Gezielte Laserablation im Embryo von Saccharina latissima

Zusammenfassung

Die Zerstörung bestimmter Zellen im Embryo ist ein mächtiges Werkzeug, um zelluläre Interaktionen zu untersuchen, die am Zellschicksal beteiligt sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt Techniken zur Laserablation von Zielzellen im frühen Embryo der Braunalge Saccharina latissima.

Zusammenfassung

Bei Saccharina latissima entwickelt sich der Embryo als einschichtiges Zellblatt, das als Lamina oder Klinge bezeichnet wird. Jede Embryozelle ist leicht zu beobachten, leicht von ihren Nachbarn zu unterscheiden und kann individuell anvisiert werden. Seit Jahrzehnten wird die Laserablation zur Untersuchung der Embryonalentwicklung eingesetzt. Hier wurde ein Protokoll zur zellspezifischen Laserablation für frühe Embryonen der Braunalge S. latissima entwickelt. Die vorgestellte Arbeit umfasst: (1) die Vorbereitung von Saccharina-Embryonen mit einer Beschreibung der kritischen Parameter, einschließlich der Kulturbedingungen, (2) die Laserablationseinstellungen und (3) die Überwachung des nachfolgenden Wachstums des bestrahlten Embryos mittels Zeitraffermikroskopie. Darüber hinaus werden Details zu den optimalen Bedingungen für den Transport der Embryonen von der Bildgebungsplattform zurück ins Labor gegeben, was die spätere Embryonalentwicklung tiefgreifend beeinflussen kann. Algen aus der Ordnung der Laminariales weisen ähnlich wie Saccharina ähnliche Embryogenesemuster auf; dieses Protokoll lässt sich somit leicht auf andere Arten in diesem Taxon übertragen.

Einleitung

Die Laserablation wird seit Jahrzehnten zur Untersuchung der Embryonalentwicklung eingesetzt. Die Bestrahlung von Embryozellen mit einem Laserstrahl ermöglicht es, das Regenerationspotenzial und die Veränderung der Zelllinie während der Embryogenese zu überwachen und den Einfluss einer gezielten Ablation auf die Zellteilung und das Zellschicksal zu untersuchen. Die Modellorganismen, die in Laserablationsmethoden verwendet werden, sind typischerweise Tiere, wie Insekten ^1,2, Nematoden 3,4, Wirbeltiere ^5,6 und gelegentlich Pflanzen ^7,8. Darüber hinaus wurde 1994 und 1998 ein Laser-Mikroablationsansatz an der Braunalge Fucus verwendet, um die Rolle der Zellwand bei der Photopolarisation des frühen Embryos ^9,10 zu demonstrieren.

Braunalgen gehören zur Gruppe der Stramenopiles, die sich vor 1,6 Milliarden Jahren an der Wurzel des eukaryotischen Baumes abspalteten. Dadurch sind sie phylogenetisch unabhängig von anderen vielzelligen Organismen wie Tieren und Pflanzen¹¹. Saccharina latissima gehört zur Ordnung der Laminariales, besser bekannt als Seetang, und sie gehören zu den größten Organismen der Erde und erreichen Größen von über 30 m. Saccharina sp. ist eine große Alge, die für viele Anwendungen wie Lebens- und Futtermittel verwendet wird, und ihre Polysaccharide werden für den Einsatz in der landwirtschaftlichen, pharmakologischen und kosmetischen Industrie weltweit extrahiert^{12, 13}. Seine Kultivierung, hauptsächlich in Asien und in jüngster Zeit in Europa, erfordert die Vorbereitung von Embryonen in Brütereien, bevor Jungtiere im offenen Meer freigelassen werden. Wie alle Seetange hat es einen biphasischen Lebenszyklus, der aus einer mikroskopisch kleinen gametophytischen Phase besteht, in der ein haploider Gametophyt wächst und Gameten zur Befruchtung produziert, und einer diploiden makroskopischen sporophytischen Phase, in der sich eine große planare Klinge entwickelt, die von ihrem Festhalten am Meeresboden oder an Felsen befestigt ist. Der Sporophyt setzt bei der Reife haploide Sporen frei und schließt damit den Lebenszyklus^14,15,16 ab.

S. latissima weist einige interessante morphologische Merkmale^{auf 17}. Sein Embryo entwickelt sich als einschichtiges planares Blatt^15,18,19, bevor es eine mehrschichtige Struktur annimmt^, die mit der Entstehung verschiedener Gewebetypen zusammenfällt. Darüber hinaus ist Laminariales eines der wenigen Taxa von Braunalgen, deren Embryonen an ihrem mütterlichen Gametophytengewebe haften bleiben (Desmarestiales und Sporochnales tun dies auch¹⁵). Dieses Feature bietet die Möglichkeit, die Rolle des mütterlichen Gewebes in diesem Entwicklungsprozess zu untersuchen und die mütterlichen Kontrollmechanismen in Braunalgen mit denen in Tieren und Pflanzen zu vergleichen.

Dieser Artikel stellt das erste vollständige Protokoll für die Laserablation in einem frühen Seetangembryo vor. Dieses Protokoll mit UV-ns-gepulster Technik führt zur spezifischen Zerstörung einzelner Embryozellen, um ihre jeweilige Rolle während der Embryogenese zu untersuchen. Das Verfahren bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Untersuchung von Zellinteraktionen und Zellschicksal während der Embryogenese in Laminariales.

Protokoll

1. Produktion von Saccharina latissima Gametophyten

1. Sammle reife Sporophyten von S. latissima aus der Wildnis wie zuvor beschrieben^20,21. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Sporophyten frei von Epiphyten (kleine Organismen, die auf der Oberfläche der Klinge sichtbar sind) oder inneren Parasiten (in den gebleichten Bereichen oder Flecken auf der Klinge) sind.
2. Schneiden Sie mit einem Skalpell den dunkelsten Teil in der Mitte der Klinge (fruchtbares sporenproduzierendes Gewebe²²) in 1-5 quadratische Stücke (1 cm²) und vermeiden Sie dabei gebleichte Flecken, falls vorhanden.
3. Entfernen Sie alle verbleibenden Epiphyten, indem Sie die geschnittenen Stücke vorsichtig mit der Rückseite eines Skalpells und etwas saugfähigem Papier reinigen.
4. Legen Sie die gereinigten Stücke 45 Minuten lang in eine Glasschale, die mit sterilem natürlichem Meerwasser gefüllt ist (siehe Materialtabelle), um Sporen nach dem zuvor veröffentlichten Bericht²² freizusetzen.
5. Entfernen Sie die Klingenstücke und filtern Sie das Meerwasser durch ein 40 μm Zellsieb, um Ablagerungen oder unerwünschte Organismen zu entfernen.
6. Verdünnen Sie die Sporen im Filtrat auf eine Konzentration von 20-40 Sporen/ml in Kunststoff-Petrischalen²².
7. Legen Sie die Sporenlösung in einen Kulturbehälter (siehe Materialtabelle), der mit den optimalen Kulturbedingungen (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, Photoperiode 16:8 L:D) konfiguriert ist.
8. Lassen Sie die Sporen keimen und entwickeln Sie sich zu Gametophyten.
   HINWEIS: Die Sporenkeimung ist nach 2 Tagen im Schrank sichtbar, und die erste Zellteilung der gametophytischen Zellen erfolgt normalerweise innerhalb der folgenden 48 h.
9. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium nach 5 Tagen durch mikrofiltriertes natürliches Meerwasser, angereichert mit einer 0,5-fachen Provasoli-Lösung (NSW1/2) (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Um eine Wiederholung dieser Schritte zu vermeiden, können bestimmte männliche und weibliche Gametophyten ausgewählt und für mehrere Monate vegetativ vermehrt werden. Die Gametophyten bleiben vegetativ, wenn sie unter rotem Licht (4 μE.m-2.s-1 mit einer Wellenlänge von mindestens 580 nm)²³ unter den gleichen oben beschriebenen Kulturbedingungen (Schritt ^1.7) gezüchtet werden^.

2. Fragmentierung und Induktion der Oogenese

1. Ernten Sie Gametophyten mit einem Zellenschaber.
2. Zerkleinern Sie mit einem kleinen Plastikstößel die gesammelten Gametophyten in einem 1,5-ml-Röhrchen in 4-5-zellige Stücke.
3. Füllen Sie das Rohr mit 1 mL NSW1/2 (Schritt 1.9).
4. Geben Sie 2,5 μL der zerkleinerten Gametophytlösung in 3 ml natürliches Meerwasser, angereichert mit 1x Provasoli-Lösung (NSW), und geben Sie sie in eine Petrischale.
   HINWEIS: Für eine einfachere Handhabung wird eine 25 mm große Petrischale mit Glasboden empfohlen.
5. Die zubereiteten Speisen in einen Kulturschrank geben und bei 13 °C unter weißem Licht mit einer Intensität von 24 ^μE.m-2.s-1 (^schwaches Licht, Photoperiode 16:8 L:D) eine Gametogenese induzieren.
   HINWEIS: Die erste Gametangie (weibliche Oogonia und männliche Archegonie) kann nach 5 Tagen beobachtet werden. Das Männchen ist hyperverzweigt mit kleinen Zellen, und das Weibchen besteht aus größeren Zellen, die lange Filamente^{bilden 15,22}. Die ersten Eier werden ~ 10 Tage später beobachtet, und die erste Teilung von Zygoten tritt normalerweise innerhalb der folgenden 2 Tage auf.
6. Sechs Tage nach der Beobachtung der ersten Eier das Geschirr auf hellere weiße Lichtverhältnisse umstellen: 50 μE.m-2.s-1, Photoperiode 16:8 L:D, immer noch bei 13 °C.

3. Bildaufnahme zur Auswahl von Embryonen für die Ablation und Überwachung des nachfolgenden Wachstums

1. Stellen Sie sich die gesamte Petrischale vor, um die während des Ablationsschritts ausgewählten Embryonen (neu) zu lokalisieren (keine Notwendigkeit, die Schale zum Augenmikroskop zurückzubringen) und die nachfolgende Entwicklung der ausgewählten Embryonen zu überwachen.
   HINWEIS: Verwenden Sie ein inverses Laserscanning-Konfokalmikroskop (siehe Materialtabelle) für die Bildgebung (Abbildung 1), und die Laserablation wird in Schritt 5 beschrieben.
2. Stellen Sie die Petrischale auf die Bühne und orientieren Sie sie mit einer visuellen Markierung (z. B. zeichnen Sie eine Linie mit einem Permanentmarker).
3. Verwenden Sie das 10x/0,45-Ziel, um sich auf einen Embryo zu konzentrieren. Notieren Sie sich die Position der vier Himmelsrichtungen der Petrischale.
4. Starten Sie den Kachelscan. Erfassen Sie übertragene/fluoreszierende Bilder der gesamten Petrischale mit niedriger Auflösung: 256 x 256 Pixel, eine Pixelverweilzeit von 1,54 μs mit bidirektionalem Scannen und ein digitaler Zoom von 0,6x mit einem 561-nm-Laser bei einer Transmission von 1,2%.
   HINWEIS: Die Scanzeit für eine ganze 2,5 cm große Petrischale beträgt ~6 min für 225 Fliesen (Abbildung 2). Hier wurde der 561-nm-Laser für die Transmissions- und Fluoreszenzbildgebung eingesetzt. Das Fluoreszenzsignal wurde zwischen 580 und 720 nm auf den konfokalen Photomultipliern (PMT) und das durchgelassene Licht auf der transmittierten PMT gesammelt. Der 561-nm-Laser kann bei diesem Schritt auch Chlorophyll überwachen, aber es ist unnötig, weil es nur hilft, das Signalrauschen und die Organismen richtig zu unterscheiden.
5. Speichern Sie das Kachelscanbild und halten Sie es im Fenster der Bilderfassungssoftware (siehe Materialtabelle) geöffnet.
6. Ändern Sie das Ziel, entfernen Sie die Petrischale nicht.
   HINWEIS: Das 40x/1.2 Wasserobjektiv wurde zur Seite der Bühne bewegt, so dass das Tauchmedium (Wasser) dem Objektiv hinzugefügt werden konnte, ohne die Petrischale aus ihrer Ausgangsposition zu bewegen.
7. Navigieren Sie durch das zuvor aufgenommene Kachelscanbild, um den geeigneten Embryo auszuwählen. Sobald ein Embryo auf diesem Bild identifiziert wurde, bewegen Sie das Stadium in die genaue Position des Embryos und erfassen Sie übertragene / fluoreszierende Bilder dieses Embryos mit hoher Auflösung.
   HINWEIS: Hochauflösende Einstellungen: 512 x 512 Pixel, 0,130 μm/Pixel, 0,208 μs Pixelverweilzeit mit monodirektionalem Scannen und 2x digitaler Zoom mit einem 561 nm Laser bei 0,9% Transmission.
8. Kommentieren Sie das Kachelscanbild für jeden Embryonenkandidaten für die Laserablation (Abbildung 2B) und fahren Sie mit dem Laserablationsschritt fort.

4. Laserkalibrierung

1. Kalibrieren Sie den Laser und synchronisieren Sie die Bilderfassungssoftware mit der Lasertreiber-Software im "Click & Fire-Modus" und einem gepulsten 355-nm-Laser.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um eine perfekte Synchronisation zwischen der Position des Mauszeigers in der Lasertreibersoftware (siehe Tabelle der Materialien) und der Position im Livebild der Erfassungssoftware zu gewährleisten.
2. Öffnen Sie das Lasertreiber-Softwarepaket und klicken Sie im Bilderfassungssoftwarepaket auf Live .
3. Synchronisieren Sie beide Softwarepakete, indem Sie im Lasertreiber-Softwarepaket auf Erfassung starten klicken. Das Livebild wird nun auch in der UV-Laser-Treiber-Software aufgenommen.
4. Definieren Sie einen Interessenbereich (AOI), indem Sie auf die Schaltfläche AOI auswählen klicken und auf die Bildränder (rechts, links, oben und unten) im UV-Lasertreiber-Softwarepaket klicken.
   HINWEIS: Nach diesem Kalibrierungsschritt müssen die Einstellungen für Pixelgröße, Bildformat und Zoom im Erfassungssoftwarepaket konstant bleiben.
5. Wählen Sie einen leeren Bereich auf der Schale und senken Sie den Pegel des Tisches auf 20 μm unterhalb der Probenbrennebene, um sich auf den Glasboden zu konzentrieren.
6. Legen Sie die Ablationslaser- und Bildgebungslaser-Trajektorien fest, indem Sie auf Kalibrierung starten klicken und Manuelle Kalibrierung wählen.
7. Wählen Sie eine Laserleistung, die hoch genug ist, um einen schwarzen Punkt in der Mitte des Livebildes zu sehen, der dem Loch im Glasdeckel entspricht (alle Fensterläden müssen geöffnet sein).
8. Klicken Sie mit dem Mauszeiger auf diesen zentralen schwarzen Punkt und klicken Sie auf 18 zusätzliche Punkte , die von der Software vorgeschlagen werden, um den Ausrichtungsvorgang abzuschließen.
9. Überprüfen Sie die Kalibrierung im "Click & Fire-Modus" auf demselben Deckblatt.
   HINWEIS: Die Laserkalibrierung hängt von den Bildgebungsparametern ab. Stellen Sie nach der Kalibrierung des Lasers sicher, dass sich die Bildgebungsparameter (d. h. 512 x 512 Pixel, 0,130 μm/Pixel, 0,208 μs Pixelverweilzeit bei monodirektionalem Scannen und 2-fachem Digitalzoom) nicht geändert haben.

5. Laserablation

1. Wählen Sie einen Embryo von Interesse. Starten Sie eine Zeitrafferaufnahme in der Bildaufnahmesoftware.
2. Erfassen Sie Sende-/Fluoreszenzbilder mit einem 40x/1,2-W-Objektiv bei hoher Auflösung (d. h. 512 x 512 Pixel, 0,130 μm/Pixel, 1,54 μs Pixelverweilzeit mit monodirektionalem Scannen und 2-fachem Digitalzoom mit einem 561-nm-Laser bei 0,9 % Transmission). Erfassen Sie die Zeitrafferaufzeichnung mit maximaler Geschwindigkeit.
3. Verkleinern Sie den Bereich zu Beginn der Zeitrafferaufzeichnung. Vergrößern Sie den AOI.
4. Verwenden Sie die Funktion "Click & Fire" der Lasertreibersoftware, um die schädliche Bestrahlung auf die Zelle von Interesse im Embryo anzuwenden. Verwenden Sie die folgenden Parameter: 45% Lasertransmission (entspricht maximal 40 μW) und 1 ms Pulszeitdauer (Schritt 4).
   HINWEIS: Videoaufnahmen während der Laseraufnahme werden empfohlen.
5. Überwachen Sie unter 688 nm den Ausstoß autofluoreszierender Chloroplasten aus dem Zytoplasma.
6. Wenn der Zellinhalt in der Zelle verbleibt, verwenden Sie erneut die Funktion "Click & Fire", um die Größe des Verstoßes in der Zelle zu erhöhen. Wiederholen Sie den Vorgang, und beschränken Sie die Anzahl der Aufnahmen auf ein Minimum, bis der größte Teil des Zellinhalts freigegeben wurde.
7. Stoppen Sie die Zeitrafferaufzeichnung, nachdem sich der Embryo stabilisiert hat (d.h. es kann keine weitere intrazelluläre Bewegung festgestellt werden (~1-5 min).
8. Aktualisieren Sie bei Bedarf die Anmerkungen auf dem Kachelscanbild.

6. Überwachung des Wachstums bestrahlter Embryonen

HINWEIS: Die Überwachung erfolgt über mehrere Tage.

1. Bestimmen Sie die Überlebensrate, indem Sie die Anzahl der Embryonen überwachen, die sich nach der Laserablation entwickeln, und vergleichen Sie sie mit denen, die sterben.
   HINWEIS: Einige Embryonen sterben aus verschiedenen Gründen unmittelbar nach der Ablation. Eine hohe und schnelle Sterblichkeitsrate ist in der Regel ein Zeichen für ungeeignete Laserparameter oder eine höhere/längere Stressbelastung während des Experiments oder des anschließenden Transports.
2. Bestimmen Sie die Wachstumsverzögerung, indem Sie jeden Tag die Länge der lasergeschossenen Embryonen messen und mit intakten Embryonen vergleichen.
   HINWEIS: Die Wachstumsrate von lasergeschossenen Organismen ist im Allgemeinen langsamer als die von unbehandelten Organismen. Einige (unangemessene) Lasereinstellungen können jedoch das Wachstum für mehr als eine Woche hemmen, wobei das Wachstum danach wieder einsetzt.
3. Finden Sie den angrenzenden Schaden heraus, indem Sie die Reaktion von Zellen überwachen, die an die abgetragenen Zellen angrenzen. In einigen Fällen kann die Druckentlastung nach dem Ausbruch dazu führen, dass benachbarte Zellen platzen.
4. Überprüfen Sie auf Mikrobenkontaminationen. Überwachen Sie das Wachstum von Mikroalgen und Bakterien im Medium. Wenn eine ungewöhnliche Menge an Mikroben in der Schale vorhanden ist, verwerfen Sie sie und wiederholen Sie das Protokoll aus Schritt 2 oder Schritt 3.
   HINWEIS: Nach der Laserablation sind beschädigte S. latissima-Embryonen bereits stark beansprucht, und zusätzlicher äußerer Stress kann zu einer erhöhten Mortalität führen. Bakterielle oder virale Ausbrüche sind möglich, weil die behandelten Embryonen nicht unter axenischen Bedingungen wachsen können.
5. Überprüfen Sie die globale Entwicklung der Schussorganismen, indem Sie den Phänotyp untersuchen und die Rolle bei der Entwicklung der Zielregion verstehen.

Ergebnisse

Gametophyten von S. latissima wurden gezüchtet, und die Gametogenese wurde induziert, um Zygoten und Embryonen zu produzieren. Zwölf Tage nach der Induktion der Gametogenese unterzogen sich die Embryonen einer Laserablation. Hier zielte das Experiment darauf ab, die Rolle bestimmter Zellen in der Gesamtentwicklung von S. latissima-Embryonen zu bewerten. Die apikalste Zelle, die basalste Zelle und die medianen Zellen wurden ins Visier genommen. Nach dem Scannen der Fliesen wurde die gesamte Petrischale...

Diskussion

Die lokale zelluläre Laserablation ermöglicht eine zeitliche und räumliche Ablation mit hoher Präzision. Seine Effizienz kann jedoch durch die Nichtzugänglichkeit von Zielzellen beeinträchtigt werden; Zum Beispiel sind alle Zellen von einem dreidimensionalen Embryo. Dieses Protokoll wurde am Embryo der Alge Saccharina latissima entwickelt, die eine einschichtige Lamina entwickelt, in der alle Zellen leicht identifiziert und einzeln mit einem Laserstrahl zerstört werden können.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm glass bottom petri dish	NEST	801001
Autoclaved sea water	-		Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper	MED 2	83.3951
Cell strainer 40 µm	Corning / Falcon	352340
Culture cabinets	Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01		Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles	Sigma Aldrich	Z359947	Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement	-		Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25)	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel	Paramount	PDSS 11
SysCon software	Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany		Laser-driver software
ZEN software	Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany		Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version