Perfil em todo o genoma das interações de vinculação fator de transcrição-DNA em albicanos candida: um método abrangente CUT&RUN e fluxo de trabalho de análise de dados

Resumo

Este protocolo descreve um método experimental e um fluxo de trabalho de análise de dados para decote sob metas e liberação usando nuclease (CUT&RUN) no patógeno fúngico humano Candida albicans.

Resumo

Os fatores de transcrição regulatória controlam muitos processos biológicos importantes, incluindo diferenciação celular, respostas a perturbações e tensões ambientais e interações hospedeiro-patógeno. Determinar a vinculação em todo o genoma dos fatores de transcrição regulatória ao DNA é essencial para entender a função dos fatores de transcrição nesses processos biológicos muitas vezes complexos. O decote sob metas e liberação usando nuclease (CUT&RUN) é um método moderno para mapeamento em todo o genoma de interações de ligação proteína-DNA in vivo que é uma alternativa atraente para a imunoprecipitação de cromatina tradicional e amplamente utilizada seguida pelo método de sequenciamento (ChIP-seq). A CUT&RUN é agradável para uma configuração experimental de maior rendimento e tem um alcance dinâmico substancialmente maior com custos de sequenciamento por amostra mais baixos do que o ChIP-seq. Aqui, um protocolo abrangente da CUT&RUN e um fluxo de trabalho de análise de dados adaptado para análise em todo o genoma das interações de vinculação fator-DNA no patógeno fúngico humano Candida albicans são descritos . Este protocolo detalhado inclui todos os procedimentos experimentais necessários, desde a marcação de epítope de genes de codificação de fatores de transcrição até a preparação da biblioteca para sequenciamento; além disso, inclui um fluxo de trabalho computacional personalizado para análise de dados CUT&RUN.

Introdução

Candida albicans é um patógeno fúngico humano polimórfico clinicamente relevante que existe em uma variedade de diferentes modos de crescimento, como o modo de crescimento planctônico (livre flutuante) e como comunidades de células fortemente aderidas protegidas por uma matriz extracelular, conhecida como o modo de crescimento biofilm ^1,2,3. Semelhante a outros processos de desenvolvimento e celulares, o desenvolvimento de biofilmes é um importante traço de virulência de C. albicans que é conhecido por ser controlado no nível transcricional por fatores de transcrição regulatória (TFs) que se ligam ao DNA de forma específica de sequência⁴. Recentemente, reguladores de cromatina e modificadores de histonas também surgiram como importantes reguladores da formação de biofilme C. albicans ⁵ e morfogênese⁶ mediando a acessibilidade do DNA. Para entender a biologia complexa deste importante patógeno fúngico, métodos eficazes para determinar a localização em todo o genoma de TFs específicos durante processos distintos de desenvolvimento e celular são valiosos.

A imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento (ChIP-seq) é um método amplamente utilizado para investigar interações proteína-DNA em C. albicans ^5,6 e substituiu em grande parte a imunoprecipitação de cromatina mais clássica seguida pelo método de microarray (ChIP-chip)⁹. Tanto os métodos chip-seq quanto chip-chip, no entanto, requerem um grande número de células de entrada¹⁰, o que pode ser um fator complicador ao investigar TFs no contexto de amostras específicas e modos de crescimento, como biofilmagens coletadas de pacientes ou modelos animais de infecção. Além disso, o ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) muitas vezes produz uma quantidade significativa de sinal de fundo em todo o genoma, exigindo um alto nível de enriquecimento para o alvo de interesse para separar suficientemente o sinal do ruído. Embora o ensaio do chip ChIP esteja em grande parte desatualizado hoje, as profundidades de sequenciamento necessárias para o ChIP-seq tornam este ensaio proibitivamente caro para muitos pesquisadores, particularmente aqueles que estudam múltiplos TFs e/ou proteínas associadas à cromatina.

O decote sob metas e liberação usando nuclease (CUT&RUN) é uma alternativa atraente ao ChIP-seq. Foi desenvolvido pelo laboratório Henikoff em 2017 para contornar as limitações do decote endógeno chip-seq e cromatina seguido pelo sequenciamento ChEC-seq^11,12, outro método para identificar interações proteína-DNA em um nível genoma-em todo o genoma, ao mesmo tempo em que fornece mapeamento de alta resolução, genoma-em toda a proteína¹³ . A CUT&RUN conta com a digestão direcionada da cromatina dentro de núcleos permeabilizados usando nucleases microcóccal amarradas, seguida pelo sequenciamento dos fragmentos de DNA digeridos ^9,10. Como fragmentos de DNA são especificamente gerados no loci que são vinculados por uma proteína de interesse, em vez de serem gerados em todo o genoma através de fragmentação aleatória como nos ensaios chip, a abordagem CUT&RUN resulta em sinais de fundo muito reduzidos e, portanto, requer 1/^{10 da} profundidade de sequenciamento em comparação com ChIP-seq^{11,13, 14 anos}. Essas melhorias, em última análise, levam a reduções significativas nos custos de sequenciamento e reduções no número total de células de entrada necessárias como material inicial para cada amostra.

Aqui, é descrito um robusto protocolo CUT&RUN que foi adaptado e otimizado para determinar a localização em todo o genoma de TFs em células de C. albicans isoladas de biofilmes e culturas planctônicas. Também é apresentado um pipeline de análise de dados minucioso, que permite o processamento e análise dos dados de sequência resultantes e exige que os usuários tenham experiência mínima em codificação ou bioinformática. Resumidamente, este protocolo descreve a marcação de epítopes de genes codificadores de TF, colheita de biofilme e células planctônicas, isolamento de núcleos permeabilizados intactos, incubação com anticorpos primários contra a proteína específica ou proteína marcada por epítope de interesse, amarração das proteínas de fusão quimrica A/G-microcóccal (pAG-MNase) para os anticorpos primários, recuperação genômica do DNA após digestão da cromatina e preparação de bibliotecas genômicas de DNA para sequenciamento.

O protocolo EXPERIMENTAL CUT&RUN é seguido por um pipeline de análise de dados construído com propósito, que leva leituras brutas de sequenciamento de DNA no formato FASTQ e implementa todas as etapas de processamento necessárias para fornecer uma lista completa de loci significativamente enriquecido vinculado pelo TF de interesse (direcionado pelo anticorpo primário). Observe que várias etapas do protocolo de preparação da biblioteca descrito foram especificamente adaptadas e otimizadas para análise de CUT&RUN de TFs (em oposição aos nucleosmos). Embora os dados apresentados neste manuscrito tenham sido gerados usando adaptações específicas de TF de um kit comercial CUT&RUN, esses protocolos também foram validados usando componentes de origem individual (ou seja, enzima pAG-MNase e contas de purificação de DNA magnético) e tampões de purificação de DNA em casa, o que pode reduzir significativamente o custo experimental. Os protocolos abrangentes de análise experimental e de dados são descritos em detalhes abaixo em um formato passo a passo. Todos os reagentes e equipamentos críticos, bem como receitas tampão e mídia, estão listados na Tabela de Materiais e Arquivo Suplementar 1, respectivamente.

Protocolo

1. Marcação de epítope de cepas de C. albicans

1. Carregue o gene de interesse, juntamente com suas sequências de flanco upstream e downstream de 1 kb, desde o Banco de Dados do Genoma candida até a ferramenta de design de primer (veja a Tabela de Materiais). Projete um RNA guia (gRNA) destacando 50 bp upstream e downstream do codon stop, e clique na ferramenta de seleção gRNA à direita. Selecione Guias de design e análise. Use o genoma Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) e um motivo adjacente protoespaçor NGG (SpCas9, 3' side) para os parâmetros guia e clique em Acabamento. A Figura 1 descreve o fluxo de trabalho para a marcação de um gene C. albicans de interesse com proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP).
   1. Na página subsequente, confirme a região alvo para o design gRNA e pressione o botão verde. Classifique gRNAs pela pontuação no alvo.
      NOTA: A ferramenta de design primer calcula pontuações no alvo e fora do alvo para quantificar a especificidade dos gRNAs. Um guia ideal tem uma pontuação no alvo de >60, uma pontuação fora do alvo de ~33, e se sobrepõe ao codon stop. Isso permite alta especificidade de gRNA ao mesmo tempo em que ablação do alvo gRNA após a integração do GFP. Um gRNA com uma pontuação fora do alvo de ~50 indica variação alicólica; assim, apenas um alelo será reconhecido pelo gRNA.
   2. Adicione as sequências (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') e (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') às extremidades de 5' e 3', respectivamente, da sequência de alvos gRNA de 20 bp, criando um primer/oligonucleotídeo de 60 bp. Alternativamente, copie a sequência de 20 bps para a calculadora gRNA fornecida por Nguyen et ^al.15. Peça oligonucleotídeo de gRNA personalizado de 60 bps.
   3. Amplie o "fragmento A universal" com 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAAACCGCC-3') e 100 mM AHO1098 (35'-CAAATTAAAAAATAGTTTACGCAAG-3') e o "fragmento B único" com o oligonucleotídeo de gRNA personalizado de 60 bp (100 mM) a partir da etapa 1.1.2. e 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGTTTATTTAAACACCG-3') usando pADH110 (repositório plasmídeo ID nº 90982) e pADH139 (repositório plasmid ID# 90987), respectivamente, como DNA de modelo. Utilize a reação pcr e as condições de ciclismo fornecidas na Tabela 1.
      NOTA: pADH139 é específico para cepas que carregam o heterologous Marcador Candida maltosa LEU2 . Se usar uma cepa com uma única cópia do gene C. albicans LEU2 , substitua pADH119 (repositório plasmid ID# 90985) no lugar de pADH139.
   4. Confirme a amplificação bem sucedida verificando 5 μL do PCR em um gel de 1% de agarose. Procure por amplificadores de fragmentos A e B de ~1 kb.
   5. Misture 1 μL cada um dos fragmentos A e B e costure-os juntos usando a reação pcr e as condições de ciclismo fornecidas na Tabela 2 para criar um fragmento C de comprimento completo.
   6. Adicione 0,5 μL de 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAGAAG-3') e 0,5 μL de 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAACAGCTTCGACAATCG-3') a cada reação do PCR, misturar bem por pipetação, e completar as condições de ciclismo listadas na Tabela 3.
      NOTA: Se utilizar pADH119 no lugar de pADH139, substitua AHO1238 (5'-TGTATTTTTTTTAAAATTTTAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') no lugar de AHO1453.
   7. Confirme a costura e a amplificação adequadas do fragmento C verificando 5 μL do PCR em um gel de 1% de agarose. Procure por um amplificador de ~2 kb. Armazene o fragmento C a -20 °C até estar pronto para uso.
      NOTA: Se a costura e a amplificação resultarem em múltiplas bandas ou manchas inespecíficas, realize uma limpeza PCR dos fragmentos A e B e repita a partir da etapa 1.1.5.
2. Adicione todo o eGFP monomédico otimizado para CTG com a sequência de linker (RIPLING)¹⁶ (pCE1, repositório plasmid ID# 174434) imediatamente a montante do codon stop do gene de interesse usando a ferramenta de design primer, criando uma fusão translacional terminal C. Use este construto para projetar oligonucleotídeos para amplificar o DNA do doador (dDNA) a partir de pCE1.
   1. Projete um oligonucleotídeo avançado com 18-22 bp de esmologia para a sequência de linker e >50 bp homologia até a extremidade 3' do quadro de leitura aberto (ORF).
      NOTA: A homologia de 18-22 bp cria uma temperatura de ressarção para amplificação entre 55 °C e 58 °C. Se o oligonucleotídeo de comprimento completo formar dimers primer, ajuste a homologia à sequência de linker/GFP ou ao genoma em conformidade.
   2. Crie um oligonucleotídeo reverso com 18-22 bp de escoologia até o final de 3' do GFP e >50 bp homologia para a sequência de não codificação a jusante do ORF a ser marcada.
   3. Ordene esses oligonucleotídeos e amplie o dDNA usando as condições de ciclismo PCR de touchdown fornecidas na Tabela 4.
3. Projete dois conjuntos de oligonucleotídeos de COLÔNIA PCR (cPCR) para confirmar a integração do GFP ampliando os locais de integração de flancos. Primeiro, selecione o oligonucleotídeo dDNA dianteiro usando a ferramenta de design primer e clique no botão Primer à direita.
   1. Clique em Criar primers | | mago Tm Param e confirmar que o algoritmo está definido para SantaLucia 1998. Clique em Usar seleção para inserir as coordenadas do oligonucleotídeo dianteiro projetado em 1.2.1 como a sequência de destino.
   2. Ajuste a temperatura ideal do primer para 55 °C e o tamanho máximo de amplicon para 900 bp e clique no botão Gerar Primers no canto superior direito.
   3. Selecione o par de oligonucleotídeos com a pontuação de penalidade mais baixa e confirme que os primers amplificam através do site de integração de 5'. Certifique-se de que o primer cPCR dianteiro esteja a montante da sequência de primer dDNA para a frente e do primer cPCR reverso totalmente dentro da tag eGFP ou da sequência de linker.
   4. Repetir as etapas 1.3-1.3.3. com o oligonucleotídeo dDNA reverso para criar o segundo conjunto de oligonucleotídeos cPCR que amplificam através do site de integração de 3'. Certifique-se de que o primer cPCR dianteiro esteja inteiramente dentro da tag eGFP ou da sequência de linker e da primer cPCR reversa a jusante da sequência de primer dDNA reversa.
   5. Ordene esses oligonucleotídeos.
4. Digeste 2.500 ng de pADH140, que contém Cas9 (repositório plasmídeo ID# 90988), com enzima de restrição para que cada gene seja marcado por GFP. Definir o volume total de cada digestão em 15 μL; ajustar o volume de água de acordo com a concentração plasmida pADH140. Use as condições de digestão especificadas na Tabela 5. Armazene o plasmídeo digerido a -20 °C até estar pronto para uso.
   NOTA: Se transformar uma cepa com uma única cópia do gene C. albicans LEU2 , em vez do heterologous C. maltosa LEU2 marcador, substitua pADH137 (repositório plasmídeo ID nº 90986) no lugar do pADH140.
5. Denature 12 μL de 10 mg/mL de DNA de espermatozomêmio de salmão para cada gene que será marcado por GFP a 99 °C por 10 min e esfriar rapidamente para ≤4 °C. Armazene a -20 °C até ficar pronto para uso.
6. Listrar uma cepa c. albicans LEU2 hemizygous nourseothricin em placas de levedura peptone dextrose (YPD) e incubar a 30 °C por dois dias.
7. Selecione uma única colônia e transfira-a para 4 mL de YPD líquido. Incubar por 12-16 h a 30 °C com agitação a 250 rpm.
8. Meça a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) da cultura overnight (12-16 h) em um espectrofotômetro usando um cuvette descartável (1 mL, comprimento do caminho de 1 cm).
9. Diluir a cultura da noite para o dia em um frasco de Erlenmeyer para um OD₆₀₀ de 0,1 em YPD. Conta de 5 mL por reação e inclua um adicional de 5 mL para verificar o OD₆₀₀ depois.
   NOTA: O volume da cultura depende do número de reações de transformação.
10. Incubar a cultura diluída durante a noite em uma incubadora a 30 °C com agitação a 250 rpm até atingir um OD₆₀₀ de 0,5-0,8.
11. Centrifugar a 4.000 × g em temperatura ambiente por 5 min; remover e descartar o supernante.
12. Resuspenque a pelota celular em 1 mL de água estéril através da mistura suave de pipeta com pontas de filtro e transfira para um tubo de microfuça de 1,5 mL estéril.
13. Pelota as células por centrifugação a 4.000 × g à temperatura ambiente por 1 min; remover e descartar o supernante. Resuspenque em 1 mL de água estéril e repita para um total de duas lavagens.
14. Resuspense a pelota em 1/¹⁰⁰ do volume utilizado na etapa 1.10. Por exemplo, se 15 mL foi usado, resuspenque a pelota em 150 μL de água estéril.
15. Em um tubo separado para cada reação de transformação, misture 50 μL de fragmento C, 50 μL de dDNA, 2.500 ng de restrição enzimátrica pADH140, e 10 μL de DNA de esperma de salmão desnaturado.
16. Adicione 50 μL da pasta celular a partir da etapa 1.14 e misture por pipetação.
17. Faça um estoque da mistura de placas (Arquivo Suplementar 1) para n + 1 transformações.
18. Adicione 1 mL da mistura da placa à mistura celular/DNA e misture invertendo 5 vezes.
    NOTA: Toque nas partes inferiores dos tubos enquanto inverte para desalojar qualquer líquido restante.
19. Coloque a mistura em uma incubadora a 30 °C durante a noite (12-16 h) sem balançar.
20. Choque térmico das células por 15 min a 44 °C em um banho de água.
21. Centrifugar os tubos de microfuça de 1,5 mL a 5.000 × g em temperatura ambiente por 2 min.
22. Remova a mistura de PLACA por aspiração de vácuo usando pontas de pipeta estéreis, tomando cuidado para evitar perturbar a pelota celular.
23. Resuspenque a pelota celular em 1 mL de YPD, pelota por centrifugação a 4.000 × g em temperatura ambiente por 1 min, e remova e descarte o sobrenatante. Repita para uma segunda lavagem, ressuspenja a pelota celular em 1 mL de YPD e transfira a suspensão para um tubo de cultura descartável de 10 mL contendo um adicional de 1 mL de YPD (volume final de 2 mL). Recupere as células a 30 °C com agitação a 250 rpm por 5 h.
24. Centrifugar os tubos a 4.000 × g em temperatura ambiente por 5 minutos; remover e descartar o supernante.
25. Resuspenque a pelota celular em 100 μL de água estéril e placa em YPD suplementada com 200 μg/mL nourseothricin (NAT200). Incubar a 30 °C durante 2-3 dias.
26. Aliquot 100 μL de 20 mM NaOH nos poços de uma placa PCR de 96 poços, com cada poço correspondente a uma colônia individual que cresceu nas placas NAT200. Usando um palito estéril ou ponta de pipeta, escolha colônias transformadas individuais, remende-as em uma nova placa NAT200 e gire as células restantes em um poço com 20 mM NaOH. Repita para as colônias restantes criar o lysato celular usado como modelo de DNA para a reação do CPCR.
27. Sele a placa PCR e incuba por 10 min a 99 °C em um termociclador com tampa aquecida.
28. Configure duas reações de CPCR com os oligonucleotídeos projetados nas etapas 1.3-1.3.5. Aumente o número de reações conforme necessário. Realize a reação pcr com o lisecelular preparado na etapa 1.26 seguindo as condições de ciclismo e misturas de reação PCR da Tabela 6. Execute 10-20 μL de cada poço em um gel de 1% de agarose. Procure colônias com amplificação dos dois conjuntos de primer cPCR indicando dDNA GFP devidamente incorporada.
29. Colônias restreak que incorporaram GFP em mídia sintética completa (SC) sem leucina. Incubar em uma incubadora de 30 °C por 2-3 dias. Escolha colônias individuais e remendo em placas YPD e YPD complementadas com placas de nourseothricin de 400 μg/mL (NAT400). Identifique colônias que não conseguem crescer em placas NAT400 após 24 horas como aquelas que perderam com sucesso os componentes CRISPR.
30. Confirme se a tag GFP é mantida repetindo as etapas 1.25-1.28 usando células da placa de remendo YPD. Se as bandas corretas estiverem presentes, inocular em 4 mL de YPD e crescer durante a noite (12-16 h), conforme descrito na etapa 1.7.
31. Misture a cultura da noite para o dia da nova cepa marcada por GFP com 50% de glicerol esterilizado por filtro em uma proporção de 1:1 em um crioboto estéril. Armazene a -80 °C e reak em placas YPD conforme necessário.
    NOTA: Recomenda-se validar as cepas marcadas pelo GFP confirmando a localização nuclear do TF marcado via microscopia fluorescente e confirmando um fenótipo do tipo selvagem em um ensaio fenotípico apropriado.

2. Preparação amostral de culturas de biofilme

1. Cepa(s) com etiqueta GFP em placas de ágar YPD e incubar a 30 °C por 2-3 dias. Usando uma única colônia isolada da placa de ágar, inoculada em 4 mL de meio líquido YPD. Incubar a 30 °C com agitação durante a noite (12-16 h). Determine o OD₆₀₀ da cultura da noite para o dia.
   NOTA: Recomenda-se o uso de três réplicas biológicas por amostra para os experimentos CUT&RUN.
2. Inocular uma placa de cultura celular estéril de 12 poços não tratadas com a cultura da noite para o dia para um final OD₆₀₀ de 0,5 (equivalente a 2 × 10⁷ células/mL) no Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 médio a um volume final de 2 mL. Incubar por 90 min a 37 °C em uma incubadora de microplaca com agitação a 250 rpm.
   NOTA: Recomenda-se usar uma placa de cultura celular de 12 poços por cepa com um bem não vacinado como um controle de contaminação sozinho. Este protocolo foi aplicado com sucesso usando apenas 1/^{10 de} uma placa de cultura celular de 12 poços bem (ou apenas 5 milhões de células). O uso de um número maior de células aumenta o rendimento total do DNA, o que normalmente resulta em bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade.
3. Remova as células não anexadas por aspiração usando pontas de pipeta estéreis presas através de tubos de plástico flexíveis a um aparelho de armadilha de vácuo. Lave as células aderidas uma vez com 2 mL de soro fisiológico estéril 1x tamponado por fosfato (PBS). Adicione 2 mL de RPMI-1640 frescos médios aos poços e incubar por 24 h a 37 °C com agitação a 250 rpm.
   NOTA: Altere as pontas da pipeta entre poços de diferentes cepas e/ou condições. Não raspe a parte inferior do poço com a ponta enquanto aspira.
4. Ao final da incubação de 24 h, colete e acumule o material líquido e biofilme de cada um dos 11 poços inoculados em um único tubo cônico estéril de 50 mL. Repita conforme necessário com piscinas independentes se processar mais de uma condição de tensão ou crescimento simultaneamente.
   NOTA: Raspe as extremidades e bordas de cada poço com uma ponta de filtro de pipeta para desalojar células que permanecem aderidas à superfície. Use a pipeta para homogeneizar os biofilmes.
5. Amostras de pelotas por centrifugação a 4.000 × g em temperatura ambiente por 5 minutos. Decantece o máximo possível do supernante, tomando o cuidado de minimizar a interrupção da pelota. Congele a pelota em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C imediatamente após a coleta ou continue diretamente ao passo 4 (isolamento dos núcleos).

3. Preparação amostral de culturas planctônicas

1. Cepa(s) com etiqueta GFP em placas de ágar YPD e incubar a 30 °C por 2-3 dias. Usando uma única colônia isolada da placa de ágar, inoculada em 4 mL de meio líquido YPD. Incubar a 30 °C com agitação durante a noite (12-16 h). Determine o OD₆₀₀ da cultura da noite para o dia.
2. Diluir de 30 °C com₆₀₀ OD de 0,1 em 50 mL de meio líquido RPMI-1640 e incubar a 30 °C com agitação a 225 rpm por 2-5 h até OD₆₀₀ entre 0,5 e 0,8.
   NOTA: As células devem passar por pelo menos duas duplicações antes de serem colhidas. As condições utilizadas para culturas planctônicas podem ser ajustadas conforme necessário.
3. Pellet as amostras por centrifugação a 4.000 × g em temperatura ambiente por 5 minutos. Decantece o máximo possível do supernante, tomando o cuidado de minimizar a interrupção da pelota. Congele a pelota em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C imediatamente após a coleta ou continue diretamente ao passo 4 (isolamento dos núcleos).

4. Isolamento dos núcleos

NOTA: No dia do experimento, prepare o novo Amortecedor Ficoll, adicione o inibidor de 2 mercaptoetanol e protease ao aliquot(s) do Buffer de Resuspensão e adicione o inibidor de protease ao aliquot(s) do Buffer SPC (ver Arquivo Suplementar 1). Para resuspensar as pelotas, pipeta suavemente usando pontas de pipeta de 200 μL ou 1 mL para evitar danificar as células ou núcleos. Antes de iniciar o isolamento dos núcleos, ligue o bloco de calor para pré-aquecer a 30 °C. Todas as pontas e tubos de pipeta para o restante deste protocolo devem ser certificados DNA/RNA e DNase/RNase-free, e o uso de dicas de filtro é recomendado para todas as etapas subsequentes de pipetação.

1. Resuspend pelotas(s) em 1 mL de tampão de resuspensão de temperatura ambiente e transferência para um tubo de microfuça de 1,5 mL estéril. Pelota a 2.000 × g à temperatura ambiente por 2 min em uma centrífuga de mesa e remova o sobrenatante.
   NOTA: Remova o supernasce usando ponta de pipeta de 200 μL ou 1 mL, tomando o cuidado de minimizar a interrupção das pelotas.
2. Resuspense a pelota(s) em 200 μL de tampão de resuspensão de temperatura ambiente. A partir da pelota resuspended, transfira uma alíquota de 5 μL para um novo tubo PCR e armazene-a a 4 °C para uso posterior.
   NOTA: Esta alíquota será usada como controle durante uma etapa subsequente de controle de qualidade para avaliar a qualidade dos núcleos isolados.
3. Pelota a 2.000 × g por 2 min e remova e descarte o supernasce usando uma pipeta. Repita a etapa de lavagem duas vezes usando 200 μL de Tampão de Ressuspensão.
4. Centrifugar a 2.000 × g em temperatura ambiente por 2 min e remover o sobrenante. Adicione 300 μL de Tampão de Ressuspensão e 10 μL de solução lyticase (50 mg/mL, consulte a Tabela de Materiais). Incubar por 30 min a 30 °C em um bloco de calor.
   NOTA: Alternativamente, um banho de água aquecido a 30 °C também pode ser usado em vez de um bloco de calor. As condições de esfocing utilizadas aqui foram otimizadas para serem eficazes tanto para as células de levedura quanto para hiphal de C. albicans. Recomenda-se otimizar as condições de esferoplastia ao aplicar este protocolo às células C. albicans com mutações que impactam a integridade da parede celular ou outras morfologias celulares. Durante esta etapa de incubação de 30 minutos, o usuário tem a opção de completar a etapa 5 (Concanavalin A Bead Activation) com antecedência para economizar tempo.
   1. PASSO CRÍTICO: Após a etapa de incubação de 30 min, transfira uma alíquota de 5 μL para um novo tubo PCR. Aos 5 μL de núcleos isolados e à alíquota de 5 μL de células intactas armazenadas a 4 °C a partir do passo 4,2, adicione 1 μL de calcofluor branco (um corante de parede celular fluorescente) e 1 μL de SYTO 13 (uma mancha de ácido nucleico). Incubar a 30 °C no escuro por 30 min.
   2. Inspecione visualmente a integridade e a pureza dos núcleos isolados usando um microscópio de fluorescência. Procure núcleos isolados que mostrem núcleos intactos manchados proeminentemente (usando um filtro de excitação de 488-509 nm) e certifique-se de que não há manchas na parede celular pelo corante branco calcofluor (usando um filtro de excitação de 390-420 nm). Nas células de controle intactas, procure por manchas proeminentes na parede celular pelo corante branco calcofluor (usando um filtro de excitação de 390-420 nm) e núcleos intactos manchados (usando um filtro de excitação de 488-509 nm).
5. Centrifugar a 2.000 × g a 4 °C por 5 min e remover o supernatante. Resuspense a pelota em 500 μL de tampão de resuspensão gelado usando pontas de filtro de 1 mL, pipetando suavemente para cima e para baixo 5 vezes. Centrifugar a 2.000 × g a 4 °C por 5 min, e remover o supernatante usando uma pipeta de 1 mL. Resuspend a pelota com 1 mL de bolo ficoll fresco recém-feito.
   NOTA: Mantenha as amostras e tampões no gelo a partir deste ponto.
6. Centrifugar as amostras a 5.000 × g a 4 °C por 10 min e remover o sobrenante. Resuspenda a pelota em 500 μL de SPC Buffer gelado.
   NOTA: A partir deste ponto, manuseie os núcleos extremamente suavemente para evitar danificá-los.
7. Centrifugar as amostras a 5.000 × g a 4 °C por 10 min e remover o máximo possível do sobrenante sem interromper a pelota. Coloque os tubos contendo os núcleos pelleted no gelo e prossiga para o passo 5. Se a etapa 5 já foi concluída antes do tempo na etapa 4.4, proceda à etapa 6 ou congele as pelotas em nitrogênio líquido e armazene-as a -80 °C imediatamente após a coleta.

5. Concanavalina Uma ativação de contas

NOTA: Este é um passo crítico. A partir deste ponto, os usuários têm a opção de continuar com o protocolo usando um kit CUT&RUN comercialmente disponível ou componentes-chave de origem individualmente e preparar buffers internamente. Se usar o kit comercial, todos os buffers e reagentes utilizados abaixo estão incluídos no kit, a menos que seja observado em contrário. Os números individuais do catálogo para o fornecimento de reagentes de forma independente também são fornecidos na Tabela de Materiais. Esfrie todos os buffers no gelo antes de usar. Uma vez concluída a etapa 5, recomenda-se que prossiga para a etapa 6 imediatamente. Evite o congelamento múltiplo de núcleos isolados, pois é conhecido por aumentar os danos no DNA e pode levar a resultados de má qualidade.

1. Levemente resuspenque as contas de concanavalina A (ConA) usando uma pipeta. Transfira 22 μL de suspensão de contas por amostra a ser processada em um único tubo de microfuça de 1,5 mL. Coloque o tubo em um rack magnético até que o chorume esteja limpo; remover e descartar o supernatante usando uma pipeta.
   NOTA: Ao realizar a CUT&RUN para um total de 10 amostras, por exemplo, transfira 220 μL da suspensão de contas para um tubo de microfuça de 1,5 mL.
2. Remova o tubo contendo as contas do rack magnético e adicione imediatamente 200 μL de tampão de ativação de contas gelada e misture suavemente usando uma pipeta. Coloque o tubo no rack magnético até que o chorume esteja limpo; remover e descartar o supernatante usando uma pipeta. Repita esta etapa para um total de duas lavagens.
3. Resuspengem as contas em 22 μL de tampão de ativação de contas gelada por amostra de núcleos a serem processados. Mantenha as contas no gelo até que seja necessário.
   NOTA: O rendimento das etapas subsequentes depende do número e capacidade dos racks de tubo magnético disponíveis. Processar 32 amostras em dois racks de tubo de 16 poços é um número gerenciável para a maioria dos usuários deste protocolo. No entanto, é possível um rendimento mais alto para usuários mais experientes ou se sistemas robóticos de manuseio líquido estão disponíveis.

6. Núcleos de vinculação a contas ativadas

NOTA: Esfrie todos os buffers no gelo antes de usar. Todos os tampões complementados com inibidores de protease devem ser preparados frescos no dia do experimento. Recomenda-se o uso de tubos de tira de 0,2 mL nas etapas subsequentes.

1. Resuspenja os núcleos de pelotização a partir do passo 4 em 100 μL de SPC Buffer gelado e transfira para uma nova tira de 8 tubos de 0,2 mL. Adicione 20 μL das contas ativadas a cada amostra e delicadamente pipeta para misturar. Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos sem agitação.
2. Coloque os tubos no rack magnético até que o chorume esteja limpo; remover e descartar o supernatante usando uma pipeta. Remova os tubos do rack magnético e adicione 200 μL de tampão de lavagem gelado a cada amostra. Resuspenque as contas em tubos suavemente para cima e para baixo 5 vezes. Transfira 100 alíquotas de μL de cada amostra para uma nova tira de 8 tubos de 0,2 mL.
   1. PASSO CRÍTICO: Divida cada amostra DE CUT&RUN em duas alíquotas separadas. Use uma das alíquotas para o anticorpo de controle negativo (por exemplo, anticorpo de controle negativo IgG) e outra para o anticorpo alvo contra a proteína de interesse (por exemplo, anticorpo anti-GFP).
      NOTA: Ambas as amostras são necessárias para que o pipeline computacional identifique com precisão sinais de enriquecimento específicos para o TF de interesse. Um controle adicional usando anticorpos anti-GFP com uma cepa não marcada também pode ser realizado. Este controle mostrou resultados comparáveis ao uso de anticorpos IgG em uma cepa marcada por GFP. Portanto, para simplificar, recomenda-se usar o controle IgG padrão para todos os experimentos.

7. Ligação de anticorpos primários

NOTA: a proteína de fusão pAG-MNase liga-se bem aos anticorpos coelho, cabra, burro, cobaia e mouse IgG¹⁷. Geralmente, a maioria dos anticorpos comerciais certificados pelo ChIP-seq são compatíveis com os procedimentos da CUT&RUN. A quantidade de anticorpos primários utilizados depende da eficiência do anticorpo, e a titulação do anticorpo (por exemplo, 1:50, 1:100, 1:200 e diluição final de 1:400) pode ser necessária se o anticorpo de interesse não tiver sido previamente testado em experimentos ChIP ou CUT&RUN. Esfrie todos os buffers no gelo antes de usar. Todos os buffers usados para as etapas de ligação de anticorpos devem ser preparados frescos no dia do experimento.

1. Coloque os tubos em um rack magnético e espere até que o chorume esteja completamente limpo; remover e descartar o supernatante usando uma pipeta. Adicione 50 μL do amortecedor de anticorpos e misture suavemente por pipetação.
2. Adicione 3 μL do anticorpo policlonal anti-GFP (ou 0,5 μg se usar um anticorpo não testado). Incubar os tubos em uma batedeira de nozes a 4 °C por 2 h.
   NOTA: Alguns protocolos CUT&RUN relatam aumento do rendimento adicionando um anticorpo secundário antes da adição pAG-MNase¹⁴; no entanto, não foi observada melhora significativa por meio dessa etapa adicional e, portanto, não está incluída neste protocolo.
3. Centrifufique brevemente os tubos a 100 × g em temperatura ambiente por 5 s, coloque os tubos em um rack magnético, e uma vez que o chorume esteja limpo, remova e descarte o sobrenatário usando uma pipeta. Enquanto os tubos contendo as contas ainda estão no rack magnético, adicione 200 μL de tampão de permeabilização celular gelado diretamente nas contas. Remova e descarte o supernatante usando uma pipeta. Repita para um total de duas lavagens com o tampão de permeabilização celular gelada.
4. Adicione 50 μL de tampão de permeabilização celular frio ao gelo em cada tubo e misture suavemente por pipetação.
   NOTA: As contas são frequentemente agregadas neste ponto, mas podem ser facilmente dispersas misturando-se suavemente usando uma pipeta de 200 μL.

8. Vinculação de pAG-MNase ao anticorpo

1. Adicione 2,5 μL do pAG-Mnase (estoque de 20x) a cada amostra e misture suavemente por pipetação. Coloque as amostras (ligeiramente elevadas em ângulo de ~45°) em um nutador a 4 °C. Ligue o nutador e incuba as amostras por 1h.
2. Centrifufique brevemente os tubos de tira a 100 × g em temperatura ambiente por 5 s, coloque os tubos em um rack magnético e, uma vez que o chorume esteja limpo, remova e descarte o sobrenatário usando uma pipeta.
   NOTA: Este passo é crítico. O anticorpo de transporte restante na tampa ou nas laterais dos tubos após esta etapa aumentará significativamente a quantidade de sinal de fundo.
3. Enquanto os tubos contendo as contas ainda estão no rack magnético, adicione 200 μL de tampão de permeabilização celular gelada, permita que o chorume se limpe, e remova e descarte o sobrenante usando uma pipeta. Repita esta etapa para um total de duas lavagens com o Buffer de Permeabilização celular.
4. Adicione 100 μL do tampão de permeabilização celular gelada às amostras e delicadamente pipeta para cima e para baixo 5 vezes.

9. Digestão e liberação de cromatina direcionada

1. Incubar os tubos que contêm a amostra em um banho de gelo molhado por 5 minutos. Adicione 3 μL de 100 mM CaCl₂ em cada amostra usando uma pipeta multicanal. Pipeta suavemente para cima e para baixo 5 vezes, imediatamente devolva os tubos para o banho de gelo molhado, e incubar por 30 minutos.
2. Adicione 66 μL do Amortecedor de Parada a cada amostra e suavemente vórtice para misturar. Incubar amostras por 10 min a 37 °C em banho seco.
   NOTA: Recomenda-se adicionar 1,5 pg de DNA heterologous E. coli por amostra no Buffer stop. A adição de 1,5 pg de DNA de E. coli resulta em 1.000-10.000 leituras mapeadas para 1-10 milhões de leituras experimentais mapeadas¹⁴. O DNA de pico é usado para calibrar a profundidade de sequenciamento e é especialmente importante para comparar amostras em uma série. A adição de spike-in E. coli é altamente recomendada, mas não essencial. O kit comercial CUT&RUN inclui DNA de espigão E. coli , mas também pode ser comprado separadamente.
3. Coloque os tubos no rack magnético e transfira 160 μL do supernatante em um tubo de microfuça de 1,5 mL. Transfira 80 μL da amostra para um novo tubo de microfuça de 2 mL e armazene a -20 °C caso seja necessária uma amostra de backup. Prossiga para a etapa 10 com a amostra de 80 μL.

10. Limpeza de amostras de DNA coletadas

NOTA: Incubar contas de purificação de DNA à temperatura ambiente por 30 minutos antes do uso. Prechill 100% isopropanol no gelo. Ao misturar as amostras, pipeta para cima e para baixo 10 vezes.

1. Contas de purificação de DNA do vórtice para homogeneizar a suspensão das contas. Adicione 50 μL (~0,6x volume de amostra) das contas resuspendadas a cada amostra. Misture a pipeta e incuba as amostras em um nutador por 5 minutos à temperatura ambiente.
   NOTA: A razão entre as contas de purificação de DNA para a amostra utilizada é crítica. O uso de 0,6x de volume de solução de purificação de DNA em relação à amostra permite que as contas magnéticas se liguem a grandes fragmentos de DNA liberados de núcleos danificados. Os fragmentos de DNA enriquecidos pela CUT&RUN são muito menores do que esses grandes fragmentos de DNA e, portanto, são retidos no supernante nesta etapa.
2. Coloque os tubos em um rack magnético e transfira 130 μL do supernasal contendo o DNA para uma tira de tubo de 0,2 mL de 8 tubos. Adicione um adicional de 30 μL de contas de purificação de DNA à amostra (o volume total é de 160 μL).
3. Adicione 170 μL (~1x de volume de amostra) de isopropanol gelado 100%, misture bem por pipetar para cima e para baixo 10 vezes e incubar no gelo por 10 minutos.
   NOTA: É fundamental que o isopropanol 100% frio seja usado para esta etapa para as contas de purificação de DNA para capturar eficientemente os pequenos fragmentos enriquecidos pela CUT&RUN.
4. Coloque os tubos no rack magnético, e uma vez que o chorume tenha limpado, remova cuidadosamente e descarte o sobrenatário usando uma pipeta.
5. Enquanto os tubos estão no rack magnético, adicione 200 μL de etanol recém-preparado, de temperatura ambiente 80% aos tubos e incubar em temperatura ambiente por 30 s. Remova cuidadosamente e descarte o sobrenatante usando uma pipeta. Repita esta etapa para um total de duas lavagens com 80% de etanol.
6. Gire rapidamente os tubos a 100 × g, coloque os tubos de volta no rack magnético e remova qualquer etanol residual usando uma pipeta depois que o chorume tiver limpado. Seque as contas por 5 minutos enquanto os tubos permanecem no rack magnético com a tampa aberta.
   NOTA: Não exceda 5 minutos de tempo de secagem, pois isso pode reduzir significativamente o rendimento final do DNA.
7. Remova os tubos do rack magnético e elute o DNA das contas adicionando 17 μL de 0,1x Tris-EDTA (TE) no pH 8. Misture bem e incubar os tubos por 5 minutos à temperatura ambiente.
8. Coloque os tubos no rack magnético até que o chorume fique claro. Uma vez que o chorume tenha limpado, transfira cuidadosamente 15 μL do supernante para um tubo PCR estéril de 0,2 mL.
9. Meça a concentração do DNA coletado usando um fluorômetro seguindo o protocolo do fabricante.
   NOTA: Normalmente, a concentração do DNA coletado é de ~1 ng/μL. Às vezes, a concentração do DNA coletado é muito baixa para quantificar usando um fluorômetro. Este não é um indicador de um experimento fracassado. Prossiga com a preparação da biblioteca independentemente da concentração do DNA coletado.
10. Proceda à etapa 11 ou armazene as amostras a -20 °C até ficar pronto.

11. Preparação da biblioteca para sequenciamento

NOTA: As seguintes etapas usam um kit de preparação de biblioteca disponível comercialmente. Ao executar etapas usando o Mix Master de Ligação, minimize tocando os tubos e mantenha-os sempre no gelo.

1. Usando 0,1x TE no pH 8, elete o volume total do DNA CUT&RUN para 50 μL. Faça uma mistura mestre de 3 μL de End Prep Enzima Mix e 7 μL de End Prep Reaction Buffer por amostra. Adicione 10 μL de mistura mestre ao DNA CUT&RUN e misture bem por pipetar para cima e para baixo 5 vezes.
2. Faça uma rotação rápida a 100 × g para coletar todo o líquido das laterais do tubo. Coloque os tubos em um termociclador com a tampa aquecida definida para ≥75 °C e execute as condições de ciclismo na Tabela 7.
   NOTA: Dependendo das concentrações de DNA de entrada inicial coletadas a partir da etapa 10, siga a diluição necessária do adaptador da Tabela 8.
3. Adicione 2,5 μL de Adaptador por amostra e misture bem por pipetar para cima e para baixo 10 vezes.
   NOTA: É fundamental que o adaptador seja adicionado à amostra e misturado completamente antes que a mistura mestre de ligadura seja adicionada.
4. Faça uma mistura mestre de 30 μL de Ligation Master Mix e 1 μL de Ligation Enhancer. Adicione 31 μL da mistura mestre à amostra(s). Misture bem por pipetar para cima e para baixo 10 vezes.
5. Incubar a 20 °C por 15 min em um termociclador com a tampa aquecida desligada.
   NOTA: É fundamental que as amostras sejam mantidas no gelo e transferidas para o termociclador somente após o termociclador atingir 20 °C.
6. Faça um giro rápido a 100 × g para coletar todo o líquido das laterais do tubo, adicione 3 μL de enzima Uracil Excision e incubar os tubos no termociclador a 37 °C por 15 minutos com a tampa aquecida definida para ≥47 °C.
   NOTA: Este é um ponto de parada seguro; armazene as amostras a -20 °C ou continue diretamente ao passo 11.7. Se continuar diretamente ao passo 11.7, incubar as contas de purificação de DNA à temperatura ambiente por 30 minutos antes do uso.
7. Adicione 154,4 μL (~1,6x de volume de amostra) das contas de purificação de DNA à reação de ligadura adaptador da etapa 11.6. Misture a pipeta e incuba as amostras por 5 minutos à temperatura ambiente.
8. Coloque os tubos no rack magnético e, uma vez que o chorume tenha limpo, remova cuidadosamente e descarte o sobrenante usando uma pipeta.
9. Adicione 200 μL de etanol recém-preparado, de temperatura ambiente, 80% aos tubos e incubar à temperatura ambiente por 30 s. Retire cuidadosamente e descarte o supernascido usando uma pipeta e repita esta etapa para um total de duas lavagens com 80% de etanol.
10. Gire os tubos brevemente a 100 × g. Coloque os tubos de volta no rack magnético e remova qualquer etanol residual usando uma pipeta. O ar seco as contas por 5 minutos enquanto os tubos permanecem no rack magnético com a tampa aberta.
    NOTA: Não exceda 5 minutos de tempo de secagem, pois isso pode reduzir significativamente o rendimento final do DNA.
11. Remova os tubos do rack magnético e elute o DNA das contas adicionando 17 μL de 0,1x TE no pH 8. Misture bem e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
12. Coloque os tubos no rack magnético até que o chorume fique claro. Uma vez que o chorume tenha limpado, transfira cuidadosamente 15 μL do supernante para um tubo PCR estéril de 0,2 mL.
13. Faça uma mistura mestre de 25 μL de DNA Polymerase Master Mix e 5 μL de Universal Forward Library Amplification Primer (10 μM) por amostra.
    NOTA: Prepare uma amostra extra de mix mestre para explicar as perdas de pipetação.
14. Adicione 30 μL da mistura mestre aos 15 μL de amostra de DNA ligada pelo adaptador. Adicione 5 μL de Primer de Amplificação de Biblioteca Indexada Inversa (10 μM) a cada amostra para levar o volume final a um total de 50 μL. Misture completamente por pipetar para cima e para baixo 10 vezes. Realizar as condições de ciclismo PCR na Tabela 9.
    NOTA: Incubar as contas de purificação de DNA à temperatura ambiente por 30 minutos antes do uso.
15. Vórtice as Contas de Purificação de DNA para resuspend. Adicione 35 μL (~0,7x volume de amostra) das contas resuspendadas às amostras de DNA amplificadas pelo PCR. Misture e incuba as amostras em um nutador por 5 minutos à temperatura ambiente.
16. Coloque os tubos no rack magnético e, uma vez que o chorume esteja limpo, transfira o supernasal contendo o DNA para um novo tubo de tira PCR de 0,2 mL de 8 poços.
17. Adicione 119 μL (~1,4x volume de amostra) de contas à amostra e misture por pipetar para cima e para baixo 5 vezes. Incubar as amostras em um nutador por 5 minutos em temperatura ambiente.
18. Coloque os tubos no rack magnético e, uma vez que o chorume tenha limpo, remova cuidadosamente e descarte o sobrenante usando uma pipeta.
19. Adicione 200 μL de etanol recém-preparado, de temperatura ambiente, 80% aos tubos e incubar à temperatura ambiente por 30 s. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenante usando uma pipeta; repetir o passo para um total de duas lavagens com 80% de etanol.
20. Gire os tubos brevemente a 100 × g. Coloque os tubos de volta no rack magnético e remova qualquer etanol residual usando uma pipeta. Seque as contas por 5 minutos enquanto os tubos permanecem no rack magnético com a tampa aberta.
    NOTA: Não exceda 5 minutos de tempo de secagem, pois isso pode reduzir significativamente o rendimento final do DNA.
21. Remova os tubos do rack magnético e elute o DNA das contas adicionando 14 μL de 0,1x TE no pH 8. Misture bem e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
22. Coloque os tubos no rack magnético até que o chorume fique claro. Uma vez que o chorume tenha limpado, transfira cuidadosamente 13 μL do supernante para um tubo PCR estéril de 0,2 mL.
23. Prepare o gel TBE 1x tris-borate-EDTA (TBE) fresco e insira gel TBE de 10% comercial no aparelho de eletroforese de gel preenchido com 1x TBE.
24. No primeiro poço, adicione 2 μL de escada de DNA de baixo alcance. Misture 3 μL de corante de carga de 6x com 13 μL da amostra coletada anteriormente a partir da etapa 11.22. Adicione cuidadosamente 15 μL em cada poço do gel. Corra o gel por 90 min a 70 V.
    NOTA: Recomenda-se deixar um poço no gel vazio entre cada amostra, pois isso reduz a probabilidade de contaminação cruzada da amostra. Usuários experientes podem achar apropriado usar todos os poços, evitando cuidadosamente a contaminação cruzada, especialmente ao processar um grande número de amostras.
25. Remova o gel lançado da caixa de gel. Abra o gel fundido pelas instruções do fabricante, retire suavemente o gel do molde de gel e coloque-o dentro de uma bandeja de segurando gel contendo 100 mL de 1x TBE.
    NOTA: Certifique-se de remover suavemente o gel do molde de gel para evitar rasgar o gel, pois ele é fino e frágil. É fundamental para prewet luvas e o gel com 1x TBE sempre manuseando o gel. A bandeja de retenção de gel deve ser ligeiramente maior do que o tamanho do gel (aproximadamente 0,5" de cada lado). As tampas plásticas fornecidas com caixas de armazenamento de tubos PCR de 96 poços são convenientes para tamanhos de mini gel padrão.
26. Adicione 10 μL da mancha de gel de ácido nucleico à bandeja e gire suavemente. Cubra com papel alumínio para proteger da luz e incubar estaticamente à temperatura ambiente por 10 minutos.
27. Enxágüe o gel duas vezes com 100 mL de água da torneira deionizada. Imagem do gel sob iluminação de luz azul usando uma tampa de filtro âmbar (Figura 2).
    NOTA: Bibliotecas bem sucedidas mostram uma mancha entre 100 e 500 bp. Haverá também uma banda de adaptador de ~125. A presença de dimers adaptadores não é um indicador de má qualidade da biblioteca. Essa quantidade de dimers adaptadores é inevitável para experimentos CUT&RUN realizados em TFs de baixa abundância e é uma consequência da baixa quantidade de material de entrada usado para preparar essas bibliotecas. Não use luz ultravioleta, que pode danificar o DNA.
28. Como mostrado na Figura 2, para cada biblioteca, corte o gel ligeiramente acima da faixa de adaptador proeminente ~125 bp (certificando-se de evitar tocar na banda de dimer adaptador) e abaixo da marca de escada de 400 bp.
    NOTA: É fundamental evitar a banda de adaptador ~125. Mesmo pequenas quantidades de dimers adaptadores reduzirão significativamente a qualidade da biblioteca.
29. Puna a parte inferior de um tubo de 0,65 mL usando uma agulha de 22 G e coloque o tubo perfurado dentro de um tubo microfuçado estéril de 2 mL. Transfira a fatia de gel para o tubo perfurado dentro do tubo de microfuça de 2 mL.
30. Centrifugar o tubo de microfuça de 2 mL contendo o tubo perfurado de 0,65 mL e amostra a 10.000 × g à temperatura ambiente por 2 min para coletar o chorume de gel dentro do tubo de microfuça de 2 mL.
    NOTA: O tubo perfurado deve agora estar vazio e pode ser descartado. Se o tubo perfurado ainda tiver algum gel que reste dentro, coloque o tubo perfurado de volta dentro do tubo de microfuça de 2 mL e centrífuga novamente a 10.000 × g à temperatura ambiente por mais 2 minutos.
31. Ao chorume de gel dentro do tubo de microfuça de 2 mL, adicione 300 μL de tampão de eluição de gel gelado e misture em um nutador à temperatura ambiente por um mínimo de 3h ou durante a noite (12-16 h).
32. Transfira todo o chorume líquido e gel para uma coluna de filtro de 0,22 μm. Centrifugar a 10.000 × g em temperatura ambiente por 1 min; o volume coletado deve ser ~300 μL.
33. Adicione 450 μL (~1,5x de volume amostral) de contas de purificação de DNA, incubar à temperatura ambiente por 5 minutos em um nutador e, em seguida, colocar a amostra no rack magnético até que o chorume esteja limpo.
    NOTA: Incubar as contas de purificação de DNA à temperatura ambiente por 30 minutos antes do uso.
34. Remova e descarte 500 μL do supernante, certificando-se de não interromper as contas.
35. Remova a amostra do rack magnético e misture as contas por tubulação para cima e para baixo 5 vezes. Transfira 200 μL da amostra para um novo tubo de tira PCR.
36. Coloque o tubo de tira no rack magnético, e uma vez que o chorume tenha limpado, remova cuidadosamente e descarte o sobrenatário usando uma pipeta.
37. Adicione 200 μL de etanol recém-preparado, de temperatura ambiente, 80% aos tubos e incubar à temperatura ambiente por 30 s. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenante usando uma pipeta; repetir esta etapa para um total de duas lavagens com 80% de etanol.
38. Gire os tubos brevemente a 100 × g. Coloque os tubos de volta no rack magnético e remova qualquer etanol residual usando uma pipeta. Seque as contas por até 5 minutos enquanto os tubos permanecem no rack magnético com a tampa aberta.
    NOTA: Não exceda 5 minutos de tempo de secagem, pois isso pode reduzir significativamente o rendimento final do DNA.
39. Remova os tubos do rack magnético e elute o DNA das contas adicionando 17 μL de 0,1x TE no pH 8. Misture bem e incubar os tubos por 5 minutos à temperatura ambiente.
40. Coloque os tubos no rack magnético até que o chorume fique claro. Uma vez que o chorume tenha limpado, transfira cuidadosamente 15 μL do supernante para um tubo PCR estéril de 0,2 mL.
41. Meça a quantidade final da biblioteca usando o fluorômetro; use esta biblioteca final para sequenciamento.
    NOTA: Até 48 bibliotecas podem ser agrupadas e sequenciadas em uma única pista usando uma plataforma de sequenciamento que fornece pelo menos 300 milhões de leituras de 40 bp ou mais de extremidade emparelhada.

12. Análise de sequência CUT&RUN

NOTA: Esta seção apresenta o protocolo computacional usado para analisar os dados de sequência CUT&RUN. O protocolo começa com a configuração do ambiente virtual computacional e orienta os usuários através da execução dos comandos em sua máquina local. Este protocolo funcionará em todos os recursos computacionais, como máquinas locais, servidores em nuvem virtuais e clusters de computação de alto desempenho. Todos os dados da CUT&RUN apresentados neste artigo podem ser acessados na NCBI GEO sob o número de adesão GSE193803.

1. Baixe o código-fonte para a análise CUT&RUN de https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
   NOTA: O fluxo de trabalho funcionará melhor em um sistema MacOS ou Linux OS. Os usuários do Windows podem executar o fluxo de trabalho usando o GitBash (consulte a tabela de materiais).
   1. Baixe diretamente o código da página do GitHub clicando no botão código verde | Baixe a opção ZIP . Descompacte a pasta para um local relevante na máquina local.
2. Instale o ambiente Conda (veja a tabela de materiais) e execute apenas uma vez.
   NOTA: Este fluxo de trabalho usa o ambiente de ferramentas da linha de comando Conda para instalar todos os softwares e ferramentas necessários.
3. Uma vez instalado o Conda (execute apenas uma vez), crie um ambiente virtual usando o Arquivo Suplementar 2 fornecido com o seguinte comando:
   conda criar --nome --Supplementary_File_2.txt de arquivo
4. Ative o ambiente virtual toda vez que este fluxo de trabalho deve ser executado usando:
   conda ativar
5. Organize os arquivos FASTQ brutos de entrada em uma única pasta, idealmente uma pasta por experimento CUT&RUN.

13. Geração do arquivo genoma para alinhamento

1. Gerar o arquivo genoma para alinhamento (execute apenas uma vez para cada arquivo genoma). Crie uma pasta para salvar todos os arquivos do genoma de C. albicans , tais como:
   ca_genome_files Mkdir

14. Download C. albicans conjunto genoma 21

1. Baixe C. albicans conjunto genoma 21 do Banco de Dados do Genoma candida usando ferramentas wget ou curl (ver a Tabela de Materiais)¹⁸.
   NOTA: A montagem C. albicans 21 foi utilizada aqui para comparar os resultados da CUT&RUN com os resultados do chip ChIP publicados anteriormente, que estavam alinhados à Montagem 21. Os usuários podem baixar outras versões de montagem e executar comandos semelhantes para gerar arquivos de genoma relevantes para suas necessidades de alinhamento.

15. Gerar um banco de dados de índice Bowtie 2 (nome do banco de dados: ca21)

1. Use o seguinte:
   bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
   bowtie2-inspeciona -s ca21

16. Execute o pipeline de análise CUT&RUN

1. Leia a seção de ajuda para se familiarizar com os parâmetros do pipeline.
   bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Execute o arquivo cut_n_run_pipeline.sh com parâmetros relevantes

1. Execute o script:
   bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y > /path/to/output.log 2>&1
   NOTA: Os parâmetros relevantes com descrições detalhadas nas linhas 19-36 do código estão descritos na página do GitHub https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. Organize arquivos de saída

1. Mescle picos significativos de todas as réplicas chamadas pelo MACS2 localizados em /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 usando a função de mesclagem BedTools¹⁹.
   gato /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files tipo -k1,1 -k2,2n | mesclado -c 4,5,6,7,8,9 -o último, média,primeiro,média, média, média > /path/to/merged_output.bed
   NOTA: Para obter informações adicionais e melhores práticas na avaliação de picos sobrepostos em amostras de replicação, consulte Landt et ^al.20 e Boyd et ^al.21.

19. Remova as partidas para regiões genômicas bloqueadas usando a função de subtraída bedtools

1. Use o seguinte: subtrair -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
   NOTA: As regiões bloqueadas do genoma C. albicans são fornecidas como um arquivo .bed in Supplementary File 3. A lista consiste principalmente de elementos de sequência altamente repetitivos e regiões como repetições telômicas e centrosômeros que geralmente produzem resultados falso-positivos em conjuntos de dados C. albicans CUT&RUN, ChIP-seq e ChIP-chip. Por isso, recomenda-se remover as regiões bloqueadas. No entanto, para certos alvos proteicos, pode ser inapropriado ou indesejável excluir esses loci. Os usuários podem pular essa etapa para reter sinais contidos nessas regiões bloqueadas ou criar suas próprias regiões bloqueadas.

20. Mescle arquivos BigWig de réplicas usando a função UCSC bigWigMerge²²

1. Use o seguinte: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
2. Converta a saída bedgraph de bigWigMerge para BigWig usando a função UCSC bedGraphToBigWig.
   bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

Resultados

Este robusto protocolo CUT&RUN foi adaptado e otimizado para investigar a localização em todo o genoma de TFs específicos em biofilmes de C. albicans e culturas planctônicas (ver Figura 2 para uma visão geral da abordagem experimental). Um pipeline de análise de dados completo também está incluído para facilitar a análise dos dados de sequenciamento cut&RUN resultantes e exige que os usuários tenham experiência mínima em codificação ou bioinformática (ver

Discussão

Este protocolo apresenta um abrangente pipeline experimental e computacional para localização de TFs regulatórios em C. albicans. Ele foi projetado para ser altamente acessível a qualquer pessoa com treinamento padrão de microbiologia e biologia molecular. Ao aproveitar o alto alcance dinâmico e os baixos requisitos de entrada de amostras do ensaio CUT&RUN e incluindo otimizações para a localização de interações de ligação TF-DNA em culturas biofilmes c. albicans e planktônicas, este prot...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes	VWR	490003-190
1 M CaCl2	Fisher Scientific	50-152-341
1 M PIPES	Fisher Scientific	AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates	Corning	351143
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
2% Digitonin	Fisher Scientific	CHR103MI
50 mL conical tubes	VWR	89039-658
5x phusion HF buffer	Fisher Scientific	F530S	Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar	Criterion	C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads	Beckman Coulter	A63880
Agilent Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific	VWR	89133-910
Bacto peptone	BD Biosciences	211677
Benchling primer design tool	Benchling		https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine	Fisher Scientific	AAJ77507AB
Calcofluor white stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
Candida Genome Database			http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads	Polysciences	86057-3
Conda software			https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit	Epicypher	14-1048	Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)	New England Biolabs	N0447S
Dextrose (D-glucose)	Fisher Scientific	D163
Difco D-mannitol	BD Biosciences	217020
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)	Fisher Scientific	R0611
DreamTaq green DNA polymerase	Fisher Scientific	EP0713	Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer	Fisher Scientific	EP0713	Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA	Epicypher	18-1401
ELMI Microplate incubator	ELMI	TRMS-04	Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof	VWR	89125-170
FastDigest MssI	Fisher Scientific	FD1344	Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer	Fisher Scientific	FD1344	Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400	Fisher BioReagents	BP525-25
Fluorescence microscope			User-dependent
Gel electrophoresis apparatus			User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder	Fisher Scientific	FERSM1192
GitBash workflow			https://gitforwindows.org/
GitHub source code			https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5	Boston BioProducts	BBH-75-K
High-speed centrifuge			User-dependent
Isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1830-4
Lens paper	VWR	52846-001
Ligation Enhancer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate	MP Biomedicals	215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody	Takara	632592	User-dependent
MACS2			https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes	Epicypher	10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes	Fisher Scientific	MR02
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC	Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView			http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
NaCl	VWR	470302-522
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
NCBI GEO			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit	New England Biolabs	E7645S	Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)	Goldbio	N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well	Fisher Scientific	EC62755BOX
Nutating mixer	VWR	82007-202
Nutrient broth	Criterion	C6471
pADH110	Addgene	90982	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119	Addgene	90985	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137	Addgene	90986	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139	Addgene	90987	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140	Addgene	90988	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase	Epicypher	15-1016 or 15-1116	50 rxn or 250 rxn
pCE1	Addgene	174434	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid	Fisher Scientific	FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase	Fisher Scientific	F530S	Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350	VWR	10791-816
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q33230
Qubit fluorometer	Life Technologies	Q33216	Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody	Epicypher	13-0042
RNase A	Sigma-Aldrich	10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets	Sigma-Aldrich	5056489001
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
Shaking incubator	Eppendorf	M12820004	User-dependent
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters	Fisher Scientific	07-200-385
Sterile inoculating loops	VWR	30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Fisher Scientific	S11494
SYTO 13 nucleic acid stain	Fisher Scientific	S7575	Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler			User-dependent
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sigma-Aldrich	252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution	Invitrogen	15632011
USER Enzyme			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer	VWR	10153-834
wget tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
Yeast extract	Criterion	C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)	Fisher Scientific	NC0439194