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要約

このプロトコルは、ヒト真菌病原体カン ジダ・アルビカンスにおけるヌクレアーゼ(CUT&RUN)を用いた標的下での切断および放出のための実験方法およびデータ分析ワークフローを記述する。

要約

調節転写因子は、細胞分化、環境摂動およびストレスに対する応答、宿主 - 病原体相互作用を含む多くの重要な生物学的プロセスを制御する。DNAへの調節転写因子のゲノムワイド結合を決定することは、これらのしばしば複雑な生物学的プロセスにおける転写因子の機能を理解するために不可欠である。ヌクレアーゼ(CUT&RUN)を用いた標的下での切断および放出は、 in vivo タンパク質-DNA結合相互作用のゲノムワイドマッピングのための現代的な方法であり、従来広く使用されているクロマチン免疫沈降法に続いてシーケンシング(ChIP-seq)法に代わる魅力的な代替法です。CUT&RUNは、高スループットの実験セットアップに適しており、ChIP-seqよりもサンプルあたりのシーケンシングコストが低く、ダイナミックレンジが大幅に高くなっています。ここでは、ヒト真菌病原体カン ジダ・アルビカン スにおける転写因子-DNA結合相互作用のゲノムワイド解析用に調整された包括的なCUT&RUNプロトコルおよび付随するデータ解析ワークフローについて説明する。この詳細なプロトコルには、転写因子コード遺伝子のエピトープタグ付けからシーケンシングのためのライブラリー調製まで、必要なすべての実験手順が含まれています。さらに、CUT&RUNデータ分析用にカスタマイズされた計算ワークフローが含まれています。

概要

カンジダ・アルビカンスは、臨床的に関連性のある多型ヒト真菌病原体であり、プランクトン(自由浮遊)成長様式およびバイオフィルム増殖様式として知られる細胞外マトリックスによって保護された強固に接着した細胞のコミュニティなど、様々な異なる成長様式に存在する1,2,3。他の発生および細胞プロセスと同様に、バイオフィルム発生は、配列特異的にDNAに結合する調節転写因子(TF)によって転写レベルで制御されることが知られている重要なC.アルビカンスの病原性形質である4。最近、クロマチン調節因子およびヒストン調節因子もまた、DNAアクセシビリティを媒介することによってC.アルビカンスバイオフィルム形成5および形態形成6の重要な調節因子として浮上している。この重要な真菌病原体の複雑な生物学を理解するためには、明確な発生過程および細胞過程における特定のTFのゲノムワイド局在を決定する効果的な方法が貴重である。

クロマチン免疫沈降とそれに続くシーケンシング(ChIP-seq)は、C. albicans 5,6におけるタンパク質-DNA相互作用を調べるために広く使用されている方法であり、マイクロアレイ(ChIP-chip)9法に続くより古典的なクロマチン免疫沈降法に大きく取って代わっています。しかしながら、ChIP-seq法およびChIPチップ法はいずれも、多数の入力細胞10を必要とし、これは、患者または感染の動物モデルから収集されたバイオフィルムなどの特定のサンプルおよび増殖様式の文脈においてTFを調査する際に複雑な要因となり得る。さらに、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイは、ゲノム全体にかなりの量のバックグラウンドシグナルを生じることが多く、目的の標的がシグナルをノイズから十分に分離するために高レベルの濃縮を必要とする。ChIPチップアッセイは今日では大部分が時代遅れですが、ChIP-seqに必要なシーケンシング深さにより、このアッセイは多くの研究者、特に複数のTFおよび/またはクロマチン関連タンパク質を研究する研究者にとって非常に高価です。

標的下での切断とヌクレアーゼ(CUT&RUN)を用いた放出は、ChIP-seqの魅力的な代替手段です。ChIP-seqとクロマチンの内因性切断の限界を回避し、TFとクロマチン関連タンパク質の高解像度のゲノムワイドマッピングを提供しながら、タンパク質-DNA相互作用をゲノムワイドレベルで同定する別の方法であるChEC-seq 11,12のシーケンシングを行うために、2017年にHenikoff研究所によって開発されました13.CUT&RUNは、連結ミクロコッカスヌクレアーゼを用いた透過処理核内のクロマチンの標的消化に依存し、続いて消化されたDNA断片の配列決定9,10である。DNA断片は、ChIPアッセイのようにランダムな断片化を介してゲノム全体に生成されるのではなく、目的のタンパク質によって結合された遺伝子座で特異的に生成されるため、CUT&RUNアプローチはバックグラウンドシグナルを大幅に低減し、したがって、ChIP-seq 11,13と比較してシーケンシング深さの1/10を必要とします。14。これらの改善は、最終的にシーケンシングコストの大幅な削減と、各サンプルの出発物質として必要な入力セルの総数の削減につながります。

ここでは、バイオフィルムおよびプランクトン培養物から単離された C.アルビカン ス細胞におけるTFのゲノムワイドな局在を決定するために適応および最適化された堅牢なCUT&RUNプロトコルが記載されている。また、結果として得られる配列データの処理と分析を可能にし、コーディングやバイオインフォマティクスに関する最小限の専門知識しか必要としない徹底的なデータ分析パイプラインも提示されます。簡単に言えば、このプロトコルは、TFコード遺伝子のエピトープタグ付け、バイオフィルムおよびプランクトン細胞の採取、無傷の透過処理された核の単離、特定のタンパク質または目的のエピトープタグ付きタンパク質に対する一次抗体とのインキュベーション、キメラA / Gミクロコッカスヌクレアーゼ(pAG-MNase)融合タンパク質の一次抗体へのテザリング、クロマチン消化後のゲノムDNA回収、およびシーケンシングのためのゲノムDNAライブラリーの調製を記述する。

実験的なCUT&RUNプロトコルに続いて、FASTQフォーマットで生のDNAシーケンシング読み取りを行い、必要なすべての処理ステップを実装して、目的のTF(一次抗体によって標的とされる)によって結合された著しく濃縮された遺伝子座の完全なリストを提供する専用のデータ解析パイプラインが続きます。記載されたライブラリ調製プロトコルの複数のステップは、(ヌクレオソームとは対照的に)TFのCUT&RUN分析に特別に適合および最適化されていることに注意してください。この原稿で提示されたデータは、市販のCUT&RUNキットのTF特異的適応を使用して生成されたものですが、これらのプロトコルは、個別に供給されたコンポーネント(すなわち、pAG-MNase酵素および磁気DNA精製ビーズ)および社内で調製されたバッファーを使用して検証されており、実験コストを大幅に削減することができます。包括的な実験およびデータ分析プロトコルは、ステップバイステップの形式で以下に詳細に説明されています。すべての試薬および重要な装置、ならびに緩衝液および培地レシピは、それぞれ 材料表 および 補足ファイル1にリストされています。

プロトコル

1. C. albicans 株のエピトープタグ付け

  1. 目的の遺伝子を、その 1 kb の上流および下流の隣接配列とともに、 Candida Genome Database からプライマー設計ツールにアップロードします ( 材料表を参照)。終止コドンから上流および下流に50 bpを強調表示してガイドRNA(gRNA)を設計し、右側の gRNA選択 ツールをクリックします。[ 設計ガイドと解析ガイド] を選択します。ガイドパラメータには、Ca22(カンジダ・アルビカンス SC5314アセンブリ22(二倍体))ゲノムとNGG(SpCas9、3'側)プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を使用し、「 完了」をクリックします。図1は 、目的の C.アルビカンス 遺伝子を増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)でタグ付けするエピトープのワークフローを記載している。
    1. 以降のページでは、gRNA設計の標的領域を確認し、緑色のボタンを押してください。オン ターゲットスコアでgRNAをソートします。
      注: プライマー設計ツールは、オンターゲットおよびオフターゲットのスコアを計算して、gRNA の特異性を定量化します。理想的なガイドは、オンターゲットスコアが>60、オフターゲットスコアが〜33で、終止コドンと重なります。これにより、GFP統合後のgRNAターゲティングをアブレーションしながら、高いgRNA特異性が可能になる。オフターゲットスコアが〜50のgRNAは対立遺伝子変異を示す。したがって、gRNAによって認識される対立遺伝子は1つだけです。
    2. 配列(5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3')および(5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3')をそれぞれ20 bp gRNA標的配列の5'末端および3'末端に追加し、60 bpのプライマー/オリゴヌクレオチドを作成する。あるいは、20 bp配列をNguyen et al.15によって提供されたgRNA計算機にコピーする。60 bpカスタムgRNAオリゴヌクレオチドを注文する。
    3. ステップ1.1.2から、100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACCCGCGTTTAAACCGCC-3') および 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') で「ユニバーサル B フラグメント」を増幅し、カスタム 60 bp gRNA オリゴヌクレオチド (100 mM) で「ユニークな B フラグメント」を増幅します。鋳型DNAとして、それぞれpADH110(プラスミドリポジトリID#90982)およびpADH139(プラスミドリポジトリID#90987)を用いて、100mM AHO1097(5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3')を用いた。 表1に提供されるPCR反応およびサイクリング条件を使用する。
      注:pADH139は、異種 カンジダ・マルトサLEU2 マーカーを担持する株に特異的である。 C. albicans LEU2 遺伝子の単一コピーを有する株を用いる場合は、pADH139の代わりにpADH119(プラスミドリポジトリID#90985)を置換する。
    4. 1%アガロースゲルで5 μLのPCRをチェックして、増幅が成功したことを確認します。~1 kb のフラグメント アンプリコンと B のフラグメント アンプリコンを探します。
    5. A断片とB断片のそれぞれ1 μLを混合し、 表2 に示すPCR反応およびサイクリング条件を使用してそれらを一緒に縫い合わせて、完全長C断片を作成した。
    6. 0.5 μL の 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') および 0.5 μL の 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') を各 PCR 反応に加え、ピペッティングによりよく混合し、 表 3 に列挙したサイクル条件を完了します。
      注: pADH139 の代わりに pADH119 を使用する場合は、AHO1453 の代わりに AHO1238 (5'-TGTATTTTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') を置き換えてください。
    7. 1%アガロースゲル上で5 μLのPCRをチェックして、C断片の適切なステッチングと増幅を確認します。〜2 kbのアンプリコンを探します。C断片を-20°Cで使用準備が整うまで保存する。
      メモ: ステッチングと増幅の結果、複数の非特異的バンドまたはスミアが発生する場合は、A フラグメントと B フラグメントの PCR クリーンアップを実行し、ステップ 1.1.5 から繰り返します。
  2. プライマー設計ツールを使用して、目的の遺伝子の終止コドンのすぐ上流にCTG最適化された単量体eGFP(RIPLING)16 (pCE1、プラスミドリポジトリID#174434)全体を追加し、C末端翻訳融合を作成した。この構築物を使用して、pCE1からドナーDNA(dDNA)を増幅するためのオリゴヌクレオチドを設計する。
    1. リンカー配列に対して18~22 bpの相同性、オープンリーディングフレーム(ORF)の3'末端に>50 bpの相同性を有するフォワードオリゴヌクレオチドを設計します。
      注: 18 ~ 22 bp の相同性により、増幅用のアニーリング温度が 55 °C ~ 58 °C になります。 全長オリゴヌクレオチドがプライマー二量体を形成する場合は、それに応じてリンカー配列/GFPまたはゲノムとの相同性を調整する。
    2. タグ付けするGFPの3'末端に18〜22 bpの相同性を有し、タグ付けするORFの下流の非コード配列に対して>50 bpの相同性を有する逆オリゴヌクレオチドを作成する。
    3. これらのオリゴヌクレオチドを順序付け、 表4に規定されたタッチダウンPCRサイクル条件を用いてdDNAを増幅した。
  3. 隣接する集積部位を横切って増幅することによってGFPの集積を確認するためのコロニーPCR(cPCR)オリゴヌクレオチドの2組を設計する。まず、プライマー設計ツールを使用してフォワードdDNAオリゴヌクレオチドを選択し、右側の プライマー ボタンをクリックします。
    1. 「 プライマー|の作成」をクリックします。ウィザードの|Tm Param とアルゴリズムが SantaLucia 1998 に設定されていることを確認します。「 選択を使用 」をクリックして、1.2.1で設計されたフォワードオリゴヌクレオチドの座標を標的配列として入力します。
    2. 最適なプライマー温度を55°C、最大アンプリコンサイズを900bpに設定し、右上の 「プライマーを生成 」ボタンをクリックします。
    3. ペナルティスコアが最も低いオリゴヌクレオチドペアを選択し、プライマーが5'集積部位にわたって増幅することを確認します。フォワード cPCR プライマーがフォワード dDNA プライマー配列の上流にあり、リバース cPCR プライマーが eGFP タグまたはリンカー配列内に完全に収まっていることを確認します。
    4. 手順 1.3 ~ 1.3.3 を繰り返します。逆dDNAオリゴヌクレオチドを用いて、3'組み込み部位にわたって増幅するcPCRオリゴヌクレオチドの第2セットを作成した。フォワード cPCR プライマーが eGFP タグまたはリンカー配列内に完全にあり、リバース dDNA プライマー配列の下流のリバース cPCR プライマーがあることを確認します。
    5. これらのオリゴヌクレオチドを順序付ける。
  4. Cas9を含むpADH140の2,500 ng(プラスミドリポジトリID#90988)を、GFPタグを付ける各遺伝子の制限酵素で消化する。各消化の総容量を15μLに設定した。pADH140プラスミド濃度に基づいてそれに応じて水の体積を調整する。 表 5 に指定されている消化条件を使用してください。消化プラスミドを、使用準備が整うまで-20°Cで保存する。
    注: C. albicans LEU2遺伝子の単一コピーで株を形質転換する場合、異種 C. maltosa LEU2 マーカーの代わりに、pADH140の代わりにpADH137(プラスミドリポジトリID#90986)を置換する。
  5. GFPタグが付けられる各遺伝子の10 mg/mLのサケ精子DNA12 μLを99°Cで10分間変性させ、≤4°Cまで急速に冷却する。 使用準備が整うまで-20°Cで保管してください。
  6. C. albicans LEU2ヘミ接合型ヌルセオトリシン感受性株を酵母ペプトンデキストロース(YPD)プレート上にストリークし、30°Cで2日間インキュベートした。
  7. 単一のコロニーを選択し、それを4mLの液体YPDに移す。250rpmで振とうしながら30°Cで12〜16時間インキュベートする。
  8. 使い捨てキュベット(1mL、パス長1cm)を用いて分光光度計で一晩(12〜16時間)培養物の600nm(OD600)における光学密度を測定する。
  9. 一晩培養物を三角フラスコに希釈し、YPDでOD 600を 0.1にする。反応あたり5mLを考慮し、後でOD600 をチェックするために追加の5mLを含める。
    注:培養物の体積は、形質転換反応の数に依存する。
  10. 希釈した一晩培養物を、0.5〜0.8のOD600に達するまで250rpmで振とうしながら30 °Cの振とう培養器内でインキュベートする。
  11. 室温で4,000× g で5分間遠心分離する。上清を取り除いて捨てる。
  12. フィルターチップと混合する穏やかなピペットを介して細胞ペレットを滅菌水1 mLに再懸濁し、滅菌1.5 mLマイクロフュージチューブに移す。
  13. 室温で4,000× g で1分間遠心分離することにより細胞をペレット化する;上清を取り除いて捨てる。1mLの滅菌水に再懸濁し、合計2回の洗浄を繰り返す。
  14. ステップ1.10で使用した容量の1 /100にペレットを再懸濁する。例えば、15mLを使用した場合、ペレットを150μLの滅菌水に再懸濁する。
  15. 形質転換反応ごとに別々のチューブに、50 μLのC断片、50 μLのdDNA、2,500 ngの制限酵素消化pADH140、および10 μLの変性サケ精子DNAを混合する。
  16. ステップ1.14の細胞スラリーを50μL加え、ピペッティングにより混合する。
  17. n + 1変換のプレートミックス(補足ファイル1)のストックを作成します。
  18. プレートミックス1 mLを細胞/DNA混合物に加え、5回反転させて混合する。
    メモ:チューブの底部を反転させながらタップすると、残りの液体が取り除かれます。
  19. この混合物を振とうせずに30°Cで一晩(12〜16時間)インキュベーターに入れる。
  20. セルを水浴中で44°Cで15分間熱衝撃する。
  21. 1.5 mL マイクロフュージチューブを室温で 5,000 × g で 2 分間遠心分離します。
  22. 滅菌ピペットチップを使用して真空吸引によってPLATEミックスを除去し、細胞ペレットを乱さないように注意してください。
  23. 細胞ペレットを1 mLのYPDに再懸濁し、ペレットを室温で4,000× g で1分間遠心分離することにより、上清を除去して廃棄した。2回目の洗浄を繰り返し、細胞ペレットを1 mLのYPDに再懸濁し、懸濁液を、さらに1 mLのYPDを含む10 mLの丸底使い捨て培養チューブ(最終容量2 mL)に移す。250rpmで5時間振とうしながら30°Cで細胞を回収する。
  24. チューブを室温で4,000 × g で5分間遠心分離する。上清を取り除いて捨てる。
  25. 細胞ペレットを100 μLの滅菌水に再懸濁し、200 μg/mLのヌルセオトリシン(NAT200)を添加したYPD上のプレートに戻します。30°Cで2〜3日間インキュベートする。
  26. 96ウェルPCRプレートのウェルに100 μLの20 mM NaOHをアリコートし、各ウェルはNAT200プレート上で増殖した個々のコロニーに対応する。滅菌爪楊枝またはピペットチップを使用して、形質転換されたコロニーの個体をピックし、それらを新しいNAT200プレート上にパッチし、残りの細胞を20mM NaOHを含むウェルに旋回させる。残りのコロニーについて繰り返し、cPCR反応のDNA鋳型として使用される細胞溶解液を作成した。
  27. PCRプレートを密封し、加熱した蓋付きのサーモサイクラー中で99°Cで10分間インキュベートした。
  28. ステップ1.3~1.3.5で設計したオリゴヌクレオチドを用いて2つのcPCR反応を設定します。必要に応じて反応数をスケールアップします。以下のサイクル条件および 表6からPCR反応混合物のステップ1.26で調製した細胞破砕液を用いてPCR反応を行う。各ウェルから10~20 μLを1%アガロースゲル上で実行します。適切に組み込まれたGFP dDNAを示す2つのcPCRプライマーセットの増幅を有するコロニーを探す。
  29. ロイシンを欠く合成完全(SC)培地上にGFPを組み込んだコロニーをリストリークする。30°Cのインキュベーター内で2〜3日間インキュベートする。個々のコロニーをピックし、400μg/mLのヌルセオトリシン(NAT400)プレートを添加したYPDおよびYPDにパッチを当てる。24時間後にNAT400プレート上で増殖に失敗したコロニーを、CRISPR成分を正常に失ったコロニーとして同定する。
  30. YPDパッチプレートの細胞を用いてステップ1.25~1.28を繰り返してGFPタグが保持されていることを確認します。正しいバンドが存在する場合は、ステップ1.7で説明したように、4mLのYPDに接種し、一晩(12〜16時間)成長させます。
  31. 新しいGFPタグ付き株の一晩培養物を、滅菌クライオチューブ中でフィルター滅菌した50%グリセロールと1:1の比率で混合する。-80°Cで保存し、必要に応じてYPDプレートに繰り返します。
    注:GFPタグ付き株を検証するには、蛍光顕微鏡でタグ付きTFの核局在を確認し、適切な表現型アッセイで野生型表現型を確認することをお勧めします。

2. バイオフィルム培養物のサンプル調製

  1. GFPタグ付き株をYPD寒天プレート上にストリーク C.アルビカン スし、30°Cで2〜3日間インキュベートする。寒天プレートから単離されたコロニーを1つ用いて、4mLのYPD液体培地に接種する。30°Cで一晩振とうしながらインキュベートする(12〜16時間)。一晩の培養物のOD600 を決定します。
    注: CUT&RUN実験では、サンプルごとに3つの生物学的反復を使用することをお勧めします。
  2. 滅菌 12 ウェル未処理細胞培養プレートに一晩培養し、ロズウェルパーク記念研究所 (RPMI)-1640 培地で最終 OD 600 0.5 (2 ×107 cells/mL に相当) の最終容量 2 mL に接種します。250rpmで振とうしながらマイクロプレートインキュベーター内で37°Cで90分間インキュベートする。
    注:培地単独汚染制御として、1株につき12ウェルの細胞培養プレートを1つのウェル非接種で使用することをお勧めします。このプロトコルは、12ウェル細胞培養プレートウェルの1/10(またはわずか500万個の細胞)を使用して首尾よく適用されています。より多くの細胞を使用すると、総DNA収量が増加し、通常、高品質のシーケンシングライブラリが得られます。
  3. 真空トラップ装置に可撓性プラスチックチューブを介して取り付けられた滅菌ピペットチップを使用して吸引によって未接着細胞を除去する。接着細胞を滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)2mLで1回洗浄する。2 mLの新鮮なRPMI-1640培地をウェルに加え、250rpmで振とうしながら37°Cで24時間インキュベートする。
    注:異なる株および/または条件のウェル間でピペットチップを交換してください。吸引しながら先端で井戸の底をこすらないでください。
  4. 24時間のインキュベーションの終わりに、11個の接種ウェルのそれぞれから液体およびバイオフィルム材料を収集し、単一の滅菌50mL円錐形チューブにプールする。複数のひずみ条件または成長条件を同時に処理する場合は、独立プールで必要に応じて繰り返します。
    メモ: 各ウェルの底部と端をピペットフィルターチップでこすり、表面に付着したままの細胞を取り除きます。ピペットを使用してバイオフィルムを均質化します。
  5. ペレットサンプルは、室温で4,000× g で5分間遠心分離することにより得られる。できるだけ多くの上清をデカントし、ペレットの破壊を最小限に抑えるように注意する。ペレットを液体窒素中で急速凍結し、回収直後に-80°Cで保存するか、またはそのまま工程4(核の単離)に継続する。

3. プランクトン培養物のサンプル調製

  1. GFPタグ付き株をYPD寒天プレート上にストリーク C.アルビカン スし、30°Cで2〜3日間インキュベートする。寒天プレートから単離されたコロニーを1つ用いて、4mLのYPD液体培地に接種する。30°Cで一晩振とうしながらインキュベートする(12〜16時間)。一晩の培養物のOD600 を決定します。
  2. 50mLのRPMI-1640液体培地中で0.1のOD600に一晩戻希釈し、OD600が0.5〜0.8の間になるまで225rpmで振とうしながら30°Cで2〜5時間インキュベートする。
    注:細胞は、回収される前に少なくとも2つの倍加を通過する必要があります。プランクトン培養に用いる条件は、必要に応じて調整することができる。
  3. 4,000 × g で室温で5分間遠心分離することによりサンプルをペレット化する。できるだけ多くの上清をデカントし、ペレットの破壊を最小限に抑えるように注意する。ペレットを液体窒素中で急速凍結し、回収直後に-80°Cで保存するか、またはそのまま工程4(核の単離)に継続する。

4. 原子核の単離

注:実験当日に、新鮮なFicollバッファーを調製し、再懸濁バッファーのアリコートに2-メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害剤を添加し、SPCバッファーのアリコートにプロテアーゼ阻害剤を追加します( 補足ファイル1を参照)。ペレットを再懸濁するには、細胞または核の損傷を避けるために、200 μLまたは1 mLのピペットチップのいずれかを使用して静かにピペットします。核の単離を開始する前に、ヒートブロックをオンにして30°Cに予熱してください。 このプロトコルの残りの部分のすべてのピペットチップとチューブは、DNA/RNAおよびDNase/RNaseフリーの認証を受ける必要があり、その後のすべてのピペッティングステップではフィルターチップの使用をお勧めします。

  1. ペレットを1 mLの室温再懸濁バッファーに再懸濁し、滅菌1.5 mLマイクロフュージチューブに移します。ペレットを室温で2,000× g で卓上遠心分離機で2分間、上清を除去した。
    注:ペレットの破壊を最小限に抑えるように注意しながら、200 μLまたは1 mLのピペットチップを使用して上清を除去します。
  2. ペレットを200 μLの室温再懸濁バッファーに再懸濁する。再懸濁したペレットから、5 μLアリコートを新しいPCRチューブに移し、後で使用するために4°Cで保存します。
    注: このアリコートは、分離された原子核の品質を評価するための後続の品質管理ステップで制御として使用されます。
  3. ペレットを2,000× g で2分間、ピペットを用いて上清を除去して廃棄した。200 μLの再懸濁バッファーを使用して洗浄ステップを2回繰り返します。
  4. 室温で2,000× g で2分間遠心分離し、上清を除去した。300 μLの再懸濁バッファーと10 μLのリチカーゼ溶液(50 mg/mL、 材料表を参照)を加える。ヒートブロック中で30°Cで30分間インキュベートする。
    メモ:または、ヒートブロックの代わりに30°Cに加熱されたウォーターバスを使用することもできます。ここで使用されるスフェロプラスティング条件は、 C. albicansの酵母細胞および菌糸細胞の両方に有効であるように最適化されている。このプロトコルを細胞壁の完全性または他の細胞形態に影響を与える突然変異を有する C. albicans 細胞に適用する場合、スフェロプラスティング条件を最適化することが推奨される。この30分のインキュベーションステップ中に、ユーザーは時間を節約するためにステップ5(Concanavalin Aビーズ活性化)を事前に完了するオプションがあります。
    1. 重要なステップ:30分間のインキュベーションステップの後、5 μLのアリコートを新しいPCRチューブに移します。工程4.2から4°Cで保存した5 μLの単離核と5 μLの無傷細胞アリコートに、1 μLのカルコフルオールホワイト(蛍光細胞壁色素)と1 μLのSYTO 13(核酸染色)を加えます。暗所で30°Cで30分間インキュベートする。
    2. 蛍光顕微鏡を用いて単離された核の完全性および純度を目視で検査する。(488-509nm励起フィルターを使用して)顕著に染色された無傷の核を示す単離された核を探し、カルコフルア白色色素による細胞壁染色がないことを確認します(390-420nm励起フィルターを使用)。インタクトな対照細胞において、カルコフルア白色色素(390-420nm励起フィルターを使用)および染色されたインタクト核(488-509nm励起フィルターを使用)による顕著な細胞壁染色を探す。
  5. 2,000 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを500 μLの氷冷再懸濁バッファーに再懸濁し、1 mLフィルターチップを使用して、5回静かに上下にピペッティングします。2,000 × g で4°Cで5分間遠心分離し、1 mLピペットを用いて上清を除去した。ペレットを、作りたての氷冷フィコール緩衝液1mLで再懸濁する。
    注:この時点からサンプルとバッファーを氷の上に保管してください。
  6. サンプルを5,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを500 μLの氷冷SPCバッファーに再懸濁する。
    注: この時点から、原子核の損傷を避けるために、原子核を非常に優しく扱ってください。
  7. サンプルを5,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上清を除去します。ペレット状の核を含むチューブを氷の上に置き、ステップ5に進む。ステップ 4.4 でステップ 5 が既に完了している場合は、ステップ 6 に進むか、ペレットを液体窒素でスナップフリーズし、回収直後に -80 °C で保管します。

5.コンカナバリンAビーズ活性化

メモ: これは重要な手順です。この時点から、ユーザーは市販のCUT&RUNキットを使用してプロトコルを続行するか、主要コンポーネントを個別にソースし、社内でバッファを準備するかを選択できます。市販のキットを使用する場合、特に断りのない限り、以下で用いる全ての緩衝液及び試薬がキットに含まれる。試薬を独立して調達するための個々のカタログ番号も 材料表に記載されています。使用前にすべてのバッファーを氷の上で冷やしてください。ステップ 5 が完了したら、すぐにステップ 6 に進むことをお勧めします。単離された核の複数回の凍結融解は、DNA損傷を増加させることが知られており、質の悪い結果につながる可能性があるため、避けてください。

  1. ピペットを用いてコンカナバリンA(ConA)ビーズを穏やかに再懸濁する。処理するサンプルあたり 22 μL の ConA ビーズ懸濁液を 1 本の 1.5 mL マイクロフュージチューブに移します。ビーズスラリーが透明になるまでチューブを磁気ラックの上に置きます。ピペットを用いて上清を除去し、廃棄する。
    注:合計10サンプルに対してCUT&RUNを実行する場合、例えば、220μLのConAビーズ懸濁液を1.5mLマイクロフュージチューブに移す。
  2. ConAビーズを入れたチューブを磁気ラックから取り出し、直ちに氷冷ビーズ活性化バッファー200 μLを加え、ピペットで軽く混ぜ合わせます。ビーズスラリーが透明になるまでチューブを磁気ラックの上に置きます。ピペットを用いて上清を除去し、廃棄する。この手順を繰り返して、合計 2 回の洗浄を行います。
  3. 処理する核のサンプルあたり、ビーズを 22 μL の氷冷ビーズ活性化バッファーに再懸濁します。必要になるまでビーズを氷の上に保管してください。
    メモ: 後続のステップのスループットは、使用可能な磁気チューブラックの数と容量によって異なります。2つの16ウェルチューブラックで32サンプルを処理することは、このプロトコルのほとんどのユーザーにとって管理可能な数です。しかし、より経験豊富なユーザーや、ロボットリキッドハンドリングシステムが利用可能な場合は、より高いスループットが可能です。

6. 活性化ビーズへの結合核

注:使用前にすべてのバッファーを氷上で冷やしてください。プロテアーゼ阻害剤を添加したすべての緩衝液は、実験当日に新鮮に調製すべきである。後続の手順では、0.2 mLストリップチューブを使用することをお勧めします。

  1. ステップ 4 でペレット化した核を 100 μL の氷冷 SPC バッファーに再懸濁し、新しい 8 チューブ 0.2 mL ストリップに移します。活性化ビーズ20 μLを各サンプルに加え、ピペットで軽く混合します。攪拌せずに室温で10分間インキュベートする。
  2. スラリーが透明になるまでチューブを磁気ラックの上に置きます。ピペットを用いて上清を除去し、廃棄する。磁気ラックからチューブを取り出し、各サンプルに200 μLの氷冷洗浄バッファーを追加します。ビーズを5回上下に軽くピペッティングして再懸濁します。各サンプルから100 μLアリコートを新しい8チューブ0.2 mLストリップに移します。
    1. 重要なステップ: 各 CUT&RUN サンプルを 2 つの別々のアリコートに分割します。一方のアリコートを陰性対照用抗体(例えば、IgG陰性対照抗体)に、他方を標的抗体用標的タンパク質(例えば、抗GFP抗体)に使用する。
      メモ: 両方のサンプルは、計算パイプラインが対象のTFに固有のエンリッチメント信号を正確に識別するために必要です。タグなし株を有する抗GFP抗体を用いたさらなる対照もまた、実施され得る。この対照は、GFPタグ付き株におけるIgG抗体の使用に匹敵する結果を示した。したがって、簡単にするために、すべての実験に標準のIgGコントロールを使用することが推奨される。

7. 一次抗体結合

注:pAG-MNase融合タンパク質は、ウサギ、ヤギ、ロバ、モルモット、およびマウスIgG抗体によく結合する17。一般に、ほとんどの市販のChIP-seq認定市販抗体は、CUT&RUN手順と互換性があります。使用される一次抗体の量は、抗体の効率に依存し、目的の抗体がChIPまたはCUT&RUN実験で以前に試験されていない場合、抗体の滴定(例えば、1:50、1:100、1:200、および1:400の最終希釈)が必要な場合があります。使用前に氷上のすべてのバッファーを冷やしてください。抗体結合ステップに使用されるすべての緩衝液は、実験当日に新鮮に調製されるべきである。

  1. チューブを磁気ラックの上に置き、スラリーが完全に透明になるまで待ちます。ピペットを用いて上清を除去し、廃棄する。50 μLの抗体バッファーを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。
  2. 抗GFPポリクローナル抗体を3 μL(または未試験の抗体を使用する場合は0.5 μg)加える。チューブをナッティングミキサー上で4°Cで2時間インキュベートする。
    注:一部のCUT&RUNプロトコルは、pAG-MNase添加前に二次抗体を添加することによって収量が増加したと報告している14;しかし、この追加ステップを使用して有意な改善は観察されなかったため、このプロトコルには含まれません。
  3. チューブを室温で100× g で5秒間短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置き、スラリーが透明になったら、ピペットを用いて上澄み液を除去して廃棄する。ビーズを入れたチューブがまだ磁気ラック上にある間に、200 μLの氷冷細胞透過処理バッファーをビーズに直接加えます。ピペットを用いて上清を取り出し、廃棄する。氷冷細胞透過処理バッファーで合計 2 回の洗浄を繰り返します。
  4. 各チューブに50 μLの氷冷細胞透過処理バッファーを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。
    注:ビーズはこの時点で凝集することがよくありますが、200 μLのピペットを使用して穏やかに混合することで簡単に分散できます。

8. pAG-MNaseの抗体への結合

  1. 各サンプルに2.5 μLのpAG-Mnase(20倍ストック)を加え、ピペッティングにより穏やかに混合する。サンプル(約45°の角度でわずかに上昇)を4°Cのヌテーターの上に置きます。 ヌテーターの電源を入れ、サンプルを1時間インキュベートします。
  2. ストリップチューブを室温で100× g で5秒間短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置き、スラリーが透明になったら、ピペットを使用して上清を除去して廃棄する。
    メモ: この手順は非常に重要です。このステップの後にチューブのキャップまたは側面に残留するキャリーオーバー抗体は、バックグラウンドシグナルの量を有意に増加させるであろう。
  3. ビーズを入れたチューブがまだ磁気ラック上にある間に、200 μLの氷冷細胞透過処理バッファーを加え、スラリーを透明にし、ピペットを使用して上清を除去して廃棄します。この手順を繰り返して、細胞透過処理バッファーで合計 2 回洗浄します。
  4. 100 μLの氷冷細胞透過処理バッファーをサンプルに加え、静かにピペットを5回上下させます。

9. 標的クロマチンの消化と放出

  1. サンプルを入れたチューブを湿った氷浴で5分間インキュベートします。マルチチャンネルピペットを用いて各サンプルに3 μLの100 mMCaCl2 を加える。穏やかにピペットを上下5回、直ちにチューブを湿氷浴に戻し、30分間インキュベートした。
  2. 各サンプルに66 μLのストップバッファーを加え、穏やかに渦を吹いて混合します。サンプルを乾燥浴中で37°Cで10分間インキュベートする。
    注: ストップバッファーには、サンプルあたり 1.5 pg の異種 大腸菌 スパイクイン DNA を添加することをお勧めします。1.5 pgの 大腸菌 スパイクインDNAを添加すると、1,000万~1,000万回のマッピングされた実験的リードに対して1,000~10,000回のマッピングされたスパイクイン読み取りがもたらされます14。スパイクインDNAは、シーケンシングの深さを較正するために使用され、一連のサンプルを比較するために特に重要です。スパイクイン 大腸菌 の添加は強く推奨されますが、必須ではありません。市販のCUT&RUNキットには 大腸菌 スパイクインDNAが含まれていますが、別途購入することもできます。
  3. チューブを磁気ラックの上に置き、上清160 μLを1.5 mLマイクロフュージチューブに移します。80 μL のサンプルを新しい 2 mL マイクロフュージチューブに移し、バックアップサンプルが必要になった場合は -20 °C で保存します。80 μL のサンプルを使用してステップ 10 に進みます。

10. 採取したDNAサンプルのクリーンアップ

注:使用前に、DNA精製ビーズを室温で30分間インキュベートしてください。氷上で100%イソプロパノールをプレチルする。サンプルを混合するときは、ピペットを10回上下させる。

  1. 渦DNA精製ビーズは、ビーズ懸濁液を均質化する。各サンプルに50 μL(約0.6倍のサンプル容量)の再懸濁ビーズを追加します。ピペットミックスし、サンプルをヌテーター上で室温で5分間インキュベートする。
    注:使用されるサンプルに対するDNA精製ビーズの比率は重要です。サンプルに対して0.6倍の量のDNA精製ビーズ溶液を使用すると、磁気ビーズを損傷核から放出された大きなDNA断片に結合することができます。CUT&RUNで富化されたDNA断片は、これらの大きなDNA断片よりもはるかに小さいため、この段階で上清中に保持されます。
  2. チューブを磁気ラックの上に置き、DNAを含む上清130 μLを0.2 mLの8チューブストリップに移します。さらに30 μLのDNA精製ビーズをサンプルに加えます(総容量は160 μLです)。
  3. 氷冷100%イソプロパノールを170 μL(約1倍のサンプル量)加え、上下に10回ピペッティングしてよく混ぜ合わせ、氷上で10分間インキュベートします。
    注:DNA精製ビーズがCUT&RUNで濃縮された小さな断片を効率的に捕捉するために、このステップに100%氷冷イソプロパノールを使用することが重要です。
  4. チューブを磁気ラックの上に置き、スラリーが片付いたら、ピペットを使用して上澄み液を慎重に取り出して廃棄します。
  5. チューブを磁気ラックの上に置いた状態で、新しく調製した室温の80%エタノール200 μLをチューブに追加し、室温で30秒間インキュベートします。上澄み液を慎重に取り出し、ピペットで捨てます。このステップを繰り返し、80%エタノールで合計2回洗浄します。
  6. チューブを100 × gで素早く回転させ、チューブを磁気ラックに戻し、スラリーがクリアされたらピペットを使用して残留エタノールを除去します。チューブが蓋を開けたまま磁気ラックに残っている間、ビーズを5分間空気乾燥させます。
    注: 乾燥時間が 5 分を超えないようにすると、最終的な DNA 収率が大幅に低下する可能性があります。
  7. 磁気ラックからチューブを取り出し、pH 8で0.1x Tris-EDTA(TE)を17 μL加えてビーズからDNAを溶出します。よく混ぜ合わせ、チューブを室温で5分間インキュベートする。
  8. スラリーが透明になるまで、チューブを磁気ラックの上に置きます。スラリーがクリアされたら、15 μLの上清を滅菌0.2 mL PCRチューブに慎重に移します。
  9. 採取したDNAの濃度を、製造元のプロトコールに従って蛍光光度計を用いて測定する。
    注:通常、収集されたDNAの濃度は約1ng/μLです。場合によっては、収集されたDNAの濃度が低すぎて蛍光光度計を使用して定量できない場合があります。これは、失敗した実験の指標ではありません。採取したDNAの濃度に関係なくライブラリー調製を続行する。
  10. ステップ 11 に進むか、準備ができるまでサンプルを -20 °C で保管します。

11. シーケンシングのためのライブラリ準備

メモ: 次の手順では、市販のライブラリ準備キットを使用します。ライゲーションマスターミックスを使用して手順を実行する場合は、チューブに触れるのを最小限に抑え、常に氷の上に置いてください。

  1. pH 8 で 0.1x TE を使用して、CUT&RUN DNA の全容量を 50 μL に引き上げます。サンプルあたり、3 μL のエンド分取酵素ミックスと 7 μL のエンド分取反応バッファーのマスターミックスを作成します。マスターミックス10 μLをCUT&RUN DNAに加え、上下5回ピペッティングして十分にミックスします。
  2. 100 × gでクイックスピンを行い、チューブの側面からすべての液体を収集します。加熱した蓋を≥75°Cに設定したサーモサイクラーにチューブを置き、 表7のサイクル条件を実行した。
    注: ステップ 10 から収集された開始入力 DNA 濃度に応じて、 表 8 の必要なアダプター希釈に従います。
  3. サンプルあたり2.5 μLのアダプターを加え、上下に10回ピペッティングして十分に混合します。
    注:ライゲーションマスターミックスを追加する前に、アダプターをサンプルに添加し、完全に混合することが重要です。
  4. 30 μL のライゲーションマスターミックスと 1 μL のライゲーションエンハンサーのマスターミックスを作成します。31 μLのマスターミックスをサンプルに加えます。上下10回ピペッティングしてよく混ぜる。
  5. 加熱した蓋を外した状態でサーモサイクラー中で20°Cで15分間インキュベートする。
    注:サンプルを氷上に保管し、サーモサイクラーが20°Cに達した後にのみサーモサイクラーに移すことが重要です。
  6. 100 × gでクイックスピンを行い、チューブの側面からすべての液体を集め、ウラシル切除酵素を3 μL加え、加熱した蓋を≥47°Cに設定して37°Cで15分間サーモサイクラーでチューブをインキュベートします。
    注: これは安全な停止点です。サンプルを-20°Cで保存するか、ステップ11.7に直接進んでください。ステップ11.7に直接続行する場合は、使用前にDNA精製ビーズを室温で30分間インキュベートする。
  7. 154.4 μL(約1.6倍サンプル量)のDNA精製ビーズをステップ11.6のアダプターライゲーション反応に加えます。ピペットミックスし、サンプルを室温で5分間インキュベートした。
  8. チューブを磁気ラックの上に置き、スラリーがクリアしたら、ピペットを使用して上澄み液を慎重に取り出して廃棄します。
  9. 新しく調製した室温80%エタノール200 μLをチューブに加え、室温で30秒間インキュベートする。ピペットを使用して上清を慎重に除去して廃棄し、この手順を繰り返して、80%エタノールで合計2回洗浄します。
  10. チューブを 100 × g で短時間回転 させます。チューブを磁気ラックに戻し、ピペットを使用して残留エタノールを除去します。チューブが蓋を開けたまま磁気ラックに残っている間、ビーズを5分間空気乾燥させます。
    注: 乾燥時間が 5 分を超えないようにすると、最終的な DNA 収率が大幅に低下する可能性があります。
  11. 磁気ラックからチューブを取り出し、pH 8で0.1x TEを17 μL加えてビーズからDNAを溶出します。よく混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートする。
  12. スラリーが透明になるまで、チューブを磁気ラックの上に置きます。スラリーがクリアされたら、15 μLの上清を滅菌0.2 mL PCRチューブに慎重に移します。
  13. サンプルあたり 25 μL の DNA ポリメラーゼマスターミックスと 5 μL のユニバーサルフォワードライブラリ増幅プライマー (10 μM) のマスターミックスを作成します。
    メモ: ピペッティング損失を考慮して、マスターミックスのサンプルを 1 つ追加で準備します。
  14. 15 μL のアダプターライゲーション DNA サンプルに 30 μL のマスターミックスを追加します。各サンプルに5 μLの逆ユニークインデックスライブラリ増幅プライマー(10 μM)を加え、最終容量を合計50 μLにします。 表9のPCRサイクル条件を行う。
    注:使用前にDNA精製ビーズを室温で30分間インキュベートしてください。
  15. DNA浄化ビーズを渦巻きにして再サスペンドさせる。35 μL(約0.7倍サンプル量)の再懸濁ビーズをPCR増幅DNAサンプルに加える。サンプルを混合し、ヌテーター上で室温で5分間インキュベートする。
  16. チューブを磁気ラックの上に置き、スラリーが透明になったら、DNAを含む上清を新しい0.2 mL 8ウェルPCRストリップチューブに移します。
  17. サンプルに119 μL(約1.4倍のサンプル量)のビーズを加え、上下に5回ピペッティングして混合します。試料をヌテーター上で室温で5分間インキュベートする。
  18. チューブを磁気ラックの上に置き、スラリーがクリアしたら、ピペットを使用して上澄み液を慎重に取り出して廃棄します。
  19. 新しく調製した室温80%エタノール200 μLをチューブに加え、室温で30秒間インキュベートする。慎重にピペットを使用して上清を除去し、廃棄します;80%エタノールで合計2回の洗浄についてステップを繰り返す。
  20. チューブを 100 × g で短時間回転 させます。チューブを磁気ラックに戻し、ピペットを使用して残留エタノールを除去します。チューブが蓋を開けたまま磁気ラックに残っている間、ビーズを5分間空気乾燥させます。
    注: 乾燥時間が 5 分を超えないようにすると、最終的な DNA 収率が大幅に低下する可能性があります。
  21. 磁気ラックからチューブを取り出し、pH 8 で 0.1x TE を 14 μL 加えることによってビーズから DNA を溶出します。よく混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートする。
  22. スラリーが透明になるまで、チューブを磁気ラックの上に置きます。スラリーがクリアされたら、13 μLの上清を滅菌0.2 mL PCRチューブに慎重に移します。
  23. 新鮮な1xトリスホウ酸塩-EDTA(TBE)を準備し、既製の市販の10%アクリルアミドTBEゲルを1x TBEで満たされたゲル電気泳動装置に挿入する。
  24. 最初のウェルに、2 μL の低レンジ DNA ラダーを追加します。3 μL の 6x ローディング色素と、ステップ 11.22 から以前に収集したサンプル 13 μL を混ぜます。ゲルの各ウェルに15μLを慎重に加える。ゲルを70Vで90分間実行します。
    注: 各サンプル間でゲル内の 1 つのウェルを空のままにしておくことをお勧めします。これは、サンプルの交差汚染の可能性が低くなるためです。経験豊富なユーザーは、特に多数のサンプルを処理する場合、交差汚染を慎重に避けながら、すべてのウェルを使用することが適切であると感じるかもしれません。
  25. ゲルキャストをゲルボックスから取り出します。製造元の指示に従ってゲルキャストを開き、ゲルキャストからゲルを静かに取り出し、100mLの1x TBEを含むゲル保持トレイに入れます。
    メモ: ゲルが薄くて壊れやすいので破れないように、ゲルキャストからゲルを静かに取り除かないでください。ゲルを取り扱うときはいつでも、プリウェット手袋と1x TBEのゲルを使用することが重要です。ゲル保持トレイは、ゲルのサイズ(両側に約0.5インチ)よりわずかに大きくする必要があります。96ウェルPCRチューブ収納ボックスを備えたプラスチック製の蓋は、標準的なミニゲルサイズ用の便利な保持トレイです。
  26. 10 μLの核酸ゲル染色剤をトレイに加え、静かに旋回させる。ホイルで覆い、光から保護し、室温で10分間静的にインキュベートします。
  27. ゲルを100mLの脱イオン水道水で2回すすいでください。青色光照射下でゲルを画像化するには、オレンジ色のフィルターカバーを使用します(図2)。
    注: 成功したライブラリは、100 ~ 500 bp のスミアを示します。また、〜125アダプタダイマーバンドも目立ちます。アダプター・ダイマーの存在は、ライブラリー品質の低下の指標にはなりません。この量のアダプター二量体は、存在量の少ないTFに対して実施されるCUT&RUN実験では避けられず、これらのライブラリーの調製に使用される入力材料の量が少ない結果である。DNAを損傷する可能性のある紫外線を使用しないでください。
  28. 図2に示すように、ライブラリごとに、約125 bpの目立つアダプターダイマーバンドの少し上(アダプターダイマーバンドに触れないようにしてください)、および400 bpのラダーマークより下にゲルをカットします。
    メモ: ~125 アダプタのダイマーバンドは避けることが重要です。少量のアダプタダイマーでも、ライブラリの品質が大幅に低下します。
  29. 22 G 針を使用して 0.65 mL チューブの底部を穿刺し、滅菌 2 mL マイクロフュージチューブ内に穿刺チューブを置きます。ゲルスライスを2mLマイクロフュージチューブ内の穿刺チューブに移す。
  30. 65 mLの穿刺チューブを入れた2 mLマイクロフュージチューブを室温で10,000 × g で試料を2分間遠心分離し、2 mLマイクロフュージチューブ内部のゲルスラリーを回収した。
    メモ: 穿刺されたチューブは空になり、破棄できます。穿刺したチューブの内部にまだゲルが残っている場合は、穿刺したチューブを2 mLマイクロフュージチューブの内部に戻し、室温で10,000 × g でさらに2分間再び遠心分離します。
  31. 2mLマイクロフュージチューブ内のゲルスラリーに、300μLの氷冷ゲル溶出バッファーを添加し、室温で最低3時間または一晩(12〜16時間)ヌテーター上で混合する。
  32. すべての液体およびゲルスラリーを0.22μmフィルターカラムに移します。室温で10,000× g で1分間遠心分離する。収集された容量は〜300μLでなければならない。
  33. 450 μL(約1.5倍サンプル量)のDNA精製ビーズを加え、ヌテーター上で室温で5分間インキュベートし、スラリーが透明になるまでサンプルを磁気ラックに置きます。
    注:使用前にDNA精製ビーズを室温で30分間インキュベートしてください。
  34. 500 μLの上清を取り出して廃棄し、ビーズを乱さないようにしてください。
  35. 磁気ラックからサンプルを取り出し、ビーズを上下に5回ピペッティングして混合します。サンプル 200 μL を新しい PCR ストリップチューブに移します。
  36. ストリップチューブを磁気ラックの上に置き、スラリーがクリアしたら、ピペットを使用して上澄み液を慎重に取り出して廃棄します。
  37. 新しく調製した室温80%エタノール200 μLをチューブに加え、室温で30秒間インキュベートする。慎重にピペットを使用して上清を除去し、廃棄します;このステップを繰り返し、80%エタノールで合計2回洗浄する。
  38. チューブを 100 × g で短時間回転 させます。チューブを磁気ラックに戻し、ピペットを使用して残留エタノールを除去します。チューブが蓋を開けたまま磁気ラックに留まっている間に、ビーズを最大5分間空気乾燥させます。
    注: 乾燥時間が 5 分を超えないようにすると、最終的な DNA 収率が大幅に低下する可能性があります。
  39. 磁気ラックからチューブを取り出し、pH 8で0.1x TEを17 μL加えてビーズからDNAを溶出します。よく混ぜ合わせ、チューブを室温で5分間インキュベートする。
  40. スラリーが透明になるまで、チューブを磁気ラックの上に置きます。スラリーがクリアされたら、15 μLの上清を滅菌0.2 mL PCRチューブに慎重に移します。
  41. 蛍光光度計を使用して最終的なライブラリ量を測定します。この最後のライブラリをシーケンスに使用します。
    メモ: 少なくとも 3 億個の 40 bp 以上のペアエンド読み取りを提供するシーケンシングプラットフォームを使用して、最大 48 個のライブラリを 1 つのレーンにプールしてシーケンシングできます。

12. カット&ランシーケンス解析

メモ: このセクションでは、CUT&RUN シーケンスデータの解析に使用される計算プロトコルについて説明します。このプロトコルは、計算仮想環境の設定から始まり、ローカルマシンでコマンドを実行する手順をユーザーに説明します。このプロトコルは、ローカルマシン、仮想クラウドサーバー、ハイパフォーマンスコンピューティングクラスターなど、すべての計算リソースで動作します。本稿で紹介するすべてのCUT&RUNデータは、NCBI GEOからアクセッション番号GSE193803でアクセスできます。

  1. CUT&RUN 解析のソース コードを https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis からダウンロードします。
    メモ: このワークフローは、MacOS または Linux OS システムで最適に動作します。Windows ユーザーは、GitBash を使用してワークフローを実行できます ( 資料表を参照)。
    1. GitHub ページからコードを直接ダウンロードするには、緑色の [ コード ] ボタンをクリックして| ZIPオプションをダウンロードし ます。フォルダーをローカル コンピューター上の関連する場所に解凍します。
  2. Conda 環境をインストールし ( 材料表を参照)、1 回だけ実行します。
    メモ: このワークフローでは、Conda コマンドラインツール環境を使用して、必要なすべてのソフトウェアとツールをインストールします。
  3. Conda がインストールされたら (1 回だけ実行)、次のコマンドで提供される 補足ファイル 2 を使用して仮想環境を作成します。
    conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
  4. このワークフローを実行するたびに、以下を使用して仮想環境をアクティブ化します。
    conda activate
  5. 入力生の FASTQ ファイルを 1 つのフォルダー (理想的には CUT&RUN 実験ごとに 1 つのフォルダー) に整理します。

13. アライメントのためのゲノムファイルの生成

  1. アライメント用のゲノムファイルを生成します(ゲノムファイルごとに1回だけ実行します)。次のようなすべての C. albicans ゲノムファイルを保存するフォルダを作成します。
    mkdir ca_genome_files

14. C. アルビカンスの ゲノムアセンブリのダウンロード 21

  1. カンジダゲノムデータベースから、wgetまたはcurlツール(材料表を参照)を使用してC. albicansゲノムアセンブリ21をダウンロードしてください。
    注: C. albicans アセンブリ 21 は、CUT&RUN の結果と、アセンブリ 21 にアライメントされた以前に公開された ChIP チップの結果を比較するために、ここで使用されました。ユーザーは、他のアセンブリバージョンをダウンロードし、同様のコマンドを実行して、アライメントのニーズに関連するゲノムファイルを生成できます。

15. ボウタイ2インデックスデータベース(データベース名:ca21)を生成する

  1. 以下を使用します。
    蝶ネクタイ2ビルドC_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
    蝶ネクタイ2検査-s ca21

16. CUT&RUN 解析パイプラインの実行

  1. ヘルプ セクションを読んで、パイプラインのパラメーターについて理解を深めてください。
    bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. 関連するパラメータを指定してcut_n_run_pipeline.shファイルを実行します。

  1. スクリプトを実行します。
    bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
    注: コードの 19 行目から 36 行目に詳細な説明がある関連パラメーターについては、GitHub ページ https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh で説明されています。

18. 出力ファイルを整理する

  1. BedTools マージ関数19 を使用して、/path/to/input/folder/peakcalling/macs2 にある MACS2 によって呼び出されたすべての複製から重要なピークをマージします。
    cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sort -k1,1 -k2,2n |mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last,mean,first,mean,mean,mean > /path/to/merged_output.bed
    注: 複製サンプルの重複するピークの評価に関する追加情報とベスト プラクティスについては、Landt et al.20 および Boyd et al.21 を参照してください。

19. BedTools減算関数を使用してブロックリストされたゲノム領域への一致を削除する

  1. 以下を使用します: 減算ベッド -a /パス/へ/merged_output.ベッド -b /パス/へ/Supplementary_File_3.ベッド -A > /パス/へ/merged_output_no_blocklist_hits.ベッド
    注: C. albicans ゲノム中のブロックリスト領域は、 補足ファイル3に.bedファイルとして提供されている。このリストは主に、高度に反復的な配列要素と、テロメア反復やセントロメアなどの領域で構成されており、 C. albicans CUT&RUN、ChIP-seq、およびChIPチップデータセットで一般的に偽陽性の結果をもたらします。したがって、ブロックリスト領域を削除することをお勧めします。しかしながら、特定のタンパク質標的について、これらの遺伝子座を除外することは不適切または望ましくない場合がある。ユーザーはこの手順をスキップして、これらのブロックリスト領域内に含まれる信号を保持したり、独自のブロックリスト領域を作成したりできます。

20. UCSC bigWigMerge 関数を使用したレプリケートからの BigWig ファイルのマージ22

  1. bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig /all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
  2. UCSC bedGraphToBigWig 関数を使用して、BedGraph 出力を bigWigMerge から BigWig に変換します。
    bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

結果

この堅牢なCUT&RUNプロトコルは、 C. albicans バイオフィルムおよびプランクトン培養物における特定のTFのゲノムワイド局在を調査するために適応および最適化されました(実験アプローチの概要については 図2 を参照)。結果のCUT&RUNシーケンシングデータの分析を容易にするために、徹底的なデータ分析パイプラインも含まれており、コーディングやバイオインフォ...

ディスカッション

このプロトコルは、C. albicansにおける調節TFのゲノムワイド局在化のための包括的な実験的および計算的パイプラインを提示する。標準的な微生物学および分子生物学のトレーニングを受けている人なら誰でも非常にアクセスしやすいように設計されています。CUT&RUNアッセイの高ダイナミックレンジと低サンプルインプット要件を活用し、C. albicansバイオフィルムおよびプランク...

開示事項

Clarissa J. Nobileは、バイオフィルム感染症の診断および治療薬を開発するBioSynesis, Inc.の共同設立者です。

謝辞

NobileとHerndayの研究室の過去と現在のすべてのメンバーに、原稿に関するフィードバックに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)の国立一般医科学研究所(NIGMS)の賞番号R35GM124594と、C.J.N.に寄贈された椅子の形でカマンガル家によって支援されました。この研究は、NIH国立アレルギー感染症研究所(NIAID)の賞番号R15AI137975からADh..C.L.E.まで、NIH国立歯科頭蓋顔面研究所(NIDCR)フェローシップ番号F31DE028488によっても支援されました。コンテンツは著者の単独の責任であり、資金提供者の見解を表すものではありません。資金提供者は研究の設計において何の役割も持たなかった。データの収集、分析、または解釈において。原稿の執筆において。または結果を公開する決定で。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm filterMillipore SigmaSLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubesVWR490003-190
1 M CaCl2Fisher Scientific50-152-341
1 M PIPESFisher ScientificAAJ61224AK
12-well untreated cell culture platesCorning351143
2-mercaptoethanolSigma-Aldrich60-24-2
2% DigitoninFisher ScientificCHR103MI
50 mL conical tubesVWR89039-658
5x phusion HF bufferFisher ScientificF530SItem part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
AgarCriterionC5001
Agencourt AMPure XP magnetic beadsBeckman CoulterA63880
Agilent BioanalyzerAgilentG2939BAReferred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport ScientificVWR89133-910
Bacto peptoneBD Biosciences211677
Benchling primer design toolBenchlinghttps://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
BetaineFisher ScientificAAJ77507AB
Calcofluor white stainSigma-Aldrich18909-100ML-F
Candida Genome Databasehttp://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beadsPolysciences 86057-3
Conda softwarehttps://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl toolhttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kitEpicypher14-1048Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)New England BiolabsN0447S
Dextrose (D-glucose)Fisher ScientificD163
Difco D-mannitol BD Biosciences217020
Disposable cuvettesFisher Scientific14-955-127
Disposable transfer pipetsFisher Scientific13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)Fisher ScientificR0611
DreamTaq green DNA polymeraseFisher ScientificEP0713Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase bufferFisher ScientificEP0713Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNAEpicypher18-1401
ELMI Microplate incubatorELMITRMS-04Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction BufferItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proofVWR89125-170
FastDigest MssIFisher ScientificFD1344Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI BufferFisher ScientificFD1344Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400Fisher BioReagentsBP525-25
Fluorescence microscopeUser-dependent
Gel electrophoresis apparatusUser-dependent
GeneRuler low range DNA ladderFisher ScientificFERSM1192
GitBash workflowhttps://gitforwindows.org/
GitHub source codehttps://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5Boston BioProductsBBH-75-K
High-speed centrifugeUser-dependent
IsopropanolSigma-AldrichPX1830-4
Lens paperVWR52846-001
Ligation EnhancerItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrateMP Biomedicals215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibodyTakara632592User-dependent
MACS2https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubesEpicypher10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubesFisher ScientificMR02
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometerBioTekEPOCH2TCReferred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiViewhttp://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPSSigma-AldrichM3183
NaClVWR470302-522
NaOHFisher ScientificS318-500
NCBI GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kitNew England BiolabsE7645SReferred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)GoldbioN-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 wellFisher ScientificEC62755BOX
Nutating mixerVWR82007-202
Nutrient brothCriterionC6471
pADH110Addgene90982Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119Addgene90985Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137Addgene90986Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139Addgene90987Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140Addgene90988Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNaseEpicypher15-1016 or 15-111650 rxn or 250 rxn
pCE1Addgene174434Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lidFisher ScientificFB0875712
Phusion high fidelity DNA polymeraseFisher ScientificF530SReferred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350VWR10791-816
Potassium phosphate monobasicFisher ScientificP285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kitInvitrogenQ33230
Qubit fluorometerLife TechnologiesQ33216Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibodyEpicypher13-0042
RNase ASigma-Aldrich10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tabletsSigma-Aldrich5056489001
RPMI-1640Sigma-AldrichR6504
Shaking incubatorEppendorfM12820004User-dependent
SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
Spin-X centrifuge tube filtersFisher Scientific07-200-385
Sterile inoculating loopsVWR30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stainFisher ScientificS11494
SYTO 13 nucleic acid stainFisher ScientificS7575Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
ThermocyclerUser-dependent
ThermoMixer CEppendorf5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethaneSigma-Aldrich252859-100G
Ultra II Ligation Master MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solutionInvitrogen15632011
USER EnzymeItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixerVWR10153-834
wget toolhttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Yeast extractCriterionC7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)Fisher ScientificNC0439194

参考文献

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