אבלציה ממוקדת לייזר בעובר של סכרינה לטיסימה

Summary

השמדת תאים ספציפיים בעובר היא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות תאיות המעורבות בגורל התא. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקות לאבלציה בלייזר של תאים ממוקדים בעובר המוקדם של האצה החומה Saccharina latissima.

Abstract

ב Saccharina latissima, העובר מתפתח כמו יריעת תא חד שכבתית הנקראת למינה או הלהב. כל תא עובר קל לצפייה, ניתן להבחין בקלות בין שכניו לבין שכניו, וניתן לפגוע בו בנפרד. במשך עשרות שנים, אבלציה בלייזר שימשה לחקר התפתחות העוברים. כאן פותח פרוטוקול לאבלציה בלייזר ספציפי לתא עבור עוברים מוקדמים של האצה החומה S. latissima. העבודה המוצגת כוללת: (1) הכנת עוברי סכרינה , עם תיאור הפרמטרים הקריטיים, כולל תנאי תרבית, (2) הגדרות אבלציה בלייזר, ו-(3) ניטור הצמיחה שלאחר מכן של העובר המוקרן באמצעות מיקרוסקופיה של קיטועי זמן. בנוסף, מסופקים פרטים על התנאים האופטימליים להעברת העוברים מפלטפורמת ההדמיה בחזרה למעבדה, מה שיכול להשפיע עמוקות על התפתחות העוברים הבאים. אצות השייכות לסדר למינריאלס מציגות תבניות עובריות הדומות לסכרינה; כך ניתן להעביר פרוטוקול זה בקלות למינים אחרים בטקסון זה.

Introduction

אבלציה בלייזר משמשת כבר עשרות שנים לחקר התפתחות העוברים. הקרנת תאי עובר באמצעות קרן לייזר מאפשרת לעקוב אחר הפוטנציאל הרגנרטיבי והשינוי של שושלת התאים במהלך העובר ולחקור את ההשפעה של אבלציה ממוקדת על חלוקת התא ועל גורל התא. אורגניזמי המודל המשמשים בשיטות אבלציה בלייזר הם בדרך כלל בעלי חיים, כגון חרקים ^1,2, נמטודות ^3,4, בעלי חוליות ^5,6, ולעיתים צמחים ^7,8. בנוסף, נעשה שימוש בגישת מיקרו-אבלציה בלייזר על האצה החומה פוקוס בשנים 1994 ו-1998 כדי להדגים את תפקידו של דופן התא בפוטו-פולריזציה של העובר המוקדם ^9,10.

אצות חומות שייכות לקבוצה Stramenopiles, שהתפצלה בשורש העץ האאוקריוטי לפני 1.6 מיליארד שנה. כתוצאה מכך, הם אינם תלויים מבחינה פילוגנטית באורגניזמים רב-תאיים אחרים, כגון בעלי חיים וצמחים¹¹. Saccharina latissima שייך לסדר Laminariales, הידוע יותר בשם kelps, והם בין האורגניזמים הגדולים ביותר על פני כדור הארץ, המגיעים לגדלים של מעל 30 מ '. Saccharina sp. היא אצה גדולה המשמשת ליישומים רבים כגון מזון והזנה, והפוליסכרידים שלה מופקים לשימוש בתעשיות החקלאיות, הפרמקולוגיות והקוסמטיות ברחבי העולם^{12, 13}. גידולו, בעיקר באסיה ולאחרונה באירופה, דורש הכנת עוברים במדגרות לפני שחרור צעירים בים הפתוח. כמו כל הקלפים, יש לו מחזור חיים דו-פאזי המורכב משלב גמטופיטי מיקרוסקופי, שבמהלכו גמטופיט הפלואידי גדל ומייצר גמטות להפריה, ופאזה מקרוסקופית דיפלואידית, שבה מתפתח להב מישורי גדול מתוך ההחזקה שלו המחובר לקרקעית הים או לסלעים. הספורופיט משחרר נבגים הפלואידים בבגרותם, ובכך משלים את מחזור החיים 14,15,16.

S. latissima מציג כמה תכונות מורפולוגיות מעניינות¹⁷. העובר שלו מתפתח כסדין מישורי חד-שכבתי 15,18,19 לפני שהוא רוכש מבנה רב שכבתי במקביל להופעתם של סוגי רקמות שונים. בנוסף, Laminariales היא אחת הטקסות היחידות של אצות חומות שהעוברים שלהן נשארים מחוברים לרקמה הגמטופיטית האימהית שלהן (Desmarestiales ו-Sporochnales עושים גם^{הם 15}). תכונה זו מציעה את ההזדמנות לחקור את תפקידה של הרקמה האימהית בתהליך התפתחותי זה ולהשוות את מנגנוני הבקרה האימהיים באצות חומות עם אלה בבעלי חיים ובצמחים.

מאמר זה מציג את הפרוטוקול המלא הראשון לאבלציה בלייזר בעובר אצות מוקדם. פרוטוקול זה, הכולל טכניקה של UV ns-pulsed, גורם להרס ספציפי של תאי עובר בודדים כדי לחקור את תפקידם במהלך יצירת עוברים. ההליך מציע גישה אמינה לחקר אינטראקציות בין תאים וגורל התאים במהלך עוברי בלמינריאלס.

Protocol

1. הפקת סכרינה לטיסימה גמטופיטים

1. לאסוף ספורופיטים בוגרים של S. latissima מהטבע כפי שתואר קודם לכן^20,21. ודא שהספורופיטים שנבחרו נטולי אפיפיטים (אורגניזמים קטנים הנראים על פני השטח של הלהב) או טפילים פנימיים (המצויים באזורים הלבנים או בכתמים על הלהב).
2. באמצעות אזמל, חותכים את החלק הכהה ביותר במרכז הלהב (רקמה פורייה המייצרת^{נבגים 22}) ל-1-5 חתיכות מרובעות (1 סמ"ר), תוך הימנעות מכתמים מולבנים, אם קיימים.
3. הסר את כל האפיפיטים הנותרים על ידי ניקוי עדין של החלקים החתוכים עם גב אזמל וכמה נייר סופג.
4. הניחו את החלקים המנוקים בצלחת זכוכית מלאה במי ים טבעיים סטריליים (ראו טבלת חומרים) למשך 45 דקות כדי לשחרר נבגים בעקבות דו"ח²² שפורסם בעבר.
5. הסר את חתיכות הלהב וסנן את מי הים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר פסולת או אורגניזמים לא רצויים.
6. דיללו את הנבגים בתפיח לריכוז של 20-40 נבגים/מ"ל בצלחות פטרי מפלסטיק²².
7. מקם את תמיסת הנבגים בארון תרבית (ראה טבלת חומרים) המוגדר עם תנאי התרבית האופטימליים (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, photoperiod 16:8 L:D).
8. אפשר לנבגים לנבוט ולהתפתח לגמטופיטים.
   הערה: נביטת נבגים נראית לאחר יומיים בארון, וחלוקת התאים הראשונה של התאים הגמטופיטיים מתרחשת בדרך כלל בתוך 48 השעות הבאות.
9. החלף את מדיום הגדילה לאחר 5 ימים במי ים טבעיים מסוננים במיקרו מועשרים בתמיסת פרובסולי 0.5x (NSW1/2) (ראה טבלת חומרים).
   הערה: כדי להימנע מחזרה על שלבים אלה, ניתן לבחור גמטופיטים ספציפיים של זכר ונקבה ולהפיץ אותם באופן וגטטיבי במשך מספר חודשים. הגמטופיטים נשארים וגטטיביים כאשר הם גדלים תחת אור אדום (4 μE.m-2.s-1 עם אורך גל של לפחות 580 ננומטר)²³ באותם תנאי תרבית שתוארו לעיל (שלב 1.7).

2. פיצול ואינדוקציה של אוגנזה

1. קציר גמטופיטים עם מגרד תאים.
2. באמצעות מזיק פלסטיק קטן, יש לרסק את הגמטופיטים שנאספו בצינור 1.5 מ"ל לחתיכות בעלות 4-5 תאים.
3. מלאו את הצינור ב-1 מ"ל NSW1/2 (שלב 1.9).
4. מוסיפים 2.5 μL של תמיסת הגמטופיט המרוסק ל-3 מ"ל של מי ים טבעיים מועשרים בתמיסת פרובסולי 1x (NSW) ומניחים אותם בצלחת פטרי.
   הערה: צלחת פטרי בגודל 25 מ"מ עם תחתית זכוכית מומלצת לטיפול קל יותר.
5. מניחים את הכלים המוכנים בארון תרבית ומשרים גמטוגנזה בטמפרטורה של 13 מעלות צלזיוס תחת אור לבן בעוצמה של 24 μE.m-2.s-1 (אור עמום, פוטופריוד 16:8 L:D).
   הערה: ניתן לצפות במשחק הראשון (אוגוניה נקבה וארכיגוניה זכרית) לאחר 5 ימים. הזכר מסועף יתר על המידה עם תאים קטנים, והנקבה מורכבת מתאים גדולים יותר היוצרים חוטים ארוכים^15,22. הביצים הראשונות נצפות כ-10 ימים לאחר מכן, והחלוקה הראשונה של זיגוטים מתרחשת בדרך כלל תוך היומיים הבאים.
6. שישה ימים לאחר התבוננות בביצים הראשונות, מעבירים את הכלים לתנאי אור לבן בהירים יותר: 50 μE.m-2.s-1, photoperiod 16:8 L:D, עדיין ב 13 °C (64 °F).

3. רכישת תמונה לבחירת עוברים לאבלציה ומעקב אחר גדילה לאחר מכן

1. דמיינו את כל צלחת הפטרי כדי (מחדש) לאתר את העוברים שנבחרו במהלך שלב האבלציה (אין צורך להחזיר את המנה למיקרוסקופ העין) ולעקוב אחר ההתפתחות שלאחר מכן של העוברים שנבחרו.
   הערה: השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי של סריקת לייזר הפוכה (ראה טבלת חומרים) להדמיה (איור 1), ואבלציית הלייזר מתוארת בשלב 5.
2. מניחים את צלחת הפטרי על הבמה ומכוונים אותה עם סימן חזותי (למשל, ציירו קו עם סמן קבוע).
3. השתמש במטרה של 10x/0.45 כדי להתמקד בעובר. רשום את המיקום של ארבע הנקודות הקרדינליות של צלחת פטרי.
4. התחל את סריקת האריחים. רכשו תמונות משודרות/פלואורסצנטיות של כל צלחת פטרי ברזולוציה נמוכה: 256 x 256 פיקסלים, זמן השהייה של פיקסלים של 1.54 מיקרו-μs עם סריקה דו-כיוונית, וזום דיגיטלי של פי 0.6 באמצעות לייזר של 561 ננומטר ב-1.2% שידור.
   הערה: זמן הסריקה של צלחת פטרי שלמה בגודל 2.5 ס"מ הוא כ-6 דקות עבור 225 אריחים (איור 2). כאן, לייזר 561 ננומטר שימש לשידור והדמיה פלואורסצנטית. האות הפלואורסצנטי נאסף בין 580 ל-720 ננומטר על הפוטומולטיפליירים הקונפוקליים (PMT) והאור שהועבר נאסף ב-PMT המועבר. לייזר 561 ננומטר יכול גם לפקח על כלורופיל בשלב זה, אבל זה מיותר כי זה רק עוזר להבחין את רעש האות ואת האורגניזמים כראוי.
5. שמור את תמונת סריקת האריחים והשאר אותה פתוחה בחלון התוכנה לרכישת תמונות (ראה טבלת חומרים).
6. לשנות את המטרה, לא להסיר את צלחת פטרי.
   הערה: מטרת המים 40x/1.2 הועברה לצד הבמה, כך שניתן היה להוסיף את מדיום הטבילה (מים) למטרה מבלי להזיז את צלחת הפטרי ממקומה הראשוני.
7. נווט בתמונת סריקת האריחים שנרכשה בעבר כדי לבחור את העובר המתאים. לאחר שזוהה עובר בתמונה זו, הזיזו את הבמה למיקום המדויק של העובר ורכשו תמונות מועברות/פלואורסצנטיות של אותו עובר ברזולוציה גבוהה.
   הערה: הגדרות ברזולוציה גבוהה: 512 x 512 פיקסלים, 0.130 μm/pixel, זמן השהייה של 0.208 μs פיקסלים עם סריקה חד-כיוונית וזום דיגיטלי של 2x באמצעות לייזר 561 ננומטר ב-0.9% שידור.
8. הביאו את תמונת סריקת האריחים עבור כל עובר המועמד לאבלציה בלייזר (איור 2B) והמשיכו לשלב האבלציה של הלייזר.

4. כיול לייזר

1. כייל את הלייזר וסנכרן את תוכנת רכישת התמונה עם תוכנת מנהל ההתקן לייזר במצב "לחץ ואש" ולייזר פועם של 355 ננומטר.
   הערה: שלב זה חיוני כדי להבטיח סנכרון מושלם בין מיקום סמן העכבר בתוכנת מנהל ההתקן בלייזר (ראה טבלת חומרים) לבין המיקום בתמונה החיה של תוכנת הרכישה.
2. פתח את חבילת התוכנה של מנהל ההתקן בלייזר ולחץ על Live בחבילת התוכנה לרכישת תמונות.
3. סנכרן את שתי חבילות התוכנה על-ידי לחיצה על התחל רכישה בחבילת התוכנה של מנהל התקן הלייזר. התמונה החיה מתועדת כעת גם בתוכנת מנהל ההתקן של לייזר UV.
4. הגדר אזור עניין (AOI) על-ידי לחיצה על בחר לחצן בחר AOI ולחיצה על שולי התמונה (מימין, משמאל, למעלה ולמטה) בחבילת התוכנה לנהג לייזר UV.
   הערה: לאחר שלב כיול זה, ההגדרות עבור גודל פיקסל, פורמט תמונה וזום בחבילת תוכנת הרכישה חייבות להישאר קבועות.
5. בחרו אזור ריק בצלחת והורידו את מפלס הבמה ל-20 מיקרומטר מתחת למישור המוקד לדוגמה כדי להתמקד בתחתית הזכוכית.
6. הגדר את מסלולי לייזר האבלציה ולייזר ההדמיה על ידי לחיצה על התחל כיול ובחר כיול ידני.
7. בחר עוצמת לייזר גבוהה מספיק כדי לראות נקודה שחורה במרכז התמונה החיה המתאימה לחור בכיסוי הזכוכית (כל התריסים חייבים להיות פתוחים).
8. לחץ על נקודה שחורה מרכזית זו עם סמן העכבר ולחץ על 18 נקודות נוספות המוצעות על ידי התוכנה כדי להשלים את הליך היישור.
9. בדוק את הכיול ב"מצב לחץ ואש " על אותו כיסוי.
   הערה: כיול לייזר תלוי בפרמטרים של ההדמיה. לאחר כיול הלייזר, ודא שפרמטרי ההדמיה (כלומר, 512 x 512 פיקסלים, 0.130 μm/pixel, זמן השהייה של 0.208 μs pixel עם סריקה חד-כיוונית וזום דיגיטלי של 2x) לא השתנו.

5. אבלציה בלייזר

1. בחר עובר בעל עניין. התחל הקלטה בהילוך מהיר בתוכנת רכישת התמונות.
2. רכוש תמונות משודרות/פלואורסצנטיות עם מטרה של 40x/1.2 W ברזולוציה גבוהה (כלומר, 512 x 512 פיקסלים, 0.130 מיקרומטר/פיקסל, זמן השהייה של 1.54 μs פיקסלים עם סריקה חד-כיוונית וזום דיגיטלי של 2x באמצעות לייזר של 561 ננומטר ב-0.9% שידור). רכוש את הקלטת קיטועי הזמן במהירות המרבית.
3. התרחקו מהאזור בתחילת ההקלטה של קיטועי הזמן. התקרב ל-AOI.
4. השתמש בפונקציה "לחץ ואש" של תוכנת נהג הלייזר כדי להחיל את ההקרנה המזיקה על התא המעניין בעובר. השתמש בפרמטרים הבאים: 45% העברת לייזר (המתאימה למקסימום של 40 μW) ומשך זמן דופק של 1 אלפיות השנייה (שלב 4).
   הערה: מומלץ להקליט וידאו במהלך צילום הלייזר.
5. מתחת ל-688 ננומטר, עקוב אחר פליטת כלורופלסטים אוטופלואורסצנטיים מהציטופלסמה.
6. אם תוכן התא נשאר בתא, השתמש שוב בפונקציה "לחץ ואש" כדי להגדיל את גודל הפרצה בתא. חזור על הפעולה, תוך שמירה על מספר הזריקות למינימום עד שרוב תוכן התאים ישוחרר.
7. יש להפסיק את רישום קיטועי הזמן לאחר שהעובר התייצב (כלומר, לא ניתן לזהות תנועה תוך-תאית נוספת (כ-1-5 דקות).
8. עדכן את ההערה בתמונת סריקת האריחים, במידת הצורך.

6. מעקב אחר גדילת העוברים המוקרנים

הערה: הניטור מתבצע במשך מספר ימים.

1. קבע את שיעור ההישרדות על ידי ניטור מספר העוברים המתפתחים לאחר אבלציה בלייזר והשווה אותם לאלה שמתים.
   הערה: עוברים מסוימים מתים מיד לאחר אבלציה מסיבות שונות. שיעור תמותה גבוה ומהיר הוא בדרך כלל סימן לפרמטרים לא הולמים של לייזר או לחשיפה גבוהה/ארוכה יותר ללחץ במהלך הניסוי או ההובלה שלאחר מכן.
2. קבעו את עיכוב הגדילה על ידי מדידת אורך העוברים שנורים בלייזר מדי יום והשוואתו לעוברים שלמים.
   הערה: קצב הצמיחה של אורגניזמים שנורים בלייזר הוא בדרך כלל איטי יותר מזה של אורגניזמים לא מטופלים. עם זאת, כמה הגדרות לייזר (לא מתאימות) יכולות לעכב את הצמיחה במשך יותר משבוע, עם צמיחה מתחדשת לאחר מכן.
3. גלה את הנזק הסמוך על ידי ניטור התגובה של תאים הסמוכים לתאים האבלים. במקרים מסוימים, דיכאון לאחר התפרצות עלול לגרום לתאים שכנים להתפוצץ.
4. בדוק אם יש זיהומים בחיידקים. עקוב אחר הצמיחה של מיקרו-אצות וחיידקים במדיום. אם רמה יוצאת דופן של חיידקים נמצאים במנה, יש להשליך אותה ולחזור על הפרוטוקול משלב 2 או שלב 3.
   הערה: לאחר אבלציה בלייזר, עוברי S. latissima פגומים כבר נמצאים בלחץ גבוה, ולחץ חיצוני נוסף יכול לגרום לתמותה מוגברת. התפרצויות חיידקיות או ויראליות אפשריות מכיוון שהעוברים שטופלו אינם יכולים לגדול בתנאים אקסניים.
5. בדוק את ההתפתחות הגלובלית של אורגניזמי הזריקה על ידי לימוד הפנוטיפ והבנת התפקיד בהתפתחות האזור הממוקד.

תוצאות

גמטופיטים של S. latissima גודלו, וגמטוגנזה הושרה כדי לייצר זיגוטים ועוברים. 12 ימים לאחר אינדוקציה של גימטוגנזה, העוברים עברו אבלציה בלייזר. כאן, הניסוי נועד להעריך את תפקידם של תאים ספציפיים בהתפתחות הכוללת של עוברי S. latissima . התא האפיקלי ביותר, התא הבסיסי ביותר, והתאים החציוניים היו ממו...

Discussion

אבלציה מקומית בלייזר תאי מאפשרת אבלציה טמפורלית ומרחבית ברמת דיוק גבוהה. עם זאת, יעילותו עלולה להיפגע על ידי אי הנגישות של תאי המטרה; לדוגמה, כל התאים הם של עובר תלת מימדי. פרוטוקול זה פותח על העובר של אצה Saccharina latissima, אשר מפתחת למינה חד שכבתית שבה ניתן להבחין בקלות בין כל התאים ולהשמיד ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm glass bottom petri dish	NEST	801001
Autoclaved sea water	-		Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper	MED 2	83.3951
Cell strainer 40 µm	Corning / Falcon	352340
Culture cabinets	Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01		Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles	Sigma Aldrich	Z359947	Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement	-		Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel	Paramount	PDSS 11
SysCon software	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany		Laser-driver software
ZEN software	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version