızda alın.
3. Hızlandırılmış kaydın başlangıcında alanı uzaklaştırın. AOI'yi yakınlaştırın.
4. Embriyodaki ilgili hücreye zararlı ışınlamayı uygulamak için lazer sürücüsü yazılımının "Click & Fire" işlevini kullanın. Aşağıdaki parametreleri kullanın:% 45 lazer iletimi (maksimum 40 μW'ye karşılık gelir) ve 1 ms darbe süresi (adım 4).
   NOT: Lazer çekimi sırasında video kaydı önerilir.
5. 688 nm altında, otofloresan kloroplastların sitoplazmadan atılmasını izleyin.
6. Hücre içeriği hücrede kalırsa, hücredeki ihlalin boyutunu artırmak için "Click & Fire" işlevini bir kez daha kullanın. Hücre içeriğinin çoğu serbest bırakılana kadar çekim sayısını minimumda tutarak tekrarlayın.
7. Embriyo stabilize olduktan sonra hızlandırılmış kaydı durdurun (yani, başka hücre içi hareket tespit edilemez (~ 1-5 dakika).
8. Gerekirse kutucuk tarama görüntüsündeki ek açıklamayı güncelleyin.

6. Işınlanmış embriyoların büyümesinin izlenmesi

NOT: İzleme birkaç gün boyunca gerçekleştirilir.

1. Lazer ablasyondan sonra gelişen embriyo sayısını izleyerek hayatta kalma oranını belirleyin ve bunları ölenlerle karşılaştırın.
   NOT: Bazı embriyolar ablasyondan hemen sonra çeşitli nedenlerle ölür. Yüksek ve hızlı bir ölüm oranı genellikle uygun olmayan lazer parametrelerinin veya deney veya sonraki taşıma sırasında strese daha yüksek / daha uzun süre maruz kalmanın bir işaretidir.
2. Her gün lazerle vurulan embriyoların uzunluğunu ölçerek ve bozulmamış embriyolarla karşılaştırarak büyüme gecikmesini belirleyin.
   NOT: Lazerle vurulmuş organizmaların büyüme hızı genellikle tedavi edilmemiş organizmalarınkinden daha yavaştır. Bununla birlikte, bazı (uygunsuz) lazer ayarları bir haftadan fazla büyümeyi engelleyebilir ve bundan sonra büyüme devam eder.
3. Ablatlanmış hücrelere bitişik hücrelerin reaksiyonunu izleyerek bitişik hasarı bulun. Bazı durumlarda, patlama sonrası basınçsızlaştırma komşu hücrelerin patlamasına neden olabilir.
4. Mikrop kontaminasyonlarını kontrol edin. Ortamdaki mikroalglerin ve bakterilerin büyümesini izleyin. Çanakta alışılmadık bir mikrop seviyesi varsa, atın ve protokolü adım 2 veya adım 3'ten tekrarlayın.
   NOT: Lazer ablasyondan sonra, hasarlı S. latissima embriyoları zaten oldukça streslidir ve ek dış stres mortalitenin artmasına neden olabilir. Bakteriyel veya viral salgınlar mümkündür, çünkü tedavi edilen embriyolar aksenik koşullarda büyüyemez.
5. Fenotipi inceleyerek ve hedeflenen bölgenin gelişimindeki rolünü anlayarak atış organizmalarının küresel gelişimini kontrol edin.

Sonuçlar

S. latissima'nın gametofitleri yetiştirildi ve gametogenez, zigot ve embriyo üretmek için indüklendi. Gametogenezin indüksiyonundan on iki gün sonra, embriyolara lazer ablasyon uygulandı. Burada deney, S. latissima embriyolarının genel gelişiminde spesifik hücrelerin rolünü değerlendirmeyi amaçladı. En apikal hücre, en bazal hücre ve medyan hücreler hedef alındı. Karo taramasından sonra, ilgilenilen bir embriyo olan Petri kabının tamamı (Şekil 2A)...

Tartışmalar

Lokal hücresel lazer ablasyon, yüksek hassasiyetle zamansal ve mekansal ablasyona izin verir. Bununla birlikte, etkinliği hedef hücrelerin erişilememesi nedeniyle engellenebilir; örneğin, tüm hücreler üç boyutlu bir embriyoya aittir. Bu protokol, tüm hücrelerin bir lazer ışını ile ayrı ayrı kolayca ayırt edilebileceği ve yok edilebileceği tek katmanlı bir lamina geliştiren alg Saccharina latissima'nın embriyosu üzerinde geliştirilmiştir.

Lazer güc?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm glass bottom petri dish	NEST	801001
Autoclaved sea water	-		Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper	MED 2	83.3951
Cell strainer 40 µm	Corning / Falcon	352340
Culture cabinets	Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01		Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles	Sigma Aldrich	Z359947	Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement	-		Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel	Paramount	PDSS 11
SysCon software	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany		Laser-driver software
ZEN software	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version