JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة تجريبية وسير عمل تحليل البيانات للانقسام تحت الأهداف والإطلاق باستخدام nuclease (CUT & RUN) في مسببات الأمراض الفطرية البشرية المبيضات البيضاء.

Abstract

تتحكم عوامل النسخ التنظيمية في العديد من العمليات البيولوجية المهمة ، بما في ذلك التمايز الخلوي ، والاستجابات للاضطرابات والضغوط البيئية ، والتفاعلات بين المضيف والممرض. يعد تحديد الارتباط على نطاق الجينوم لعوامل النسخ التنظيمية بالحمض النووي أمرا ضروريا لفهم وظيفة عوامل النسخ في هذه العمليات البيولوجية المعقدة في كثير من الأحيان. الانقسام تحت الأهداف والإطلاق باستخدام النوكليز (CUT & RUN) هو طريقة حديثة لرسم الخرائط على نطاق الجينوم للتفاعلات المرتبطة بالبروتين والحمض النووي في الجسم الحي والتي تعد بديلا جذابا لترسيب المناعة التقليدي والمستخدم على نطاق واسع للكروماتين متبوعا بطريقة التسلسل (ChIP-seq). CUT & RUN قابل للإعداد التجريبي عالي الإنتاجية ولديه نطاق ديناميكي أعلى بكثير مع تكاليف تسلسل أقل لكل عينة من ChIP-seq. هنا ، يتم وصف بروتوكول CUT & RUN الشامل وسير عمل تحليل البيانات المصاحب المصمم خصيصا للتحليل على مستوى الجينوم لتفاعلات ربط عامل النسخ والحمض النووي في مسببات الأمراض الفطرية البشرية المبيضات البيضاء . ويشمل هذا البروتوكول المفصل جميع الإجراءات التجريبية اللازمة، بدءا من وضع علامات على جينات ترميز عامل النسخ إلى إعداد المكتبة للتسلسل؛ بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتضمن سير عمل حسابي مخصص لتحليل بيانات CUT & RUN.

Introduction

المبيضات البيضاء هي مسببات أمراض فطرية بشرية متعددة الأشكال ذات صلة سريريا موجودة في مجموعة متنوعة من أنماط النمو المختلفة ، مثل وضع نمو العوالق (العائمة الحرة) وكمجتمعات من الخلايا الملتصقة بإحكام محمية بمصفوفة خارج الخلية ، والمعروفة باسم وضع الأغشية الحيوية للنمو1،2،3. على غرار العمليات التنموية والخلوية الأخرى ، يعد تطوير الأغشية الحيوية سمة ضراوة C. albicans المهمة التي من المعروف أنه يتم التحكم فيها على مستوى النسخ بواسطة عوامل النسخ التنظيمية (TFs) التي ترتبط بالحمض النووي بطريقة محددة التسلسل4. في الآونة الأخيرة ، ظهرت منظمات الكروماتين ومعدلات الهيستون أيضا كمنظمين مهمين لتشكيل الأغشية الحيوية C. albicans 5 و morphogenesis6 عن طريق التوسط في الوصول إلى الحمض النووي. لفهم البيولوجيا المعقدة لهذا العامل الممرض الفطري المهم ، فإن الطرق الفعالة لتحديد التوطين على نطاق الجينوم ل TFs محددة خلال العمليات التنموية والخلوية المتميزة أمر قيم.

الترسيب المناعي للكروماتين متبوعا بالتسلسل (ChIP-seq) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في تفاعلات البروتين والحمض النووي في C. albicans 5,6 وقد حلت إلى حد كبير محل الترسيب المناعي الأكثر كلاسيكية للكروماتين متبوعا بطريقة microarray (ChIP-chip)9. ومع ذلك ، تتطلب كل من طرق ChIP-seq و ChIP-chip عددا كبيرا من خلايا الإدخال10 ، والتي يمكن أن تكون عاملا معقدا عند التحقيق في TFs في سياق عينات وطرق نمو محددة ، مثل الأغشية الحيوية التي تم جمعها من المرضى أو النماذج الحيوانية للعدوى. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما ينتج عن اختبار الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) كمية كبيرة من إشارة الخلفية في جميع أنحاء الجينوم ، مما يتطلب مستوى عاليا من التخصيب للهدف محل الاهتمام لفصل الإشارة بشكل كاف عن الضوضاء. في حين أن فحص رقاقة ChIP-chip قديم إلى حد كبير اليوم ، فإن أعماق التسلسل اللازمة ل ChIP-seq تجعل هذا الفحص مكلفا للغاية بالنسبة للعديد من الباحثين ، وخاصة أولئك الذين يدرسون العديد من TFs و / أو البروتينات المرتبطة بالكروماتين.

الانقسام تحت الأهداف والإطلاق باستخدام النوكليز (CUT & RUN) هو بديل جذاب ل ChIP-seq. تم تطويره من قبل مختبر Henikoff في عام 2017 للتحايل على قيود الانقسام الداخلي ChIP-seq والكروماتين متبوعا بتسلسل ChEC-seq11,12 ، وهي طريقة أخرى لتحديد تفاعلات البروتين والحمض النووي على مستوى الجينوم ، مع توفير خرائط عالية الدقة على مستوى الجينوم ل TFs والبروتينات المرتبطة بالكروماتين13 . يعتمد CUT & RUN على الهضم المستهدف للكروماتين داخل النوى المتخلل باستخدام نوكلياز المكورات الدقيقة المربوطة ، يليه تسلسل شظايا الحمض النووي المهضومة 9,10. نظرا لأن شظايا الحمض النووي يتم إنشاؤها على وجه التحديد في المواقع المرتبطة ببروتين ذي أهمية ، بدلا من توليدها في جميع أنحاء الجينوم عن طريق التجزئة العشوائية كما هو الحال في اختبارات ChIP ، فإن نهج CUT & RUN يؤدي إلى انخفاض كبير في إشارات الخلفية ، وبالتالي ، يتطلب 1/10عشر من عمق التسلسل مقارنة ب ChIP-seq11,13 ، 14. وتؤدي هذه التحسينات في نهاية المطاف إلى تخفيضات كبيرة في تكاليف التسلسل وتخفيضات في العدد الإجمالي لخلايا المدخلات اللازمة كمواد أولية لكل عينة.

هنا ، يتم وصف بروتوكول CUT & RUN قوي تم تكييفه وتحسينه لتحديد توطين TFs على مستوى الجينوم في خلايا C. albicans المعزولة عن الأغشية الحيوية وثقافات العوالق. كما يتم تقديم خط أنابيب شامل لتحليل البيانات ، والذي يمكن من معالجة وتحليل بيانات التسلسل الناتجة ويتطلب من المستخدمين أن يكون لديهم الحد الأدنى من الخبرة في الترميز أو المعلوماتية الحيوية. باختصار ، يصف هذا البروتوكول وضع علامات على جينات ترميز TF ، وحصاد الخلايا البيوفيلمية والعوالق ، وعزل النوى المتخلل السليمة ، والحضانة بالأجسام المضادة الأولية ضد البروتين المحدد أو البروتين الموسوم بالظهارة ذات الأهمية ، وربط بروتينات الاندماج الخيمرية A / G-micrococcal nuclease (pAG-MNase) بالأجسام المضادة الأولية ، واستعادة الحمض النووي الجينومي بعد هضم الكروماتين ، وإعداد مكتبات الحمض النووي الجينومية للتسلسل.

يتبع بروتوكول CUT & RUN التجريبي خط أنابيب لتحليل البيانات مصمم لهذا الغرض ، والذي يأخذ قراءات تسلسل الحمض النووي الخام بتنسيق FASTQ وينفذ جميع خطوات المعالجة المطلوبة لتوفير قائمة كاملة بالمواقع المخصبة بشكل كبير المرتبطة ب TF ذات الأهمية (التي يستهدفها الجسم المضاد الأساسي). لاحظ أن خطوات متعددة من بروتوكول إعداد المكتبة الموصوف قد تم تكييفها وتحسينها خصيصا لتحليل CUT & RUN ل TFs (على عكس النيوكليوسومات). في حين تم إنشاء البيانات المقدمة في هذه المخطوطة باستخدام تعديلات خاصة ب TF لمجموعة CUT & RUN تجارية ، فقد تم التحقق من صحة هذه البروتوكولات أيضا باستخدام مكونات من مصادر فردية (أي إنزيم pAG-MNase وخرز تنقية الحمض النووي المغناطيسي) والمخازن المؤقتة المعدة داخليا ، والتي يمكن أن تقلل بشكل كبير من التكلفة التجريبية. يتم وصف بروتوكولات التجارب الشاملة وتحليل البيانات بالتفصيل أدناه في شكل خطوة بخطوة. يتم سرد جميع الكواشف والمعدات الحيوية ، وكذلك وصفات التخزين المؤقت والوسائط ، في جدول المواد والملف التكميلي 1 ، على التوالي.

Protocol

1. وضع علامات على سلالات C. albicans

  1. قم بتحميل الجين محل الاهتمام ، إلى جانب تسلسلاته المحيطة بالمنبع والمصب التي تبلغ 1 كيلوبايت ، من قاعدة بيانات Candida Genome إلى أداة تصميم التمهيدي (انظر جدول المواد). صمم دليلا للحمض النووي الريبي (gRNA) من خلال تمييز 50 نقطة أساس في المنبع والمصب من كودون التوقف، وانقر على أداة تحديد gRNA على اليمين. حدد تصميم الأدلة وتحليلها. استخدم جينوم Ca22 (المبيضات البيضاء SC5314 Assembly 22 (diploid)) و NGG (SpCas9 ، 3' side) الشكل المجاور الأولي (PAM) لمعلمات الدليل ، وانقر فوق إنهاء. يصف الشكل 1 سير العمل الخاص بوضع علامة على جين C. albicans ذي الأهمية باستخدام بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (eGFP).
    1. في الصفحة التالية ، قم بتأكيد المنطقة المستهدفة لتصميم gRNA واضغط على الزر الأخضر. فرز gRNAs حسب النتيجة على الهدف.
      ملاحظة: تقوم أداة التصميم التمهيدي بحساب الدرجات على الهدف وخارج الهدف لتحديد خصوصية gRNAs. يحتوي الدليل المثالي على درجة على الهدف تبلغ >60 ، ودرجة خارج الهدف تبلغ ~ 33 ، ويتداخل مع كودون التوقف. وهذا يتيح خصوصية gRNA عالية مع إلغاء استهداف gRNA بعد تكامل GFP. يشير الحمض النووي الريبي الغريب الذي تبلغ درجته خارج الهدف ~ 50 إلى اختلاف الأليليك ؛ وبالتالي ، سيتم التعرف على أليل واحد فقط من قبل gRNA.
    2. أضف التسلسلات (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') و (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') إلى النهايات 5 و 3 ، على التوالي ، من التسلسل المستهدف gRNA 20 bp ، مما يخلق 60 bp primer / oligonucleotide. بدلا من ذلك ، انسخ تسلسل 20 نقطة أساس إلى حاسبة gRNA التي يوفرها Nguyen et al.15. اطلب أوليغونوكليوتيد gRNA المخصص 60 نقطة أساس.
    3. قم بتضخيم "الجزء A العالمي" باستخدام 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCCGGTTTAAACCGCC-3') و 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') و "الجزء B الفريد" مع أوليغونوكليوتيد gRNA المخصص 60 نقطة أساس (100 mM) من الخطوة 1.1.2. و 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCGGCGGGCTGGTTTAAACACCG-3') باستخدام pADH110 (معرف مستودع البلازميد # 90982) و pADH139 (معرف مستودع البلازميد # 90987) ، على التوالي ، كنموذج DNA. استخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وظروف ركوب الدراجات الواردة في الجدول 1.
      ملاحظة: pADH139 خاص بالسلالات التي تحمل علامة المبيضات مالتوسا LEU2 غير المتجانسة. في حالة استخدام سلالة مع نسخة واحدة من جين C. albicans LEU2 ، استبدل pADH119 (معرف مستودع البلازميد # 90985) بدلا من pADH139.
    4. تأكد من التضخيم الناجح عن طريق فحص 5 ميكرولتر من PCR على هلام الأغاروز بنسبة 1٪. ابحث عن مضخمات تجزئة A و B ~ 1 كيلو بايت.
    5. امزج 1 ميكرولتر لكل من شظايا A و B وقم بخياطتها معا باستخدام تفاعل PCR وظروف ركوب الدراجات الواردة في الجدول 2 لإنشاء جزء C كامل الطول.
    6. أضف 0.5 ميكرولتر من 100 مللي متر AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') و 0.5 ميكرولتر من 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') إلى كل تفاعل PCR ، واخلط جيدا عن طريق السحب ، وأكمل شروط ركوب الدراجات المدرجة في الجدول 3.
      ملاحظة: في حالة استخدام pADH119 بدلا من pADH139، استبدل AHO1238 (5'-TGTATTTTTTTTTAAAATTAGTGACTGTTTC-3') بدلا من AHO1453.
    7. تأكد من خياطة وتضخيم الجزء C بشكل صحيح عن طريق فحص 5 ميكرولتر من PCR على هلام الأغاروز بنسبة 1٪. ابحث عن مضخم ~ 2 كيلو بايت. قم بتخزين الجزء C عند -20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
      ملاحظة: إذا أدى الخياطة والتضخيم إلى نطاقات متعددة وغير محددة أو تلطيخ، فقم بإجراء تنظيف PCR لشظايا A وB وكرر من الخطوة 1.1.5.
  2. أضف eGFP الأحادي المحسن بالكامل من CTG مع تسلسل الرابط (RIPLING)16 (pCE1 ، معرف مستودع البلازميد # 174434) مباشرة في المنبع من كودون التوقف للجين محل الاهتمام باستخدام أداة تصميم التمهيدي ، مما يخلق اندماجا انتقاليا C-terminal. استخدم هذا البناء لتصميم أوليغونوكليوتيدات لتضخيم الحمض النووي للمتبرع (dDNA) من pCE1.
    1. صمم أوليغونوكليوتيد أمامي مع تماثل 18-22 نقطة أساس لتسلسل الرابط و >50 نقطة أساس إلى نهاية 3' من إطار القراءة المفتوح (ORF).
      ملاحظة: يخلق التماثل 18-22 نقطة أساس درجة حرارة تلدين للتضخيم بين 55 درجة مئوية و 58 درجة مئوية. إذا كان أوليغونوكليوتيد كامل الطول يشكل دايمرات تمهيدية ، فقم بضبط التماثل على تسلسل الرابط / GFP أو الجينوم وفقا لذلك.
    2. قم بإنشاء أوليغونوكليوتيد عكسي مع تماثل 18-22 نقطة أساس إلى نهاية 3' من GFP و >50 bp إلى تسلسل المصب غير المشفر ل ORF ليتم وضع علامة عليه.
    3. اطلب هذه النوكليوتيدات القليلة النوكليوتيدات وقم بتضخيم الحمض النووي باستخدام ظروف ركوب الدراجات PCR المقدمة في الجدول 4.
  3. تصميم مجموعتين من أوليغونوكليوتيدات PCR (cPCR) المستعمرة لتأكيد تكامل GFP عن طريق التضخيم عبر مواقع التكامل المحيطة. أولا ، حدد oligonucleotide dDNA الأمامي باستخدام أداة تصميم التمهيدي وانقر فوق زر التمهيدي على اليمين.
    1. انقر على إنشاء | تمهيدي | المعالج Tm Param وتأكيد أن الخوارزمية تم تعيينها إلى SantaLucia 1998. انقر فوق استخدام التحديد لإدخال إحداثيات النوكليوتيد الأمامي المصمم في 1.2.1 كتسلسل مستهدف.
    2. اضبط درجة حرارة التمهيدي المثلى على 55 درجة مئوية والحد الأقصى لحجم الأمبليكون على 900 نقطة في البوصة ، وانقر فوق الزر إنشاء تمهيدي في أعلى اليمين.
    3. حدد زوج oligonucleotide مع أدنى درجة جزاء وتأكد من أن الاشعال تتضخم عبر موقع التكامل 5'. تأكد من أن التمهيدي cPCR الأمامي يقع في المنبع من تسلسل التمهيدي dDNA الأمامي والتمهيدي cPCR العكسي بالكامل ضمن علامة eGFP أو تسلسل الرابط.
    4. كرر الخطوات 1.3-1.3.3. مع عكس الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين أوليغونوكليوتيد لإنشاء المجموعة الثانية من cPCR oligonucleotides التي تتضخم عبر موقع التكامل 3'. تأكد من أن التمهيدي cPCR الأمامي يقع بالكامل داخل علامة eGFP أو تسلسل الرابط والتمهيدي cPCR العكسي في اتجاه المصب من تسلسل التمهيدي dDNA العكسي.
    5. ترتيب هذه oligonucleotides.
  4. هضم 2500 نانوغرام من pADH140 ، الذي يحتوي على Cas9 (معرف مستودع البلازميد # 90988) ، مع إنزيم تقييد لكل جين يتم وضع علامة GFP. اضبط الحجم الإجمالي لكل عملية هضم على 15 ميكرولتر ؛ اضبط حجم الماء وفقا لذلك بناء على تركيز البلازميد pADH140. استخدم شروط الهضم المحددة في الجدول 5. يخزن البلازميد المهضوم على درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
    ملاحظة: في حالة تحويل سلالة بنسخة واحدة من جين C. albicans LEU2 ، بدلا من علامة C. maltosa LEU2 غير المتجانسة ، استبدل pADH137 (معرف مستودع البلازميد # 90986) بدلا من pADH140.
  5. تشويه 12 ميكرولتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية سمك السلمون 10 ملغ / مل لكل جين سيتم وضع علامة GFP عليه عند 99 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ويبرد بسرعة إلى ≤4 درجة مئوية. يخزن على درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
  6. قم بربط سلالة C. albicans LEU2 hemizygous nourseothricin الحساسة على ألواح سكر العنب البيبتون الخميرة (YPD) واحتضنها عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.
  7. اختر مستعمرة واحدة وانقلها إلى 4 مل من YPD السائل. احتضان لمدة 12-16 ساعة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
  8. قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) للزراعة الليلية (12-16 ساعة) في مقياس الطيف الضوئي باستخدام كوفيت يمكن التخلص منه (1 مل ، طول مسار 1 سم).
  9. قم بتخفيف الثقافة بين عشية وضحاها في قارورة Erlenmeyer إلى OD600 من 0.1 في YPD. حساب 5 مل لكل تفاعل وتضمين 5 مل إضافية للتحقق من OD600 في وقت لاحق.
    ملاحظة: يعتمد حجم الثقافة على عدد تفاعلات التحول.
  10. احتضان الثقافة المخففة بين عشية وضحاها في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى OD600 من 0.5-0.8.
  11. جهاز طرد مركزي عند 4000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ؛ إزالة والتخلص من supernatant.
  12. أعد تعليق حبيبة الخلية في 1 مل من الماء المعقم عن طريق خلط ماصة لطيفة مع أطراف المرشح ونقلها إلى أنبوب ميكروفوجي معقم 1.5 مل.
  13. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × غرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة ؛ إزالة والتخلص من supernatant. أعد التعليق في 1 مل من الماء المعقم وكرر ما مجموعه غسلتين.
  14. أعد تعليق الكريات في 1/100عشر من وحدة التخزين المستخدمة في الخطوة 1.10. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام 15 مل ، فأعد تعليق الكريات في 150 ميكرولتر من الماء المعقم.
  15. في أنبوب منفصل لكل تفاعل تحول، امزج 50 ميكرولتر من الجزء C، و50 ميكرولتر من الحمض النووي dDNA، و2500 نانوغرام من pADH140 المهضوم بواسطة إنزيم التقييد، و10 ميكرولتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية المشوهة من سمك السلمون.
  16. أضف 50 ميكرولتر من ملاط الخلية من الخطوة 1.14 واخلطها عن طريق السحب.
  17. قم بعمل مخزون من مزيج اللوحة (الملف التكميلي 1) للتحويلات n + 1.
  18. أضف 1 مل من مزيج الطبق إلى خليط الخلية / الحمض النووي واخلطه عن طريق الانعكاس 5 مرات.
    ملاحظة: اضغط على قيعان الأنابيب أثناء الرجوع إلى الخلف لإزاحة أي سائل متبقي.
  19. ضع الخليط في حاضنة عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) دون اهتزاز.
  20. صدمة حرارية للخلايا لمدة 15 دقيقة عند 44 درجة مئوية في حمام مائي.
  21. قم بطرد مركزي لأنابيب الطرد الدقيق سعة 1.5 مل عند 5000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
  22. قم بإزالة مزيج PLATE عن طريق الشفط بالتفريغ باستخدام أطراف ماصة معقمة ، مع الحرص على تجنب إزعاج حبيبات الخلية.
  23. أعد تعليق حبيبة الخلية في 1 مل من YPD ، والكريات عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة والتخلص من supernatant. كرر ذلك لغسل ثان ، وأعد تعليق حبيبة الخلية في 1 مل من YPD ، وانقل التعليق إلى أنبوب استزراع دائري القاع سعة 10 مل يمكن التخلص منه يحتوي على 1 مل إضافي من YPD (2 مل الحجم النهائي). استعادة الخلايا عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 5 ساعات.
  24. جهاز طرد مركزي للأنابيب عند 4000 × غرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ؛ إزالة والتخلص من supernatant.
  25. أعد تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من الماء المعقم والصفيحة على YPD مع 200 ميكروغرام / مل نورسيوثريسين (NAT200). احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  26. Aliquot 100 ميكرولتر من 20 mM NaOH في آبار لوحة PCR 96 بئرا ، مع كل بئر يتوافق مع مستعمرة فردية نمت على لوحات NAT200. باستخدام مسواك معقم أو طرف ماصة ، اختر مستعمرات فردية محولة ، وقم بتصحيحها على لوحة NAT200 جديدة ، وقم بتدوير الخلايا المتبقية في بئر به 20 mM NaOH. كرر ذلك للمستعمرات المتبقية لإنشاء محللات الخلية المستخدمة كقالب الحمض النووي لتفاعل cPCR.
  27. أغلق لوحة PCR واحتضنها لمدة 10 دقائق عند 99 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري بغطاء ساخن.
  28. قم بإعداد تفاعلين cPCR مع oligonucleotides المصممة في الخطوات 1.3-1.3.5. زيادة عدد ردود الفعل حسب الحاجة. قم بإجراء تفاعل PCR باستخدام محللات الخلية المحضرة في الخطوة 1.26 بعد ظروف ركوب الدراجات ومخاليط تفاعل PCR من الجدول 6. تشغيل 10-20 ميكرولتر من كل بئر على هلام الأغاروز 1 ٪. ابحث عن مستعمرات مع تضخيم مجموعتين تمهيديتين من cPCR تشير إلى GFP dDNA مدمج بشكل صحيح.
  29. مستعمرات Restreak التي دمجت GFP على وسائط اصطناعية كاملة (SC) تفتقر إلى الليوسين. حضانة في حاضنة 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. اختر مستعمرات فردية وقم بتصحيحها على YPD و YPD مع استكمال 400 ميكروغرام / مل من nourseothricin (NAT400). حدد المستعمرات التي تفشل في النمو على ألواح NAT400 بعد 24 ساعة مثل تلك التي فقدت مكونات كريسبر بنجاح.
  30. تأكد من الاحتفاظ بعلامة GFP عن طريق تكرار الخطوات 1.25-1.28 باستخدام خلايا من لوحة تصحيح YPD. إذا كانت النطاقات الصحيحة موجودة ، فقم بالتلقيح في 4 مل من YPD وتنمو بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) ، كما هو موضح في الخطوة 1.7.
  31. امزج الثقافة الليلية للسلالة الجديدة الموسومة ب GFP مع الجلسرين 50٪ المعقم بالفلتر بنسبة 1: 1 في أنبوب تبريد معقم. يخزن على درجة حرارة -80 درجة مئوية ويعاد تركيبه على ألواح YPD حسب الحاجة.
    ملاحظة: يوصى بالتحقق من صحة السلالات الموسومة ب GFP عن طريق تأكيد التوطين النووي ل TF الموسوم عبر الفحص المجهري الفلوري وتأكيد النمط الظاهري من النوع البري في فحص النمط الظاهري المناسب.

2. إعداد عينة من الثقافات البيوفيلم

  1. Streak C. albicans سلالة (سلالات) موسومة GFP على لوحات أجار YPD وتحضن عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. باستخدام مستعمرة معزولة واحدة من صفيحة أجار ، قم بالتلقيح في 4 مل من الوسط السائل YPD. احتضان في 30 درجة مئوية مع اهتزاز بين عشية وضحاها (12-16 ساعة). حدد OD600 للثقافة (الثقافات) الليلية.
    ملاحظة: يوصى باستخدام ثلاثة نسخ بيولوجية لكل عينة لتجارب CUT & RUN.
  2. قم بتلقيح صفيحة زراعة خلايا معقمة من 12 بئرا غير معالجة مع الثقافة الليلية إلى OD600 النهائي من 0.5 (أي ما يعادل 2 × 107 خلايا / مل) في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) -1640 متوسطة إلى حجم نهائي من 2 مل. احتضن لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ميكروبليت مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يوصى باستخدام صفيحة واحدة من 12 بئرا لزراعة الخلايا لكل سلالة مع بئر واحدة غير ملقحة كوحدة تحكم في التلوث متوسطة الوحدة. تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح باستخدام أقل من 1/10عشر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا (أو أقل من 5 ملايين خلية). يؤدي استخدام عدد أكبر من الخلايا إلى زيادة إجمالي إنتاجية الحمض النووي ، مما يؤدي عادة إلى مكتبات تسلسل عالية الجودة.
  3. قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق الشفط باستخدام أطراف ماصة معقمة متصلة عبر أنابيب بلاستيكية مرنة بجهاز مصيدة فراغ. اغسل الخلايا الملتصقة مرة واحدة ب 2 مل من محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS). أضف 2 مل من متوسط RPMI-1640 الطازج إلى الآبار واحتضنه لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: تغيير أطراف الماصة بين الآبار ذات السلالات و / أو الظروف المختلفة. لا تكشط الجزء السفلي من البئر بالطرف أثناء الشفط.
  4. في نهاية الحضانة على مدار 24 ساعة ، قم بجمع وتجميع المواد السائلة والأغشية الحيوية من كل بئر من الآبار ال 11 الملقحة في أنبوب مخروطي واحد معقم بسعة 50 مل. كرر ذلك حسب الضرورة مع حمامات السباحة المستقلة إذا كانت معالجة أكثر من سلالة واحدة أو حالة نمو واحدة في وقت واحد.
    ملاحظة: كشط قيعان وحواف كل بئر بطرف مرشح ماصة لإزاحة الخلايا التي تظل ملتصقة بالسطح. استخدم الماصة لتجانس الأغشية الحيوية.
  5. عينات الكريات عن طريق الطرد المركزي في 4000 × غرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بصب أكبر قدر ممكن من السوبرناتانت ، مع الحرص على تقليل تعطل الكريات. قم بتجميد الكريات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية مباشرة بعد التجميع أو المتابعة مباشرة إلى الخطوة 4 (عزل النوى).

3. إعداد عينة من الثقافات العوالق

  1. Streak C. albicans سلالة (سلالات) موسومة GFP على لوحات أجار YPD وتحضن عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. باستخدام مستعمرة معزولة واحدة من صفيحة أجار ، قم بالتلقيح في 4 مل من الوسط السائل YPD. احتضان في 30 درجة مئوية مع اهتزاز بين عشية وضحاها (12-16 ساعة). حدد OD600 للثقافة (الثقافات) الليلية.
  2. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD 600 من 0.1 في 50 مل من الوسط السائل RPMI-1640 وتحضن عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 2-5 ساعات حتى OD600 بين 0.5 و 0.8.
    ملاحظة: يجب أن تمر الخلايا بمضاعفتين على الأقل قبل حصادها. يمكن تعديل الظروف المستخدمة في مزارع العوالق حسب الحاجة.
  3. قم بتكسير العينات عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بصب أكبر قدر ممكن من السوبرناتانت ، مع الحرص على تقليل تعطل الكريات. قم بتجميد الكريات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية مباشرة بعد التجميع أو المتابعة مباشرة إلى الخطوة 4 (عزل النوى).

4. عزل النوى

ملاحظة: في يوم التجربة، قم بإعداد Ficoll Buffer طازج، وأضف 2-mercaptoethanol ومثبط الأنزيم البروتيني إلى aliquot (s) من المخزن المؤقت لإعادة التعليق، وأضف مثبط الأنزيم البروتيني إلى aliquot (s) من SPC Buffer (انظر الملف التكميلي 1). لإعادة تعليق الكريات ، ماصة بلطف باستخدام إما 200 ميكرولتر أو 1 مل من أطراف ماصة لتجنب إتلاف الخلايا أو النوى. قبل البدء في عزل النوى ، قم بتشغيل كتلة الحرارة لتسخينها مسبقا إلى 30 درجة مئوية. يجب أن تكون جميع أطراف الماصة والأنابيب لبقية هذا البروتوكول معتمدة من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي وخالية من DNase / RNase ، ويوصى باستخدام أطراف المرشح لجميع خطوات السحب اللاحقة.

  1. أعد تعليق الكريات (الكريات) في 1 مل من المخزن المؤقت لإعادة التعليق في درجة حرارة الغرفة وانقله إلى أنبوب ميكروفوج معقم سعة 1.5 مل. الكريات على ارتفاع 2000 × غرام في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين في جهاز طرد مركزي على الطاولة وإزالة السوبرنات.
    ملاحظة: قم بإزالة المادة الفائقة باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر أو 1 مل ، مع الحرص على تقليل تعطل الكريات.
  2. أعد تعليق الكريات (الكريات) في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق في درجة حرارة الغرفة. من الكريات المعاد تعليقها ، انقل أليكوت 5 ميكرولتر إلى أنبوب PCR جديد وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية للاستخدام لاحقا.
    ملاحظة: سيتم استخدام هذا الأليكوت كعنصر تحكم خلال خطوة لاحقة لمراقبة الجودة لتقييم جودة النوى المعزولة.
  3. الكريات في 2000 × غرام لمدة دقيقتين وإزالة والتخلص من supernatant باستخدام ماصة. كرر خطوة الغسيل مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق.
  4. جهاز طرد مركزي عند 2000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين وإزالة السوبرناتانت. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق و 10 ميكرولتر من محلول الليتيكاس (50 مجم / مل ، انظر جدول المواد). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية في كتلة حرارية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام حمام مائي يتم تسخينه إلى 30 درجة مئوية بدلا من كتلة حرارية. تم تحسين ظروف التكاثر الوريدي المستخدمة هنا لتكون فعالة لكل من الخميرة والخلايا الواصلة من C. albicans. يوصى بتحسين ظروف التكاثر عند تطبيق هذا البروتوكول على خلايا C. albicans ذات الطفرات التي تؤثر على سلامة جدار الخلية أو غيرها من الأشكال الخلوية. خلال خطوة الحضانة هذه التي تستغرق 30 دقيقة ، يكون لدى المستخدم خيار إكمال الخطوة 5 (تنشيط Concanavalin A Bead) في وقت مبكر لتوفير الوقت.
    1. الخطوة الحاسمة: بعد خطوة الحضانة لمدة 30 دقيقة ، انقل أليكوت 5 ميكرولتر إلى أنبوب PCR جديد. إلى 5 ميكرولتر من النوى المعزولة و 5 ميكرولتر من الخلايا السليمة المخزنة عند 4 درجات مئوية من الخطوة 4.2 ، أضف 1 ميكرولتر كالكوفلور أبيض (صبغة جدار خلية فلورسنت) و 1 ميكرولتر من SYTO 13 (بقعة حمض نووي). تحضن في 30 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    2. فحص بصري لسلامة ونقاء النوى المعزولة باستخدام المجهر الفلوري. ابحث عن النوى المعزولة التي تظهر نوى سليمة ملطخة بشكل بارز (باستخدام مرشح إثارة 488-509 نانومتر) وتأكد من عدم وجود تلطيخ جدار الخلية بواسطة صبغة كالكوفلور البيضاء (باستخدام مرشح إثارة 390-420 نانومتر). في خلايا التحكم السليمة ، ابحث عن تلطيخ جدار الخلية البارز بواسطة صبغة Calcofluor البيضاء (باستخدام مرشح إثارة 390-420 نانومتر) ونوى سليمة ملطخة (باستخدام مرشح إثارة 488-509 نانومتر).
  5. جهاز طرد مركزي عند 2000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة السوبرنات. أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق البارد باستخدام أطراف مرشح 1 مل عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل 5 مرات. جهاز طرد مركزي عند 2000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة supernatant باستخدام ماصة 1 مل. أعد تعليق الكريات مع 1 مل من Ficoll Buffer الطازج المصنوع من الثلج البارد.
    ملاحظة: احتفظ بالعينات والمخازن المؤقتة على الجليد من هذه النقطة إلى الأمام.
  6. قم بالطرد المركزي للعينات عند 5000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق وقم بإزالة السوبرنات. أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من SPC المخزن المؤقت البارد للثلج.
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، تعامل مع النوى بلطف شديد لتجنب إتلافها.
  7. الطرد المركزي للعينات في 5000 × غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق وإزالة أكبر قدر ممكن من supernatant دون تعطيل الكريات. ضع الأنابيب التي تحتوي على النوى الحبيبية على الجليد وانتقل إلى الخطوة 5. إذا كانت الخطوة 5 قد اكتملت بالفعل في وقت مبكر في الخطوة 4.4 ، فانتقل إلى الخطوة 6 أو قم بتجميد الكريات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية مباشرة بعد التجميع.

5. كونكانافالين تنشيط حبة

ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. من هذه النقطة فصاعدا ، يتوفر للمستخدمين خيار الاستمرار في البروتوكول باستخدام مجموعة CUT & RUN المتاحة تجاريا أو المكونات الرئيسية المصدر بشكل فردي وإعداد المخازن المؤقتة داخل الشركة. في حالة استخدام المجموعة التجارية ، يتم تضمين جميع المخازن المؤقتة والكواشف المستخدمة أدناه في المجموعة ما لم يذكر خلاف ذلك. كما يتم توفير أرقام كتالوج فردية للحصول على كواشف بشكل مستقل في جدول المواد. تبرد جميع المخازن المؤقتة على الثلج قبل الاستخدام. بمجرد اكتمال الخطوة 5 ، يوصى بالمتابعة إلى الخطوة 6 على الفور. تجنب ذوبان الجليد المتعدد للنوى المعزولة لأنه من المعروف أنه يزيد من تلف الحمض النووي ويمكن أن يؤدي إلى نتائج رديئة الجودة.

  1. أعد تعليق حبات الكونكانافالين A (ConA) برفق باستخدام ماصة. نقل 22 ميكرولتر من تعليق حبة ConA لكل عينة لتتم معالجتها في أنبوب microfuge واحد 1.5 مل. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي حتى يصبح ملاط الخرز واضحا ؛ قم بإزالة والتخلص من supernatant باستخدام ماصة.
    ملاحظة: عند إجراء CUT & RUN لما مجموعه 10 عينات، على سبيل المثال، نقل 220 ميكرولتر من تعليق حبة ConA إلى أنبوب microfuge سعة 1.5 مل.
  2. قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على حبات ConA من الرف المغناطيسي وأضف على الفور 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتنشيط الخرز البارد المثلج واخلطه بلطف باستخدام ماصة. ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي حتى يصبح ملاط الخرز واضحا ؛ قم بإزالة والتخلص من supernatant باستخدام ماصة. كرر هذه الخطوة لما مجموعه غسلتين.
  3. أعد تعليق الخرز في 22 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتنشيط الخرز البارد لكل عينة من النوى المراد معالجتها. احتفظ بالخرز على الثلج حتى الحاجة إليه.
    ملاحظة: تعتمد إنتاجية الخطوات اللاحقة على عدد وسعة رفوف الأنابيب المغناطيسية المتوفرة. تعد معالجة 32 عينة في رففين أنبوبيين من 16 بئرا رقما يمكن التحكم فيه لمعظم مستخدمي هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن الإنتاجية الأعلى ممكنة للمستخدمين الأكثر خبرة ، أو إذا كانت أنظمة مناولة السوائل الروبوتية متاحة.

6. ربط النوى إلى الخرز المنشط

ملاحظة: قم بتبريد جميع المخازن المؤقتة على الثلج قبل الاستخدام. يجب تحضير جميع المخازن المؤقتة المكملة بمثبطات الأنزيم البروتيني طازجة في يوم التجربة. يوصى باستخدام أنابيب الشريط 0.2 مل في الخطوات اللاحقة.

  1. أعد تعليق النوى الكروية من الخطوة 4 في 100 ميكرولتر من مخزن SPC العازل البارد ونقلها إلى شريط جديد من 8 أنابيب سعة 0.2 مل. أضف 20 ميكرولتر من الخرز المنشط إلى كل عينة وماصة بلطف للخلط. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق دون إثارة.
  2. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي حتى يصبح الملاط واضحا ؛ قم بإزالة والتخلص من supernatant باستخدام ماصة. قم بإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي ، وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل البارد إلى كل عينة. أعد تعليق الخرز عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل 5 مرات. انقل 100 ميكرولتر من كل عينة إلى شريط جديد من 8 أنابيب سعة 0.2 مل.
    1. الخطوة الحاسمة: قسم كل عينة CUT & RUN إلى اثنين من الاقتباسات المنفصلة. استخدم أحد الأليكوتس للجسم المضاد السلبي للتحكم (على سبيل المثال ، الجسم المضاد للتحكم السلبي IgG) والآخر للجسم المضاد المستهدف ضد البروتين محل الاهتمام (على سبيل المثال ، الجسم المضاد المضاد ل GFP).
      ملاحظة: كلتا العينتين مطلوبتان لخط الأنابيب الحسابي لتحديد إشارات التخصيب الخاصة بفرقة العمل ذات الأهمية بدقة. يمكن أيضا إجراء تحكم إضافي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل GFP مع سلالة غير موسومة. أظهر هذا التحكم نتائج مماثلة لاستخدام الأجسام المضادة IgG في سلالة موسومة ب GFP. لذلك ، من أجل البساطة ، يوصى باستخدام عنصر تحكم IgG القياسي لجميع التجارب.

7. ربط الأجسام المضادة الأولية

ملاحظة: يرتبط بروتين الانصهار pAG-MNase بشكل جيد بالأرانب والماعز والحمير وخنزير غينيا والأجسام المضادة IgG للفأر17. بشكل عام ، تتوافق معظم الأجسام المضادة التجارية المعتمدة من ChIP-seq مع إجراءات CUT & RUN. تعتمد كمية الأجسام المضادة الأولية المستخدمة على كفاءة الجسم المضاد ، وقد يكون من الضروري معايرة الجسم المضاد (على سبيل المثال ، 1:50 و 1:100 و 1:200 و 1:400 التخفيف النهائي) إذا لم يتم اختبار الجسم المضاد ذي الأهمية مسبقا في تجارب ChIP أو CUT & RUN. قم بتبريد جميع المخازن المؤقتة على الثلج قبل الاستخدام. يجب إعداد جميع المخازن المؤقتة المستخدمة في خطوات ربط الأجسام المضادة طازجة في يوم التجربة.

  1. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي وانتظر حتى يصبح الملاط واضحا تماما ؛ قم بإزالة والتخلص من supernatant باستخدام ماصة. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للأجسام المضادة واخلطه بلطف عن طريق السحب.
  2. أضف 3 ميكرولتر من الجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد ل GFP (أو 0.5 ميكروغرام إذا كنت تستخدم جسما مضادا غير مختبر). احتضن الأنابيب على خلاط المغذيات عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: تشير بعض بروتوكولات CUT & RUN إلى زيادة الغلة عن طريق إضافة جسم مضاد ثانوي قبل إضافة pAG-MNase14 ؛ ومع ذلك ، لم يلاحظ أي تحسن كبير باستخدام هذه الخطوة المضافة ، وبالتالي ، لم يتم تضمينها في هذا البروتوكول.
  3. قم بطرد الأنابيب لفترة وجيزة عند 100 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 ثوان ، وضع الأنابيب على رف مغناطيسي ، وبمجرد أن يصبح الملاط واضحا ، قم بإزالة والتخلص من supernatant باستخدام ماصة. في حين أن الأنابيب التي تحتوي على الخرز لا تزال على الرف المغناطيسي ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة مباشرة على الخرز. قم بإزالة والتخلص من supernatant باستخدام ماصة. كرر ذلك لمدة غسلتين باستخدام المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة على الجليد.
  4. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة إلى كل أنبوب واخلطه بلطف عن طريق السحب.
    ملاحظة: غالبا ما يتم تجميع الخرز في هذه المرحلة ولكن يمكن تشتيته بسهولة عن طريق الخلط بلطف باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.

8. ربط pAG-MNase بالأجسام المضادة

  1. أضف 2.5 ميكرولتر من pAG-Mnase (مخزون 20x) إلى كل عينة واخلطها بلطف عن طريق السحب. ضع العينات (مرتفعة قليلا بزاوية ~ 45 درجة) على جوزة عند 4 درجات مئوية. قم بتشغيل الجوزة واحتضن العينات لمدة 1 ساعة.
  2. قم بطرد مركزي لفترة وجيزة لأنابيب الشريط عند 100 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 ثوان ، وضع الأنابيب على رف مغناطيسي ، وبمجرد أن يصبح الملاط واضحا ، قم بإزالة والتخلص من المادة الفائقة باستخدام ماصة.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة. الأجسام المضادة المحمولة المتبقية في غطاء أو جوانب الأنابيب بعد هذه الخطوة ستزيد بشكل كبير من كمية إشارة الخلفية.
  3. في حين أن الأنابيب التي تحتوي على الخرز لا تزال على الرف المغناطيسي ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة ، واسمح للملاط بالإزالة ، وقم بإزالة والتخلص من supernatant باستخدام ماصة. كرر هذه الخطوة لما مجموعه غسلتين باستخدام المخزن المؤقت لنفاذية الخلية.
  4. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة إلى العينات وقم بماصتها بلطف لأعلى ولأسفل 5 مرات.

9. هضم الكروماتين المستهدف وإطلاقه

  1. احتضن الأنابيب التي تحتوي على العينة (العينات) في حمام ثلجي رطب لمدة 5 دقائق. أضف 3 ميكرولتر من 100 mM CaCl2 إلى كل عينة باستخدام ماصة متعددة القنوات. ماصة بلطف لأعلى ولأسفل 5 مرات ، وأعد الأنابيب على الفور إلى حمام الثلج الرطب ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة.
  2. أضف 66 ميكرولتر من المخزن المؤقت Stop إلى كل عينة وقم بالدوامة بلطف للخلط. احتضان العينات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حمام جاف.
    ملاحظة: يوصى بإضافة 1.5 جزء من الحمض النووي غير المتجانس E. coli spike-in لكل عينة في المخزن المؤقت المؤقت. تؤدي إضافة 1.5 جزء من الحمض النووي ل E. coli spike-in إلى 1000-10000 قراءة سبايك في الخريطة ل 1-10 ملايين قراءة تجريبية مخططة14. يستخدم الحمض النووي السنبلة لمعايرة عمق التسلسل وهو مهم بشكل خاص لمقارنة العينات في سلسلة. يوصى بشدة بإضافة الإشريكية القولونية السنبلة ولكنها ليست ضرورية. تتضمن مجموعة CUT & RUN التجارية الحمض النووي E. coli spike-in ، ولكن يمكن أيضا شراؤها بشكل منفصل.
  3. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي وانقل 160 ميكرولتر من السوبرناتانت إلى أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 مل. انقل 80 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب ميكروفوجي جديد سعة 2 مل وخزنه عند -20 درجة مئوية في حالة الحاجة إلى عينة احتياطية. انتقل إلى الخطوة 10 باستخدام عينة 80 ميكرولتر.

10. تنظيف عينات الحمض النووي التي تم جمعها

ملاحظة: احتضان حبات تنقية الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. قبل التبريد 100٪ الأيزوبروبانول على الجليد. عند خلط العينات ، ماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات.

  1. دوامة خرز تنقية الحمض النووي لتجانس تعليق الخرز. أضف 50 ميكرولتر (~ 0.6x حجم العينة) من الخرز المعاد تعليقه إلى كل عينة. تخلط الماصة وتحضن العينات على المكسرات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: نسبة حبات تنقية الحمض النووي إلى العينة المستخدمة أمر بالغ الأهمية. إن استخدام 0.6x حجم من محلول خرزة تنقية الحمض النووي بالنسبة للعينة يسمح للخرز المغناطيسي بالارتباط بشظايا الحمض النووي الكبيرة المنبعثة من النوى التالفة. شظايا الحمض النووي المخصب CUT & RUN أصغر بكثير من شظايا الحمض النووي الكبيرة هذه ، وبالتالي يتم الاحتفاظ بها في supernatant في هذه الخطوة.
  2. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي وانقل 130 ميكرولتر من المادة الفائقة التي تحتوي على الحمض النووي إلى شريط 8 أنابيب سعة 0.2 مل. أضف 30 ميكرولتر إضافية من حبات تنقية الحمض النووي إلى العينة (العينات) (الحجم الإجمالي هو 160 ميكرولتر).
  3. أضف 170 ميكرولتر (~ 1x حجم العينة) من الأيزوبروبانول البارد المثلج بنسبة 100٪ ، واخلطه جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات ، واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان استخدام الأيزوبروبانول البارد بنسبة 100٪ في هذه الخطوة لخرز تنقية الحمض النووي لالتقاط الأجزاء الصغيرة الغنية ب CUT & RUN.
  4. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي ، وبمجرد إزالة الملاط ، قم بإزالة الملاط بعناية وتخلص منه باستخدام ماصة.
  5. أثناء وجود الأنابيب على الرف المغناطيسي ، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج في درجة حرارة الغرفة بنسبة 80٪ إلى الأنابيب واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. قم بإزالة والتخلص بعناية من supernatant باستخدام ماصة. كرر هذه الخطوة لما مجموعه غسلتين مع 80 ٪ من الإيثانول.
  6. قم بتدوير الأنابيب بسرعة عند 100 × جم ، وضع الأنابيب مرة أخرى على الرف المغناطيسي ، وإزالة أي إيثانول متبقي باستخدام ماصة بعد إزالة الملاط. جفف الخرز في الهواء لمدة 5 دقائق بينما تبقى الأنابيب على الرف المغناطيسي مع فتح الغطاء.
    ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق من وقت التجفيف لأن هذا يمكن أن يقلل بشكل كبير من إنتاج الحمض النووي النهائي.
  7. قم بإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي وقم بإزالة الحمض النووي من الخرز عن طريق إضافة 17 ميكرولتر من 0.1x Tris-EDTA (TE) عند درجة الحموضة 8. تخلط جيدا وتحضن الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي حتى يصبح الملاط واضحا. بمجرد إزالة الملاط ، انقل بعناية 15 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب PCR معقم سعة 0.2 مل.
  9. قم بقياس تركيز الحمض النووي الذي تم جمعه باستخدام مقياس الفلورومتر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: عادة ما يكون تركيز الحمض النووي الذي تم جمعه ~ 1 نانوغرام / ميكرولتر. في بعض الأحيان ، يكون تركيز الحمض النووي الذي تم جمعه منخفضا جدا بحيث لا يمكن تحديده كميا باستخدام مقياس الفلورومتر. هذا ليس مؤشرا على تجربة فاشلة. المضي قدما في إعداد المكتبة بغض النظر عن تركيز الحمض النووي الذي تم جمعه.
  10. انتقل إلى الخطوة 11 أو قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة.

11. إعداد المكتبة للتسلسل

ملاحظة: تستخدم الخطوات التالية مجموعة أدوات إعداد مكتبة متوفرة تجاريا. عند تنفيذ الخطوات باستخدام Ligation Master Mix ، قلل من لمس الأنابيب واحتفظ بها دائما على الجليد.

  1. باستخدام 0.1x TE عند درجة الحموضة 8 ، ارفع الحجم الإجمالي للحمض النووي CUT & RUN إلى 50 ميكرولتر. أضف 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى الحمض النووي CUT &RUN واخلطه جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات.
  2. قم بإجراء دوران سريع عند 100 × جم لجمع كل السائل من جانبي الأنبوب. ضع الأنابيب في جهاز تدوير حراري مع ضبط الغطاء المسخن على ≥75 درجة مئوية وقم بتشغيل ظروف ركوب الدراجات في الجدول 7.
    ملاحظة: استنادا إلى تركيزات الحمض النووي لإدخال البداية التي تم جمعها من الخطوة 10، اتبع تخفيف المحول المطلوب من الجدول 8.
  3. أضف 2.5 ميكرولتر من المحول لكل عينة واخلطه جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان إضافة المحول إلى العينة وخلطه جيدا قبل إضافة المزيج الرئيسي للربط.
  4. اصنع مزيجا رئيسيا من 30 ميكرولتر من Ligation Master Mix و 1 ميكرولتر من محسن الربط. أضف 31 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى العينة (العينات). اخلطي جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات.
  5. احتضنها عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في جهاز تدوير حراري مع إيقاف الغطاء الساخن.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان الاحتفاظ بالعينات على الجليد ونقلها إلى الدراجة الحرارية فقط بعد أن يصل جهاز التدوير الحراري إلى 20 درجة مئوية.
  6. قم بإجراء دوران سريع عند 100 × جم لجمع كل السائل من جانبي الأنبوب ، وأضف 3 ميكرولتر من إنزيم استئصال Uracil ، واحتضن الأنابيب في جهاز التدوير الحراري عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع ضبط الغطاء الساخن على ≥47 درجة مئوية.
    ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة. تخزين العينات عند -20 درجة مئوية أو المتابعة مباشرة إلى الخطوة 11.7. إذا استمر مباشرة إلى الخطوة 11.7 ، فقم باحتضان حبات تنقية الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  7. أضف 154.4 ميكرولتر (~ 1.6x حجم العينة) من حبات تنقية الحمض النووي إلى تفاعل ربط المحول من الخطوة 11.6. تخلط الماصة وتحضن العينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي وبمجرد إزالة الملاط ، قم بإزالة الملاط بعناية وتخلص منه باستخدام ماصة.
  9. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج في درجة حرارة الغرفة بنسبة 80٪ إلى الأنابيب واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. قم بإزالة والتخلص بعناية من supernatant باستخدام ماصة وكرر هذه الخطوة لما مجموعه غسلتين مع 80٪ من الإيثانول.
  10. تدور الأنابيب لفترة وجيزة عند 100 × جم. ضع الأنابيب مرة أخرى على الرف المغناطيسي وقم بإزالة أي إيثانول متبقي باستخدام ماصة. جفف الخرز بالهواء لمدة 5 دقائق بينما تبقى الأنابيب على الرف المغناطيسي مع فتح الغطاء.
    ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق من وقت التجفيف لأن هذا يمكن أن يقلل بشكل كبير من إنتاج الحمض النووي النهائي.
  11. قم بإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي وقم بإزالة الحمض النووي من الخرز بإضافة 17 ميكرولتر من 0.1x TE عند الرقم الهيدروجيني 8. تخلط جيدا وتحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  12. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي حتى يصبح الملاط واضحا. بمجرد إزالة الملاط ، انقل بعناية 15 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب PCR معقم سعة 0.2 مل.
  13. اصنع مزيجا رئيسيا من 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لبوليميراز الحمض النووي و 5 ميكرولتر من التمهيدي العالمي لتضخيم المكتبة الأمامية (10 ميكرومتر) لكل عينة.
    ملاحظة: قم بإعداد عينة إضافية واحدة من المزيج الرئيسي لحساب خسائر السحب.
  14. أضف 30 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى 15 ميكرولتر من عينة الحمض النووي المربوطة بالمحول. أضف 5 ميكرولتر من التمهيدي لتضخيم المكتبة المفهرس بشكل فريد (10 ميكرومتر) إلى كل عينة ليصل الحجم النهائي إلى ما مجموعه 50 ميكرولتر. قم بتنفيذ شروط ركوب الدراجات PCR في الجدول 9.
    ملاحظة: احتضن حبات تنقية الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  15. دوامة حبات تنقية الحمض النووي لإنعاشها. أضف 35 ميكرولتر (~ 0.7x حجم العينة) من الخرز المعاد تعليقه إلى عينات الحمض النووي المضخمة بتفاعل البوليميراز المتسلسل. اخلطي العينات واحتضنيها على المغذيات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  16. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي وبمجرد أن يصبح الملاط واضحا ، انقل الملاط الذي يحتوي على الحمض النووي إلى أنبوب شريط PCR جديد سعة 0.2 مل 8 آبار.
  17. أضف 119 ميكرولتر (~ 1.4x حجم العينة) من الخرز إلى العينة ، واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات. احتضان العينات على المغذيات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  18. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي وبمجرد إزالة الملاط ، قم بإزالة الملاط بعناية وتخلص منه باستخدام ماصة.
  19. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج في درجة حرارة الغرفة بنسبة 80٪ إلى الأنابيب واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. قم بإزالة والتخلص بعناية من supernatant باستخدام ماصة ؛ كرر الخطوة لما مجموعه غسلتين مع 80 ٪ من الإيثانول.
  20. تدور الأنابيب لفترة وجيزة عند 100 × جم. ضع الأنابيب مرة أخرى على الرف المغناطيسي وقم بإزالة أي إيثانول متبقي باستخدام ماصة. جفف الخرز في الهواء لمدة 5 دقائق بينما تبقى الأنابيب على الرف المغناطيسي مع فتح الغطاء.
    ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق من وقت التجفيف لأن هذا يمكن أن يقلل بشكل كبير من إنتاج الحمض النووي النهائي.
  21. قم بإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي وقم بإزالة الحمض النووي من الخرز عن طريق إضافة 14 ميكرولتر من 0.1x TE عند الرقم الهيدروجيني 8. تخلط جيدا وتحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  22. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي حتى يصبح الملاط واضحا. بمجرد إزالة الملاط ، انقل بعناية 13 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب PCR معقم سعة 0.2 مل.
  23. قم بإعداد 1x Tris-borate-EDTA (TBE) الطازج وأدخل جل TBE الأكريلاميد التجاري الجاهز بنسبة 10٪ في جهاز الرحلان الكهربائي الهلامي المملوء ب 1x TBE.
  24. في البئر الأول ، أضف 2 ميكرولتر من سلم الحمض النووي منخفض المدى. امزج 3 ميكرولتر من صبغة تحميل 6x مع 13 ميكرولتر من العينة التي تم جمعها مسبقا من الخطوة 11.22. أضف بعناية 15 ميكرولتر في كل بئر من الجل. قم بتشغيل الجل لمدة 90 دقيقة عند 70 فولت.
    ملاحظة: يوصى بترك بئر واحد في الجل فارغا بين كل عينة، لأن هذا يقلل من احتمال تلوث العينة. قد يجد المستخدمون ذوو الخبرة أنه من المناسب استخدام جميع الآبار مع تجنب التلوث المتبادل بعناية ، خاصة عند معالجة عدد كبير من العينات.
  25. قم بإزالة الجل المصبوب من صندوق الجل. افتح الجل المصبوب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وقم بإزالة الجل بلطف من قالب الجل ، وضعه داخل صينية حمل الجل التي تحتوي على 100 مل من 1x TBE.
    ملاحظة: تأكد من إزالة الجل بلطف من الجل المصبوب لتجنب تمزيق الجل لأنه رقيق وهش. من الأهمية بمكان ارتداء القفازات والجل مع 1x TBE عند التعامل مع الجل. يجب أن تكون صينية حمل الجل أكبر قليلا من حجم الجل (حوالي 0.5 بوصة على كل جانب). الأغطية البلاستيكية المزودة بصناديق تخزين بأنبوب PCR بسعة 96 بئرا هي صواني احتجاز مريحة لأحجام الجل الصغيرة القياسية.
  26. أضف 10 ميكرولتر من بقعة هلام الحمض النووي إلى الدرج وقم بتدويرها بلطف. يغطى بورق القصدير للحماية من الضوء ويحضن بشكل ثابت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  27. شطف الجل مرتين مع 100 مل من ماء الصنبور منزوع الأيونات. صور الجل تحت إضاءة الضوء الأزرق باستخدام غطاء مرشح كهرماني (الشكل 2).
    ملاحظة: تظهر المكتبات الناجحة تشويها يتراوح بين 100 و500 نقطة أساس. سيكون هناك أيضا شريط dimer محول بارز ~ 125. وجود محولات dimers ليس مؤشرا على جودة المكتبة الرديئة. هذا المقدار من dimers المحول لا مفر منه لتجارب CUT & RUN التي أجريت على TFs منخفضة الوفرة وهو نتيجة لانخفاض كمية مواد الإدخال المستخدمة لإعداد هذه المكتبات. لا تستخدم الأشعة فوق البنفسجية ، والتي يمكن أن تلحق الضرر بالحمض النووي.
  28. كما هو موضح في الشكل 2 ، لكل مكتبة ، قم بقطع الجل أعلى قليلا من نطاق dimer المحول البارز ~ 125 نقطة أساس (مع التأكد من تجنب لمس نطاق dimer للمحول) وأسفل علامة السلم 400 bp.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان تجنب نطاق dimer المحول ~ 125. حتى الكميات الصغيرة من محولات المحولات ستقلل بشكل كبير من جودة المكتبة.
  29. ثقب الجزء السفلي من أنبوب 0.65 مل باستخدام إبرة 22 غرام ووضع الأنبوب المثقوب داخل أنبوب microfuge معقم 2 مل. انقل شريحة الجل إلى الأنبوب المثقوب داخل أنبوب microfuge سعة 2 مل.
  30. جهاز طرد مركزي لأنبوب الطرد الدقيق سعة 2 مل الذي يحتوي على الأنبوب المثقوب بسعة 0.65 مل والعينة عند 10000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين لجمع الطين الهلامي داخل أنبوب الطرد الدقيق سعة 2 مل.
    ملاحظة: يجب أن يكون الأنبوب المثقوب فارغا الآن ويمكن التخلص منه. إذا كان الأنبوب المثقوب لا يزال يحتوي على أي هلام متبقي في الداخل ، فضع الأنبوب المثقوب مرة أخرى داخل أنبوب microfuge سعة 2 مل وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 10000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إضافيتين.
  31. إلى ملاط الجل داخل أنبوب microfuge سعة 2 مل ، أضف 300 ميكرولتر من جل الجليد البارد Buffer واخلطه على مكسرات في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 3 ساعات أو بين عشية وضحاها (12-16 ساعة).
  32. انقل كل الملاط السائل والهلام إلى عمود مرشح 0.22 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي عند 10000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة ؛ يجب أن يكون الحجم الذي تم جمعه ~ 300 ميكرولتر.
  33. أضف 450 ميكرولتر (~ 1.5x حجم العينة) من حبات تنقية الحمض النووي ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على المغذات ، ثم ضع العينة على الرف المغناطيسي حتى يصبح الملاط واضحا.
    ملاحظة: احتضن حبات تنقية الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
  34. قم بإزالة وتجاهل 500 ميكرولتر من supernatant ، مع التأكد من عدم تعطيل الخرز.
  35. قم بإزالة العينة من الرف المغناطيسي واخلط الخرز عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات. انقل 200 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب شريط PCR جديد.
  36. ضع أنبوب الشريط على الرف المغناطيسي ، وبمجرد إزالة الملاط ، قم بإزالة الملاط بعناية وتخلص منه باستخدام ماصة.
  37. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج في درجة حرارة الغرفة بنسبة 80٪ إلى الأنابيب واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. قم بإزالة والتخلص بعناية من supernatant باستخدام ماصة ؛ كرر هذه الخطوة لما مجموعه غسلتين مع 80 ٪ من الإيثانول.
  38. تدور الأنابيب لفترة وجيزة عند 100 × جم. ضع الأنابيب مرة أخرى على الرف المغناطيسي وقم بإزالة أي إيثانول متبقي باستخدام ماصة. جفف الخرز في الهواء لمدة تصل إلى 5 دقائق بينما تبقى الأنابيب على الرف المغناطيسي مع فتح الغطاء.
    ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق من وقت التجفيف لأن هذا يمكن أن يقلل بشكل كبير من إنتاج الحمض النووي النهائي.
  39. قم بإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي وقم بإزالة الحمض النووي من الخرز بإضافة 17 ميكرولتر من 0.1x TE عند الرقم الهيدروجيني 8. تخلط جيدا وتحضن الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  40. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي حتى يصبح الملاط واضحا. بمجرد إزالة الملاط ، انقل بعناية 15 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب PCR معقم سعة 0.2 مل.
  41. قياس كمية المكتبة النهائية باستخدام مقياس الفلورومتر. استخدم هذه المكتبة النهائية للتسلسل.
    ملاحظة: يمكن تجميع ما يصل إلى 48 مكتبة وتسلسلها معا في مسار واحد باستخدام منصة تسلسل توفر ما لا يقل عن 300 مليون نقطة أساس 40 نقطة أساس أو قراءات مقترنة أطول.

12. تحليل تسلسل القطع والتشغيل

ملاحظة: يعرض هذا القسم البروتوكول الحسابي المستخدم لتحليل بيانات تسلسل CUT & RUN. يبدأ البروتوكول بإعداد البيئة الافتراضية الحسابية ويوجه المستخدمين خلال تنفيذ الأوامر على أجهزتهم المحلية. سيعمل هذا البروتوكول على جميع الموارد الحسابية ، مثل الأجهزة المحلية والخوادم السحابية الافتراضية ومجموعات الحوسبة عالية الأداء. يمكن الوصول إلى جميع بيانات CUT & RUN المقدمة في هذه الورقة في NCBI GEO تحت رقم الانضمام GSE193803.

  1. قم بتنزيل الشفرة المصدرية لتحليل CUT & RUN من https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
    ملاحظة: سيعمل سير العمل بشكل أفضل على نظام التشغيل MacOS أو Linux. يمكن لمستخدمي Windows تشغيل سير العمل باستخدام GitBash (راجع جدول المواد).
    1. قم بتنزيل الرمز مباشرة من صفحة GitHub بالنقر فوق الزر "الرمز الأخضر" | قم بتنزيل خيار ZIP . قم بفك ضغط المجلد إلى موقع ذي صلة على الجهاز المحلي.
  2. قم بتثبيت بيئة Conda (انظر جدول المواد) وقم بتشغيلها مرة واحدة فقط.
    ملاحظة: يستخدم سير العمل هذا بيئة أداة سطر الأوامر Conda لتثبيت كافة البرامج والأدوات المطلوبة.
  3. بمجرد تثبيت Conda (تشغيل مرة واحدة فقط)، قم بإنشاء بيئة ظاهرية باستخدام الملف التكميلي 2 المزود بالأمر التالي:
    conda إنشاء --name --ملف Supplementary_File_2.txt
  4. قم بتنشيط البيئة الافتراضية في كل مرة يتم فيها تنفيذ سير العمل هذا باستخدام:
    كوندا تنشيط
  5. قم بتنظيم ملفات FASTQ الخام للإدخال في مجلد واحد ، من الناحية المثالية مجلد واحد لكل تجربة CUT & RUN.

13. توليد ملف الجينوم للمحاذاة

  1. قم بإنشاء ملف الجينوم للمحاذاة (قم بتشغيل مرة واحدة فقط لكل ملف جينوم). قم بإنشاء مجلد لحفظ جميع ملفات جينوم C. albicans ، مثل:
    ca_genome_files مكدير

14. تحميل C. ألبيكان الجينوم التجمع 21

  1. قم بتنزيل تجميع جينوم C. albicans 21 من قاعدة بيانات Candida Genome باستخدام أدوات wget أو curl (انظر جدول المواد)18.
    ملاحظة: تم استخدام تجميع C. albicans 21 هنا لمقارنة نتائج CUT & RUN مع نتائج ChIP-chip المنشورة سابقا ، والتي تمت محاذاتها مع التجميع 21. يمكن للمستخدمين تنزيل إصدارات التجميع الأخرى وتشغيل أوامر مماثلة لإنشاء ملفات الجينوم ذات الصلة لاحتياجات المحاذاة الخاصة بهم.

15. إنشاء قاعدة بيانات فهرس Bowtie 2 (اسم قاعدة البيانات: ca21)

  1. استخدم ما يلي:
    القوس 2-بناء C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
    القوس 2-فحص -s ca21

16. قم بتشغيل خط أنابيب تحليل CUT & RUN

  1. اقرأ قسم المساعدة للتعرف على معلمات خط الأنابيب.
    باش cut_n_run_pipeline.sh -h

17. تنفيذ ملف cut_n_run_pipeline.sh مع المعلمات ذات الصلة

  1. تنفيذ البرنامج النصي:
    باش cut_n_run_pipeline.sh /مسار/إلى/إدخال/مجلد 4 ذ ذ ص ص ص ص >/مسار/إلى/إخراج.log 2>&1
    ملاحظة: يتم وصف المعلمات ذات الصلة مع أوصاف مفصلة على الأسطر 19-36 من التعليمات البرمجية على صفحة GitHub https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. تنظيم ملفات الإخراج

  1. دمج القمم الهامة من جميع النسخ المتماثلة التي تسميها MACS2 الموجودة في /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 باستخدام وظيفة دمج BedTools19.
    القط / المسار / إلى / الإدخال / المجلد / ذروة الاتصال / ماك 2 / all_replicate_files فرز -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o الأخير,يعني,الأول,يعني,يعني,المتوسط,متوسط >/مسار/إلى/merged_output.bed
    ملاحظة: للحصول على معلومات إضافية وأفضل الممارسات بشأن تقييم القمم المتداخلة في العينات المكررة، يرجى الرجوع إلى Landt et al.20 و Boyd et al.21.

19. إزالة التطابقات مع المناطق الجينومية المدرجة في القائمة باستخدام وظيفة طرح BedTools

  1. استخدم ما يلي: طرح السرير -a /path/to/merged_output.bed -b/path/to/ Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
    ملاحظة: يتم توفير المناطق المدرجة في القائمة في جينوم C. albicans كملف .bed في الملف التكميلي 3. تتكون القائمة في المقام الأول من عناصر تسلسل ومناطق متكررة للغاية مثل تكرار التيلوميريك و centromeres التي عادة ما تسفر عن نتائج إيجابية كاذبة في مجموعات بيانات C. albicans CUT & RUN و ChIP-seq و ChIP-chip. وبالتالي ، يوصى بإزالة المناطق المدرجة في القائمة المحظورة. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض أهداف البروتين ، قد يكون من غير المناسب أو غير المرغوب فيه استبعاد هذه المواقع. يمكن للمستخدمين تخطي هذه الخطوة للاحتفاظ بالإشارات الموجودة داخل هذه المناطق المدرجة في القائمة المحظورة أو إنشاء مناطق مدرجة في قائمة الحظر الخاصة بهم.

20. دمج ملفات BigWig من النسخ المتماثلة باستخدام وظيفة UCSC bigWigMerge22

  1. استخدم ما يلي: bigWigMerge / path / to / input / folder / bigwig / all_final_bw_files / path / to / input / folder / bigwig / all_final_bdg_file
  2. قم بتحويل إخراج BedGraph من bigWigMerge إلى BigWig باستخدام وظيفة UCSC bedGraphToBigWig.
    bedGraphToBigWig / مسار / إلى / إدخال / مجلد / bigwig / all_final_bdg_file / مسار / إلى / إدخال / مجلد / bigwig / all_final_bw_file

النتائج

تم تكييف بروتوكول CUT & RUN القوي هذا وتحسينه للتحقيق في توطين على مستوى الجينوم ل TFs محددة في الأغشية الحيوية C. albicans وثقافات العوالق (انظر الشكل 2 للحصول على نظرة عامة على النهج التجريبي). كما يتم تضمين خط أنابيب شامل لتحليل البيانات لتسهيل تحليل بيانات تسلسل CUT & RUN الناتجة...

Discussion

يقدم هذا البروتوكول خط أنابيب تجريبي وحسابي شامل لتوطين TFs التنظيمية على نطاق الجينوم في C. albicans. وهي مصممة لتكون في متناول أي شخص لديه تدريب قياسي في علم الأحياء الدقيقة والبيولوجيا الجزيئية. من خلال الاستفادة من النطاق الديناميكي العالي ومتطلبات إدخال العينات المنخفضة لفحص CUT & RUN وت?...

Disclosures

كلاريسا ج. نوبيل هي أحد مؤسسي شركة BioSynesis، Inc. ، وهي شركة تطور التشخيص والعلاجات لعدوى الأغشية الحيوية.

Acknowledgements

نشكر جميع الأعضاء السابقين والحاليين في مختبري نوبيل وهيرنداي على تعليقاتهم على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIGMS) رقم R35GM124594 ومن قبل عائلة Kamangar في شكل كرسي موهوب ل C.J.N. تم دعم هذا العمل أيضا من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) رقم الجائزة R15AI137975 إلى A.D.H.C.L.E. بدعم من المعهد الوطني لبحوث الأسنان والوجه والمعاهد الوطنية للصحة (NIDCR) رقم الزمالة F31DE028488. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل وجهات نظر الممولين. ولم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة؛ في جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها؛ في كتابة المخطوطة ؛ أو في قرار نشر النتائج.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm filterMillipore SigmaSLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubesVWR490003-190
1 M CaCl2Fisher Scientific50-152-341
1 M PIPESFisher ScientificAAJ61224AK
12-well untreated cell culture platesCorning351143
2-mercaptoethanolSigma-Aldrich60-24-2
2% DigitoninFisher ScientificCHR103MI
50 mL conical tubesVWR89039-658
5x phusion HF bufferFisher ScientificF530SItem part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
AgarCriterionC5001
Agencourt AMPure XP magnetic beadsBeckman CoulterA63880
Agilent BioanalyzerAgilentG2939BAReferred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport ScientificVWR89133-910
Bacto peptoneBD Biosciences211677
Benchling primer design toolBenchlinghttps://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
BetaineFisher ScientificAAJ77507AB
Calcofluor white stainSigma-Aldrich18909-100ML-F
Candida Genome Databasehttp://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beadsPolysciences 86057-3
Conda softwarehttps://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl toolhttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kitEpicypher14-1048Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)New England BiolabsN0447S
Dextrose (D-glucose)Fisher ScientificD163
Difco D-mannitol BD Biosciences217020
Disposable cuvettesFisher Scientific14-955-127
Disposable transfer pipetsFisher Scientific13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)Fisher ScientificR0611
DreamTaq green DNA polymeraseFisher ScientificEP0713Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase bufferFisher ScientificEP0713Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNAEpicypher18-1401
ELMI Microplate incubatorELMITRMS-04Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction BufferItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proofVWR89125-170
FastDigest MssIFisher ScientificFD1344Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI BufferFisher ScientificFD1344Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400Fisher BioReagentsBP525-25
Fluorescence microscopeUser-dependent
Gel electrophoresis apparatusUser-dependent
GeneRuler low range DNA ladderFisher ScientificFERSM1192
GitBash workflowhttps://gitforwindows.org/
GitHub source codehttps://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5Boston BioProductsBBH-75-K
High-speed centrifugeUser-dependent
IsopropanolSigma-AldrichPX1830-4
Lens paperVWR52846-001
Ligation EnhancerItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrateMP Biomedicals215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibodyTakara632592User-dependent
MACS2https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubesEpicypher10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubesFisher ScientificMR02
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometerBioTekEPOCH2TCReferred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiViewhttp://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPSSigma-AldrichM3183
NaClVWR470302-522
NaOHFisher ScientificS318-500
NCBI GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kitNew England BiolabsE7645SReferred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)GoldbioN-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 wellFisher ScientificEC62755BOX
Nutating mixerVWR82007-202
Nutrient brothCriterionC6471
pADH110Addgene90982Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119Addgene90985Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137Addgene90986Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139Addgene90987Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140Addgene90988Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNaseEpicypher15-1016 or 15-111650 rxn or 250 rxn
pCE1Addgene174434Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lidFisher ScientificFB0875712
Phusion high fidelity DNA polymeraseFisher ScientificF530SReferred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350VWR10791-816
Potassium phosphate monobasicFisher ScientificP285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kitInvitrogenQ33230
Qubit fluorometerLife TechnologiesQ33216Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibodyEpicypher13-0042
RNase ASigma-Aldrich10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tabletsSigma-Aldrich5056489001
RPMI-1640Sigma-AldrichR6504
Shaking incubatorEppendorfM12820004User-dependent
SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
Spin-X centrifuge tube filtersFisher Scientific07-200-385
Sterile inoculating loopsVWR30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stainFisher ScientificS11494
SYTO 13 nucleic acid stainFisher ScientificS7575Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
ThermocyclerUser-dependent
ThermoMixer CEppendorf5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethaneSigma-Aldrich252859-100G
Ultra II Ligation Master MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solutionInvitrogen15632011
USER EnzymeItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixerVWR10153-834
wget toolhttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Yeast extractCriterionC7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)Fisher ScientificNC0439194

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
  3. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
  4. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
  5. Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
  6. Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
  7. Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
  8. Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
  9. Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
  10. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
  11. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
  12. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  13. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
  14. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  15. Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
  16. Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
  17. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
  18. Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  21. Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
  22. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  23. Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
  24. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  25. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  26. Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
  27. Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
  28. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182 CUT RUN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved