Profilazione a livello di genoma delle interazioni di legame tra fattore di trascrizione e DNA in Candida albicans: un metodo CUT&RUN completo e un flusso di lavoro di analisi dei dati

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo sperimentale e un flusso di lavoro di analisi dei dati per la scissione sotto bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi (CUT & RUN) nel patogeno fungino umano Candida albicans.

Abstract

I fattori di trascrizione regolatori controllano molti importanti processi biologici, tra cui la differenziazione cellulare, le risposte alle perturbazioni e agli stress ambientali e le interazioni ospite-patogeno. Determinare il legame genome-wide dei fattori di trascrizione regolatori al DNA è essenziale per comprendere la funzione dei fattori di trascrizione in questi processi biologici spesso complessi. La scissione sotto bersagli e il rilascio mediante nucleasi (CUT&RUN) è un metodo moderno per la mappatura a livello di genoma delle interazioni di legame proteina-DNA in vivo che è un'alternativa interessante all'immunoprecipitazione della cromatina tradizionale e ampiamente utilizzata seguita dal metodo di sequenziamento (ChIP-seq). CUT&RUN è suscettibile di una configurazione sperimentale a throughput più elevato e ha una gamma dinamica sostanzialmente più elevata con costi di sequenziamento per campione inferiori rispetto a ChIP-seq. Qui, vengono descritti un protocollo CUT&RUN completo e un flusso di lavoro di analisi dei dati di accompagnamento su misura per l'analisi a livello di genoma delle interazioni di legame tra fattore di trascrizione e DNA nel patogeno fungino umano Candida albicans . Questo protocollo dettagliato include tutte le procedure sperimentali necessarie, dall'epitopo tagging dei geni codificanti il fattore di trascrizione alla preparazione della libreria per il sequenziamento; inoltre, include un flusso di lavoro computazionale personalizzato per l'analisi dei dati CUT&RUN.

Introduzione

La Candida albicans è un patogeno fungino umano polimorfico clinicamente rilevante che esiste in una varietà di diverse modalità di crescita, come la modalità di crescita planctonica (fluttuante) e come comunità di cellule strettamente aderenti protette da una matrice extracellulare, nota come modalità di crescita del biofilm ^1,2,3. Simile ad altri processi di sviluppo e cellulari, lo sviluppo del biofilm è un importante tratto di virulenza di C. albicans che è noto per essere controllato a livello trascrizionale da fattori di trascrizione regolatori (TF) che si legano al DNA in modo specifico per sequenza⁴. Recentemente, i regolatori della cromatina e i modificatori degli istoni sono emersi anche come importanti regolatori della formazione del biofilm di C. albicans ⁵ e della morfogenesi⁶ mediando l'accessibilità del DNA. Per comprendere la complessa biologia di questo importante agente patogeno fungino, sono preziosi metodi efficaci per determinare la localizzazione a livello di genoma di specifici TF durante distinti processi di sviluppo e cellulari.

L'immunoprecipitazione della cromatina seguita dal sequenziamento (ChIP-seq) è un metodo ampiamente utilizzato per studiare le interazioni proteina-DNA in C. albicans ^5,6 e ha ampiamente sostituito la più classica immunoprecipitazione della cromatina seguita dal metodo microarray (ChIP-chip)⁹. Entrambi i metodi ChIP-seq e ChIP-chip, tuttavia, richiedono un gran numero di cellule di input¹⁰, che può essere un fattore di complicazione quando si studiano i TF nel contesto di campioni specifici e modalità di crescita, come biofilm raccolti da pazienti o modelli animali di infezione. Inoltre, il test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) spesso produce una quantità significativa di segnale di fondo in tutto il genoma, richiedendo un alto livello di arricchimento per il bersaglio di interesse per separare sufficientemente il segnale dal rumore. Mentre il test ChIP-chip è in gran parte obsoleto oggi, le profondità di sequenziamento necessarie per ChIP-seq rendono questo test proibitivo per molti ricercatori, in particolare quelli che studiano più TF e / o proteine associate alla cromatina.

La scissione sotto bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi (CUT&RUN) è un'alternativa interessante a ChIP-seq. È stato sviluppato dal laboratorio Henikoff nel 2017 per aggirare le limitazioni della scissione endogena di ChIP-seq e cromatina seguita dal sequenziamento di ChEC-seq^11,12, un altro metodo per identificare le interazioni proteina-DNA a livello di genoma, fornendo al contempo una mappatura ad alta risoluzione a livello di genoma di TF e proteine associate alla cromatina¹³ . CUT&RUN si basa sulla digestione mirata della cromatina all'interno di nuclei permeabilizzati utilizzando nucleasi micrococciche legate, seguita dal sequenziamento dei frammenti di DNA digeriti ^9,10. Poiché i frammenti di DNA sono specificamente generati nei loci che sono legati da una proteina di interesse, piuttosto che essere generati in tutto il genoma tramite frammentazione casuale come nei saggi ChIP, l'approccio CUT&RUN si traduce in segnali di fondo notevolmente ridotti e, quindi, richiede 1/^{10 della} profondità di sequenziamento rispetto a ChIP-seq^{11,13, 14}. Questi miglioramenti alla fine portano a significative riduzioni dei costi di sequenziamento e riduzioni del numero totale di celle di input necessarie come materiale di partenza per ciascun campione.

Qui, viene descritto un robusto protocollo CUT&RUN che è stato adattato e ottimizzato per determinare la localizzazione a livello di genoma di TF in cellule C. albicans isolate da biofilm e colture planctoniche. Viene inoltre presentata una pipeline di analisi dei dati approfondita, che consente l'elaborazione e l'analisi dei dati di sequenza risultanti e richiede agli utenti di avere un'esperienza minima nella codifica o nella bioinformatica. In breve, questo protocollo descrive l'epitopo tagging di geni codificanti TF, la raccolta di biofilm e cellule planctoniche, l'isolamento di nuclei permeabilizzati intatti, l'incubazione con anticorpi primari contro la proteina specifica o la proteina marcata con epitopi di interesse, il tethering delle proteine di fusione chimerica A/G-micrococcica (pAG-MNasi) agli anticorpi primari, il recupero del DNA genomico dopo la digestione della cromatina e la preparazione di librerie di DNA genomico per il sequenziamento.

Il protocollo sperimentale CUT&RUN è seguito da una pipeline di analisi dei dati appositamente costruita, che prende le letture del sequenziamento del DNA grezzo in formato FASTQ e implementa tutte le fasi di elaborazione necessarie per fornire un elenco completo di loci significativamente arricchiti legati dal TF di interesse (mirato dall'anticorpo primario). Si noti che più passaggi del protocollo di preparazione della libreria descritto sono stati specificamente adattati e ottimizzati per l'analisi CUT&RUN dei TF (al contrario dei nucleosomi). Mentre i dati presentati in questo manoscritto sono stati generati utilizzando adattamenti specifici per TF di un kit COMMERCIALE CUT & RUN, questi protocolli sono stati anche convalidati utilizzando componenti di provenienza individuale (ad esempio, enzima pAG-MNasi e perle di purificazione del DNA magnetico) e tamponi preparati internamente, che possono ridurre significativamente i costi sperimentali. I protocolli sperimentali e di analisi dei dati completi sono descritti in dettaglio di seguito in un formato passo-passo. Tutti i reagenti e le apparecchiature critiche, nonché le ricette tampone e di supporto, sono elencati rispettivamente nella Tabella dei materiali e nel File supplementare 1.

Protocollo

1. Epitopo Tagging di ceppi di C. albicans

1. Carica il gene di interesse, insieme alle sue sequenze di fiancheggiamento a monte e a valle di 1 kb, dal Candida Genome Database allo strumento di progettazione del primer (vedi la Tabella dei materiali). Progettare un RNA guida (gRNA) evidenziando 50 bp a monte e a valle del codone di arresto e fare clic sullo strumento di selezione del gRNA a destra. Selezionare Progetta e analizza guide. Utilizzare il genoma Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) e un motivo adiacente protospacer NGG (SpCas9, 3' side) per i parametri guida e fare clic su Fine. La Figura 1 descrive il flusso di lavoro per l'epitopo che tagga un gene di interesse di C. albicans con una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP).
   1. Nella pagina successiva, confermare la regione di destinazione per la progettazione del gRNA e premere il pulsante verde. Ordina i gRNA in base al punteggio On-Target.
      NOTA: lo strumento di progettazione del primer calcola i punteggi on-target e off-target per quantificare la specificità dei gRNA. Una guida ideale ha un punteggio on-target di >60, un punteggio off-target di ~ 33 e si sovrappone al codone di stop. Ciò consente un'elevata specificità del gRNA durante l'ablating gRNA targeting dopo l'integrazione GFP. Un gRNA con un punteggio fuori bersaglio di ~50 indica una variazione allelica; quindi, solo un allele sarà riconosciuto dal gRNA.
   2. Aggiungere le sequenze (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') e (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') alle estremità 5' e 3', rispettivamente, della sequenza bersaglio gRNA 20 bp, creando un primer/oligonucleotide a 60 bp. In alternativa, copiare la sequenza di 20 bp sul calcolatore di gRNA fornito da Nguyen et ^al.15. Ordina l'oligonucleotide gRNA personalizzato da 60 bp.
   3. Amplificare il "frammento A universale" con 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') e 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') e il "frammento B unico" con l'oligonucleotide gRNA personalizzato da 60 bp (100 mM) dal passo 1.1.2. e 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3') utilizzando pADH110 (plasmid repository ID# 90982) e pADH139 (plasmid repository ID# 90987), rispettivamente, come modello di DNA. Utilizzare la reazione PCR e le condizioni di ciclo fornite nella Tabella 1.
      NOTA: pADH139 è specifico per i ceppi che portano il marcatore eterologo Candida maltosa LEU2 . Se si utilizza un ceppo con una singola copia del gene LEU2 di C. albicans , sostituire pADH119 (plasmid repository ID # 90985) al posto di pADH139.
   4. Confermare l'amplificazione riuscita controllando 5 μL della PCR su un gel di agarosio all'1%. Cerca ~1 kb A e B frammenti amplicons.
   5. Mescolare 1 μL ciascuno di frammenti A e B e cucirli insieme usando la reazione PCR e le condizioni di ciclo fornite nella Tabella 2 per creare un frammento C a lunghezza intera.
   6. Aggiungere 0,5 μL di 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') e 0,5 μL di 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCGACAATCG-3') a ciascuna reazione PCR, mescolare bene mediante pipettaggio e completare le condizioni di ciclo elencate nella Tabella 3.
      NOTA: se si utilizza pADH119 al posto di pADH139, sostituire AHO1238 (5'-TGTATTTTGTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') al posto di AHO1453.
   7. Confermare la corretta cucitura e amplificazione del frammento C controllando 5 μL della PCR su un gel di agarosio all'1%. Cerca un amplicon ~ 2 kb. Conservare il frammento C a -20 °C fino al momento dell'uso.
      NOTA: se la cucitura e l'amplificazione provocano bande multiple o sbavature non specifiche, eseguire una pulizia PCR dei frammenti A e B e ripetere dal passaggio 1.1.5.
2. Aggiungi l'intero eGFP monomerico ottimizzato per CTG con linker sequence (RIPLING)¹⁶ (pCE1, plasmid repository ID# 174434) immediatamente a monte del codone di arresto del gene di interesse utilizzando lo strumento di progettazione del primer, creando una fusione traslazionale C-terminale. Utilizzare questo costrutto per progettare oligonucleotidi per amplificare il DNA del donatore (dDNA) da pCE1.
   1. Progettare un oligonucleotide in avanti con omologia 18-22 bp alla sequenza linker e omologia >50 bp all'estremità 3' del frame di lettura aperto (ORF).
      NOTA: L'omologia 18-22 bp crea una temperatura di ricottura per l'amplificazione compresa tra 55 °C e 58 °C. Se l'oligonucleotide a lunghezza intera forma dimeri di primer, regolare l'omologia alla sequenza linker/GFP o al genoma di conseguenza.
   2. Creare un oligonucleotide inverso con omologia 18-22 bp all'estremità 3' di GFP e omologia >50 bp alla sequenza non codificante a valle dell'ORF da taggare.
   3. Ordina questi oligonucleotidi e amplifica il dDNA usando le condizioni di ciclo PCR di touchdown fornite nella Tabella 4.
3. Progettare due serie di oligonucleotidi PCR (cPCR) di colonia per confermare l'integrazione della GFP amplificandola attraverso i siti di integrazione fiancheggianti. Innanzitutto, seleziona l'oligonucleotide dDNA in avanti utilizzando lo strumento di progettazione del primer e fai clic sul pulsante Primer a destra.
   1. Fai clic su Crea | di primer | della procedura guidata Tm Param e confermare che l'algoritmo è impostato su SantaLucia 1998. Fate clic su Usa selezione (Use Selection ) per immettere le coordinate dell'oligonucleotide in avanti progettato in 1.2.1 come sequenza di destinazione.
   2. Impostare la temperatura ottimale del primer a 55 °C e la dimensione massima dell'amplicon a 900 bp, quindi fare clic sul pulsante Genera primer in alto a destra.
   3. Selezionare la coppia di oligonucleotidi con il punteggio di penalità più basso e confermare che i primer si amplificano attraverso il sito di integrazione 5'. Assicurarsi che il primer cPCR in avanti si trovi a monte della sequenza di primer dDNA in avanti e il primer cPCR inverso completamente all'interno del tag eGFP o della sequenza linker.
   4. Ripetere i passaggi 1.3-1.3.3. con l'oligonucleotide dDNA inverso per creare il secondo set di oligonucleotidi cPCR che si amplificano attraverso il sito di integrazione 3'. Assicurarsi che il primer cPCR anteriore si trovi interamente all'interno del tag eGFP o della sequenza del linker e del primer cPCR inverso a valle della sequenza di primer dDNA inverso.
   5. Ordina questi oligonucleotidi.
4. Digerire 2.500 ng di pADH140, che contiene Cas9 (plasmid repository ID # 90988), con enzima di restrizione per ogni gene da etichettare con GFP. Impostare il volume totale di ciascuna digestione a 15 μL; regolare il volume d'acqua di conseguenza in base alla concentrazione di plasmidi pADH140. Utilizzare le condizioni di digestione specificate nella Tabella 5. Conservare il plasmide digerito a -20 °C fino al momento dell'uso.
   NOTA: Se si trasforma un ceppo con una singola copia del gene LEU2 di C. albicans , invece del marcatore eterologo C. maltosa LEU2 , sostituire pADH137 (plasmid repository ID # 90986) al posto di pADH140.
5. Denaturare 12 μL di DNA di spermatozoi di salmone da 10 mg/mL per ciascun gene che sarà marcato con GFP a 99 °C per 10 minuti e si raffredderà rapidamente fino a ≤4 °C. Conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
6. Strisciare un ceppo emizigote leutico C. albicans LEU2 sensibile alla nourseotricina su piastre di destrosio peptone di lievito (YPD) e incubare a 30 °C per due giorni.
7. Selezionare una singola colonia e trasferirla in 4 ml di YPD liquido. Incubare per 12-16 ore a 30 °C con agitazione a 250 giri/min.
8. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) della coltura notturna (12-16 h) in uno spettrofotometro utilizzando una cuvetta monouso (1 mL, lunghezza del percorso di 1 cm).
9. Diluire la coltura notturna in un pallone Erlenmeyer a un OD₆₀₀ di 0,1 in YPD. Rappresentare 5 ml per reazione e includere altri 5 ml per controllare l'OD_{600 in un} secondo momento.
   NOTA: il volume della coltura dipende dal numero di reazioni di trasformazione.
10. Incubare la coltura notturna diluita in un incubatore vibrante a 30 °C con agitazione a 250 giri/min fino a raggiungere un OD₆₀₀ di 0,5-0,8.
11. Centrifuga a 4.000 × g a temperatura ambiente per 5 min; rimuovere ed eliminare il surnatante.
12. Risospendare il pellet cellulare in 1 mL di acqua sterile mediante una delicata miscelazione a pipetta con punte filtranti e trasferire in un tubo di microfuga sterile da 1,5 ml.
13. Pellet le celle mediante centrifugazione a 4.000 × g a temperatura ambiente per 1 min; rimuovere ed eliminare il surnatante. Sospendere in 1 mL di acqua sterile e ripetere per un totale di due lavaggi.
14. Risospesare il pellet in 1/^{100 °} del volume utilizzato nella fase 1.10. Ad esempio, se sono stati utilizzati 15 mL, risospesare il pellet in 150 μL di acqua sterile.
15. In un tubo separato per ogni reazione di trasformazione, mescolare 50 μL di frammento C, 50 μL di dDNA, 2.500 ng di pADH140 digerito dall'enzima di restrizione e 10 μL di DNA di spermatozoi di salmone denaturato.
16. Aggiungere 50 μL di liquame cellulare dal punto 1.14 e mescolare mediante pipettaggio.
17. Fare una scorta della miscela di piastre (File supplementare 1) per n + 1 trasformazioni.
18. Aggiungere 1 mL della miscela di piastre alla miscela cellula/DNA e mescolare invertendo 5 volte.
    NOTA: Toccare il fondo dei tubi mentre si inverte per rimuovere il liquido rimanente.
19. Mettere la miscela in un incubatore a 30 °C durante la notte (12-16 h) senza agitare.
20. Shock termico delle celle per 15 minuti a 44 °C a bagnomaria.
21. Centrifugare i tubi microfuga da 1,5 mL a 5.000 × g a temperatura ambiente per 2 min.
22. Rimuovere la miscela PLATE mediante aspirazione sottovuoto utilizzando punte di pipette sterili, facendo attenzione ad evitare di disturbare il pellet cellulare.
23. Risospesare il pellet cellulare in 1 mL di YPD, pellet per centrifugazione a 4.000 × g a temperatura ambiente per 1 minuto e rimuovere ed eliminare il surnatante. Ripetere per un secondo lavaggio, risospescere il pellet cellulare in 1 mL di YPD e trasferire la sospensione su un tubo di coltura monouso a fondo tondo da 10 mL contenente un ulteriore 1 mL di YPD (2 mL di volume finale). Recuperare le celle a 30 °C con agitazione a 250 giri/min per 5 h.
24. Centrifugare i tubi a 4.000 × g a temperatura ambiente per 5 min; rimuovere ed eliminare il surnatante.
25. Sospendere il pellet cellulare in 100 μL di acqua sterile e piastra su YPD integrato con 200 μg/mL di nourseotricina (NAT200). Incubare a 30 °C per 2-3 giorni.
26. Aliquota 100 μL di 20 mM NaOH nei pozzetti di una piastra PCR a 96 pozzetti, con ogni pozzetto corrispondente a una singola colonia che è cresciuta sulle placche NAT200. Usando uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta, scegli le singole colonie trasformate, rattoppale su una nuova piastra NAT200 e fai roteare le cellule rimanenti in un pozzo con 20 mM NaOH. Ripetere per le colonie rimanenti per creare il lisato cellulare usato come modello di DNA per la reazione cPCR.
27. Sigillare la piastra PCR e incubare per 10 minuti a 99 °C in un termociclatore con coperchio riscaldato.
28. Impostare due reazioni cPCR con gli oligonucleotidi progettati nei passaggi 1.3-1.3.5. Aumenta il numero di reazioni in base alle esigenze. Eseguire la reazione PCR con il lisato cellulare preparato nella fase 1.26 dopo le condizioni di ciclo e le miscele di reazione PCR della Tabella 6. Eseguire 10-20 μL da ciascun pozzetto su un gel di agarosio all'1%. Cerca colonie con amplificazione dei due set di primer cPCR che indicano il dDNA GFP correttamente incorporato.
29. Colonie di Restreak che incorporavano GFP su mezzi sintetici completi (SC) privi di leucina. Incubare in un incubatore a 30 °C per 2-3 giorni. Scegli le singole colonie e applica il cerotto su YPD e YPD integrati con piastre di nourseotricina (NAT400) da 400 μg/ mL. Identificare le colonie che non riescono a crescere su piastre NAT400 dopo 24 ore come quelle che hanno perso con successo i componenti CRISPR.
30. Verificare che il tag GFP venga mantenuto ripetendo i passaggi 1.25-1.28 utilizzando le celle della patch plate YPD. Se sono presenti le bande corrette, inoculare in 4 mL di YPD e crescere durante la notte (12-16 h), come descritto al punto 1.7.
31. Mescolare la coltura notturna del nuovo ceppo con tag GFP con glicerolo al 50% sterilizzato con filtro in un rapporto 1:1 in un criotubo sterile. Conservare a -80 °C e riposare su piastre YPD secondo necessità.
    NOTA: Si raccomanda di convalidare i ceppi marcati con GFP confermando la localizzazione nucleare del TF marcato tramite microscopia fluorescente e confermando un fenotipo wild-type in un test fenotipico appropriato.

2. Preparazione del campione di colture di biofilm

1. Strisciare I ceppi marcati con C. albicans GFP su piastre di agar YPD e incubare a 30 °C per 2-3 giorni. Utilizzando una singola colonia isolata dalla piastra di agar, inoculare in 4 ml di mezzo liquido YPD. Incubare a 30 °C con agitazione notturna (12-16 h). Determinare l'OD₆₀₀ delle colture notturne.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare tre repliche biologiche per campione per gli esperimenti CUT&RUN.
2. Inoculare una piastra sterile di coltura cellulare non trattata a 12 pozzetti con la coltura notturna a un OD₆₀₀ finale di 0,5 (equivalente a 2 × 10⁷ cellule / mL) nel Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medio a un volume finale di 2 ml. Incubare per 90 minuti a 37 °C in un incubatore a micropiastre con agitazione a 250 giri/min.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti per ceppo con un pozzetto non articolato come controllo della contaminazione medio-solo. Questo protocollo è stato applicato con successo utilizzando un^{minimo di 1} /10 di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti (o un minimo di 5 milioni di cellule). L'utilizzo di un numero maggiore di cellule aumenta la resa totale del DNA, il che in genere si traduce in librerie di sequenziamento di alta qualità.
3. Rimuovere le cellule non ereditate mediante aspirazione utilizzando punte di pipette sterili attaccate tramite tubi di plastica flessibili a un apparecchio a trappola sottovuoto. Lavare le cellule aderenti una volta con 2 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere 2 mL di mezzo fresco RPMI-1640 ai pozzetti e incubare per 24 ore a 37 °C con agitazione a 250 giri/min.
   NOTA: Cambiare le punte delle pipette tra pozzetti di diverse varietà e/o condizioni. Non raschiare il fondo del pozzetto con la punta durante l'aspirazione.
4. Al termine dell'incubazione di 24 ore, raccogliere e raggruppare il materiale liquido e biofilm da ciascuno degli 11 pozzetti inoculati in un unico tubo conico sterile da 50 ml. Ripetere se necessario con pool indipendenti se si elaborano contemporaneamente più di un ceppo o di una condizione di crescita.
   NOTA: raschiare il fondo e i bordi di ciascun pozzetto con una punta del filtro a pipetta per rimuovere le celle che rimangono aderenti alla superficie. Utilizzare la pipetta per omogeneizzare i biofilm.
5. Campioni di pellet mediante centrifugazione a 4.000 × g a temperatura ambiente per 5 min. Decantare il più possibile il surnatante, avendo cura di ridurre al minimo l'interruzione del pellet. Congelare a scatto il pellet in azoto liquido e conservare a -80 °C subito dopo la raccolta o continuare direttamente alla fase 4 (isolamento dei nuclei).

3. Preparazione del campione di colture planctoniche

1. Strisciare I ceppi marcati con C. albicans GFP su piastre di agar YPD e incubare a 30 °C per 2-3 giorni. Utilizzando una singola colonia isolata dalla piastra di agar, inoculare in 4 ml di mezzo liquido YPD. Incubare a 30 °C con agitazione notturna (12-16 h). Determinare l'OD₆₀₀ delle colture notturne.
2. Risciacquare le colture notturne a OD₆₀₀ di 0,1 in 50 mL di terreno liquido RPMI-1640 e incubare a 30 °C con agitazione a 225 rpm per 2-5 h fino a quando OD₆₀₀ è compreso tra 0,5 e 0,8.
   NOTA: le cellule devono passare attraverso almeno due raddoppi prima di essere raccolte. Le condizioni utilizzate per le colture planctoniche possono essere regolate secondo necessità.
3. Pellet i campioni mediante centrifugazione a 4.000 × g a temperatura ambiente per 5 min. Decantare il più possibile il surnatante, avendo cura di ridurre al minimo l'interruzione del pellet. Congelare a scatto il pellet in azoto liquido e conservare a -80 °C subito dopo la raccolta o continuare direttamente alla fase 4 (isolamento dei nuclei).

4. Isolamento dei nuclei

NOTA: il giorno dell'esperimento, preparare il tampone Ficoll fresco, aggiungere il 2-mercaptoetanolo e l'inibitore della proteasi alle aliquote del tampone di risospensione e aggiungere l'inibitore della proteasi alle aliquote del tampone SPC (vedere il file supplementare 1). Per risospescere il pellet, pipettare delicatamente utilizzando punte di pipetta da 200 μL o 1 mL per evitare di danneggiare le cellule o i nuclei. Prima di iniziare l'isolamento dei nuclei, accendere il blocco di calore per preriscaldarlo a 30 °C. Tutte le punte e i tubi delle pipette per il resto di questo protocollo devono essere certificati DNA/RNA e privi di DNasi/RNasi e l'uso di punte filtranti è raccomandato per tutte le successive fasi di pipettaggio.

1. Risospesso pellet in 1 mL di tampone di risospensione a temperatura ambiente e trasferire in un tubo sterile da 1,5 mL di microfuga. Pellet a 2.000 × g a temperatura ambiente per 2 minuti in una centrifuga da tavolo e rimuovere il surnatante.
   NOTA: Rimuovere il surnatante utilizzando la punta della pipetta da 200 μL o 1 mL, avendo cura di ridurre al minimo l'interruzione del pellet.
2. Risospesare il/i pellet/i in 200 μL di tampone di risospensione a temperatura ambiente. Dal pellet risospeso, trasferire un'aliquota da 5 μL in un nuovo tubo PCR e conservarla a 4 °C per utilizzarla successivamente.
   NOTA: Questa aliquota verrà utilizzata come controllo durante una successiva fase di controllo qualità per valutare la qualità dei nuclei isolati.
3. Pellet a 2.000 × g per 2 minuti e rimuovere e scartare il surnatante usando una pipetta. Ripetere la fase di lavaggio due volte utilizzando 200 μL di Resuspension Buffer.
4. Centrifugare a 2.000 × g a temperatura ambiente per 2 minuti e rimuovere il surnatante. Aggiungere 300 μL di tampone di risospensione e 10 μL di soluzione di liticasi (50 mg/ml, vedere la tabella dei materiali). Incubare per 30 minuti a 30 °C in un blocco termico.
   NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare anche un bagno d'acqua riscaldato a 30 °C al posto di un blocco termico. Le condizioni di sferoplastica utilizzate qui sono state ottimizzate per essere efficaci sia per il lievito che per le cellule ifali di C. albicans. Si raccomanda di ottimizzare le condizioni di sferoplastica quando si applica questo protocollo alle cellule di C. albicans con mutazioni che influiscono sull'integrità della parete cellulare o su altre morfologie cellulari. Durante questa fase di incubazione di 30 minuti, l'utente ha la possibilità di completare il passaggio 5 (Attivazione di Concanavalin A Bead) in anticipo per risparmiare tempo.
   1. FASE CRITICA: Dopo la fase di incubazione di 30 minuti, trasferire un'aliquota di 5 μL in un nuovo tubo PCR. Ai 5 μL di nuclei isolati e all'aliquota di 5 μL di cellule intatte conservate a 4 °C dal punto 4.2, aggiungere 1 μL di calcofluor bianco (un colorante fluorescente per la parete cellulare) e 1 μL di SYTO 13 (una colorazione di acido nucleico). Incubare a 30 °C al buio per 30 min.
   2. Ispezionare visivamente l'integrità e la purezza dei nuclei isolati utilizzando un microscopio a fluorescenza. Cercare nuclei isolati che mostrino nuclei intatti ben visibili (utilizzando un filtro di eccitazione a 488-509 nm) e assicurarsi che non vi sia alcuna colorazione della parete cellulare da parte del colorante bianco calcofluor (utilizzando un filtro di eccitazione a 390-420 nm). Nelle celle di controllo intatte, cercare la colorazione prominente della parete cellulare dal colorante bianco calcofluor (usando un filtro di eccitazione da 390-420 nm) e nuclei intatti colorati (usando un filtro di eccitazione da 488-509 nm).
5. Centrifugare a 2.000 × g a 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendare il pellet in 500 μL di tampone di risospensione ghiacciato utilizzando 1 mL di punte filtranti pipettando delicatamente su e giù 5 volte. Centrifugare a 2.000 × g a 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta da 1 mL. Risospendare il pellet con 1 mL di Ficoll Buffer ghiacciato appena fatto.
   NOTA: Tenere i campioni e i tamponi sul ghiaccio da questo punto in avanti.
6. Centrifugare i campioni a 5.000 × g a 4 °C per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Risospesare il pellet in 500 μL di SPC Buffer ghiacciato.
   NOTA: Da questo punto in poi, maneggiare i nuclei con estrema delicatezza per evitare di danneggiarli.
7. Centrifugare i campioni a 5.000 × g a 4 °C per 10 minuti e rimuovere il più possibile il surnatante senza interrompere il pellet. Posizionare i tubi contenenti i nuclei pellettati sul ghiaccio e procedere al passaggio 5. Se il passaggio 5 è già stato completato in anticipo nel passaggio 4.4, procedere al passaggio 6 o congelare a scatto i pellet in azoto liquido e conservarli a -80 °C immediatamente dopo la raccolta.

5. Attivazione del tallone di Concanavalin A

NOTA: questo è un passaggio critico. Da questo momento in poi, gli utenti hanno la possibilità di continuare con il protocollo utilizzando un kit CUT&RUN disponibile in commercio o componenti chiave sorgente singolarmente e preparare i buffer internamente. Se si utilizza il kit commerciale, tutti i tamponi e i reagenti utilizzati di seguito sono inclusi nel kit, se non diversamente specificato. I singoli numeri di catalogo per l'approvvigionamento indipendente dei reagenti sono forniti anche nella Tabella dei materiali. Raffreddare tutti i tamponi sul ghiaccio prima dell'uso. Una volta completato il passaggio 5, si consiglia di procedere immediatamente al passaggio 6. Evitare lo scongelamento multiplo di nuclei isolati in quanto è noto per aumentare il danno al DNA e potrebbe portare a risultati di scarsa qualità.

1. Risospendare delicatamente le perle di concanavalina A (ConA) usando una pipetta. Trasferire 22 μL di sospensione di perline ConA per campione da trattare in un singolo tubo di microfuga da 1,5 mL. Posizionare il tubo su un rack magnetico fino a quando il liquame di perline è chiaro; rimuovere e scartare il surnatante usando una pipetta.
   NOTA: quando si esegue CUT&RUN per un totale di 10 campioni, ad esempio, trasferire 220 μL della sospensione del tallone ConA in un tubo di microfuga da 1,5 mL.
2. Rimuovere il tubo contenente le perline ConA dal rack magnetico e aggiungere immediatamente 200 μL di Bead Activation Buffer ghiacciato e mescolare delicatamente con una pipetta. Posizionare il tubo sul rack magnetico fino a quando il liquame del tallone non è chiaro; rimuovere e scartare il surnatante usando una pipetta. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi.
3. Risospesare le perline in 22 μL di Bead Activation Buffer ghiacciato per campione di nuclei da elaborare. Tenere le perline sul ghiaccio fino a quando necessario.
   NOTA: la produttività dei passaggi successivi dipende dal numero e dalla capacità dei rack magnetici per tubi disponibili. L'elaborazione di 32 campioni in due rack tubolari a 16 pozzetti è un numero gestibile per la maggior parte degli utenti di questo protocollo. Tuttavia, una maggiore produttività è possibile per gli utenti più esperti o se sono disponibili sistemi robotici di gestione dei liquidi.

6. Legare i nuclei alle perline attivate

NOTA: Raffreddare tutti i tamponi sul ghiaccio prima dell'uso. Tutti i tamponi integrati con inibitori della proteasi devono essere preparati freschi il giorno dell'esperimento. Si consiglia di utilizzare tubi a strisce da 0,2 ml nei passaggi successivi.

1. Risospesso i nuclei pellettati dalla fase 4 in 100 μL di tampone SPC ghiacciato e trasferirli in una nuova striscia da 0,2 mL a 8 tubi. Aggiungere 20 μL di perline attivate a ciascun campione e pipettare delicatamente per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti senza agitazione.
2. Posizionare i tubi sul rack magnetico fino a quando il liquame non è chiaro; rimuovere e scartare il surnatante usando una pipetta. Rimuovere i tubi dal rack magnetico e aggiungere 200 μL di wash buffer ghiacciato a ciascun campione. Risospendare le perline pipettando delicatamente su e giù 5 volte. Trasferire aliquote da 100 μL da ciascun campione in una nuova striscia da 0,2 mL a 8 tubi.
   1. FASE CRITICA: Dividere ogni campione CUT&RUN in due aliquote separate. Utilizzare una delle aliquote per l'anticorpo di controllo negativo (ad esempio, anticorpo di controllo negativo IgG) e l'altra per l'anticorpo bersaglio contro la proteina di interesse (ad esempio, anticorpo anti-GFP).
      NOTA: entrambi i campioni sono necessari affinché la pipeline computazionale identifichi con precisione i segnali di arricchimento specifici per il TF di interesse. È inoltre possibile eseguire un ulteriore controllo utilizzando anticorpi anti-GFP con un ceppo senza tag. Questo controllo ha mostrato risultati paragonabili all'uso di anticorpi IgG in un ceppo marcato con GFP. Pertanto, per semplicità, si consiglia di utilizzare il controllo IgG standard per tutti gli esperimenti.

7. Legame anticorpale primario

NOTA: la proteina di fusione pAG-MNasi si lega bene agli anticorpi IgG di coniglio, capra, asino, porcellino d'India e topo¹⁷. Generalmente, la maggior parte degli anticorpi commerciali certificati ChIP-seq sono compatibili con le procedure CUT&RUN. La quantità di anticorpo primario utilizzata dipende dall'efficienza dell'anticorpo e la titolazione dell'anticorpo (ad esempio, 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400 diluizione finale) può essere necessaria se l'anticorpo di interesse non è stato precedentemente testato in esperimenti ChIP o CUT&RUN. Raffreddare tutti i tamponi sul ghiaccio prima dell'uso. Tutti i tamponi utilizzati per le fasi di legame degli anticorpi devono essere preparati freschi il giorno dell'esperimento.

1. Posizionare i tubi su un rack magnetico e attendere che il liquame sia completamente pulito; rimuovere e scartare il surnatante usando una pipetta. Aggiungere 50 μL del tampone anticorpale e mescolare delicatamente mediante pipettaggio.
2. Aggiungere 3 μL dell'anticorpo policlonale anti-GFP (o 0,5 μg se si utilizza un anticorpo non testato). Incubare i tubi su un miscelatore di nutating a 4 °C per 2 ore.
   NOTA: Alcuni protocolli CUT&RUN riportano un aumento della resa mediante l'aggiunta di un anticorpo secondario prima dell'aggiunta di pAG-MNasi¹⁴; tuttavia, non è stato osservato alcun miglioramento significativo utilizzando questo passaggio aggiunto e, pertanto, non è incluso in questo protocollo.
3. Centrifugare brevemente i tubi a 100 × g a temperatura ambiente per 5 s, posizionare i tubi su un rack magnetico e, una volta che il liquame è chiaro, rimuovere e scartare il surnatante usando una pipetta. Mentre i tubi contenenti le perline sono ancora sul rack magnetico, aggiungere 200 μL di buffer di permeabilizzazione cellulare ghiacciato direttamente sulle perline. Rimuovere e scartare il surnatante usando una pipetta. Ripetere per un totale di due lavaggi con il buffer di permeabilizzazione cellulare ghiacciato.
4. Aggiungere 50 μL di tampone di permeabilizzazione cellulare ghiacciato a ciascun tubo e mescolare delicatamente mediante pipettaggio.
   NOTA: le perline sono spesso aggregate a questo punto, ma possono essere facilmente disperse mescolando delicatamente usando una pipetta da 200 μL.

8. Legame della pAG-MNasi agli anticorpi

1. Aggiungere 2,5 μL di pAG-Mnase (20x stock) a ciascun campione e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Posizionare i campioni (leggermente rialzati con un angolo di ~ 45 °) su un nutatore a 4 °C. Accendere il nutator e incubare i campioni per 1 ora.
2. Centrifugare brevemente i tubi a nastro a 100 × g a temperatura ambiente per 5 s, posizionare i tubi su un rack magnetico e, una volta che il liquame è limpido, rimuovere e scartare il surnatante usando una pipetta.
   NOTA: questo passaggio è fondamentale. L'anticorpo di riporto che rimane nel cappuccio o nei lati dei tubi dopo questo passaggio aumenterà significativamente la quantità di segnale di fondo.
3. Mentre i tubi contenenti le perline sono ancora sul rack magnetico, aggiungere 200 μL di buffer di permeabilizzazione cellulare ghiacciato, consentire al liquame di schiarirsi e rimuovere e scartare il surnatante usando una pipetta. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi con il buffer di permeabilizzazione cellulare.
4. Aggiungere 100 μL del tampone di permeabilizzazione cellulare ghiacciato ai campioni e pipettare delicatamente su e giù 5 volte.

9. Digestione e rilascio mirati della cromatina

1. Incubare le provette contenenti il campione o i campioni in un bagno di ghiaccio bagnato per 5 minuti. Aggiungere 3 μL di 100 mM CaCl₂ in ogni campione utilizzando una pipetta multicanale. Pipettare delicatamente su e giù 5 volte, riportare immediatamente i tubi al bagno di ghiaccio bagnato e incubare per 30 minuti.
2. Aggiungere 66 μL di Stop Buffer a ciascun campione e vorticare delicatamente per mescolare. Incubare i campioni per 10 minuti a 37 °C in bagno secco.
   NOTA: Si consiglia di aggiungere 1,5 pg di DNA eterologo E. coli spike-in per campione nel tampone di stop. L'aggiunta di 1,5 pg di E. coli spike-in DNA si traduce in 1.000-10.000 letture spike-in mappate per 1-10 milioni di letture sperimentali mappate¹⁴. Il DNA spike-in viene utilizzato per calibrare la profondità di sequenziamento ed è particolarmente importante per confrontare i campioni in una serie. L'aggiunta di E. coli spike-in è altamente raccomandata ma non essenziale. Il kit commerciale CUT&RUN include E. coli spike-in DNA, ma può anche essere acquistato separatamente.
3. Posizionare i tubi sul rack magnetico e trasferire 160 μL del surnatante in un tubo microfugo da 1,5 mL. Trasferire 80 μL del campione in una nuova provetta da 2 mL per microfuga e conservare a -20 °C nel caso in cui sia necessario un campione di riserva. Procedere al passaggio 10 con il campione da 80 μL.

10. Pulizia dei campioni di DNA raccolti

NOTA: Incubare le perle di purificazione del DNA a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso. Prechill 100% isopropanolo su ghiaccio. Quando si mescolano i campioni, pipettare su e giù 10 volte.

1. Vortex DNA Purification Beads per omogeneizzare la sospensione di perline. Aggiungere 50 μL (~ 0,6x volume del campione) delle perline risospese a ciascun campione. Pipette-mescolare e incubare i campioni su un nutator per 5 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Il rapporto tra le perle di purificazione del DNA e il campione utilizzato è fondamentale. L'utilizzo di un volume di 0,6 volte superiore della soluzione di DNA Purification Bead rispetto al campione consente alle perle magnetiche di legarsi a grandi frammenti di DNA rilasciati da nuclei danneggiati. I frammenti di DNA arricchiti con CUT&RUN sono molto più piccoli di questi grandi frammenti di DNA e sono quindi trattenuti nel surnatante in questa fase.
2. Posizionare i tubi su un rack magnetico e trasferire 130 μL del surnatante contenente il DNA in una striscia di 8 tubi da 0,2 mL. Aggiungere altri 30 μL di perle di purificazione del DNA al campione o ai campioni (il volume totale è di 160 μL).
3. Aggiungere 170 μL (~ 1x volume del campione) di isopropanolo 100% ghiacciato, mescolare bene pipettando su e giù 10 volte e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
   NOTA: è fondamentale che l'isopropanolo ghiacciato al 100% venga utilizzato per questo passaggio per le perle di purificazione del DNA per catturare in modo efficiente i piccoli frammenti arricchiti con CUT&RUN.
4. Posizionare i tubi sul rack magnetico e, una volta che il liquame è stato eliminato, rimuovere con cura e scartare il surnatante usando una pipetta.
5. Mentre i tubi sono sul rack magnetico, aggiungere 200 μL di etanolo all'80% appena preparato a temperatura ambiente ai tubi e incubare a temperatura ambiente per 30 s. Rimuovere con cura e scartare il surnatante usando una pipetta. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi con etanolo all'80%.
6. Ruotare rapidamente i tubi a 100 × g, riposizionare i tubi sul rack magnetico e rimuovere l'etanolo residuo utilizzando una pipetta dopo che il liquame è stato eliminato. Asciugare all'aria le perline per 5 minuti mentre i tubi rimangono sul rack magnetico con il coperchio aperto.
   NOTA: Non superare i 5 minuti di tempo di asciugatura in quanto ciò può ridurre significativamente la resa finale del DNA.
7. Rimuovere i tubi dal rack magnetico ed eluire il DNA dalle perline aggiungendo 17 μL di 0,1x Tris-EDTA (TE) a pH 8. Mescolare bene e incubare i tubi per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Posizionare i tubi sul rack magnetico fino a quando il liquame diventa chiaro. Una volta che il liquame è stato eliminato, trasferire con cura 15 μL del surnatante in un tubo PCR sterile da 0,2 ml.
9. Misurare la concentrazione del DNA raccolto utilizzando un fluorometro seguendo il protocollo del produttore.
   NOTA: Tipicamente, la concentrazione del DNA raccolto è ~1 ng/μL. A volte, la concentrazione del DNA raccolto è troppo bassa per essere quantificata utilizzando un fluorometro. Questo non è un indicatore di un esperimento fallito. Procedere con la preparazione della biblioteca indipendentemente dalla concentrazione del DNA raccolto.
10. Procedere al passaggio 11 o conservare i campioni a -20 °C fino al momento.

11. Preparazione della libreria per il sequenziamento

NOTA: i passaggi seguenti utilizzano un kit di preparazione della libreria disponibile in commercio. Quando si eseguono passaggi utilizzando il Ligation Master Mix, ridurre al minimo il tocco dei tubi e tenerli sempre sul ghiaccio.

1. Utilizzando 0,1x TE a pH 8, portare il volume totale del DNA CUT&RUN a 50 μL. Creare un mix master di 3 μL di End Prep Enzyme Mix e 7 μL di End Prep Reaction Buffer per campione. Aggiungere 10 μL di miscela master al DNA CUT&RUN e mescolare accuratamente pipettando su e giù 5 volte.
2. Eseguire una rotazione rapida a 100 × g per raccogliere tutto il liquido dai lati del tubo. Posizionare i tubi in un termociclatore con il coperchio riscaldato impostato su ≥75 °C ed eseguire le condizioni di ciclo di cui alla tabella 7.
   NOTA: a seconda delle concentrazioni di DNA di input iniziale raccolte dal passaggio 10, seguire la diluizione dell'adattatore richiesta dalla Tabella 8.
3. Aggiungere 2,5 μL di adattatore per campione e mescolare accuratamente pipettando su e giù 10 volte.
   NOTA: è fondamentale che l'adattatore venga aggiunto al campione e miscelato accuratamente prima di aggiungere la miscela principale di legatura.
4. Crea un mix master di 30 μL di Ligation Master Mix e 1 μL di Ligation Enhancer. Aggiungere 31 μL della miscela principale al campione o ai campioni. Mescolare accuratamente pipettando su e giù 10 volte.
5. Incubare a 20 °C per 15 minuti in un termociclatore con il coperchio riscaldato spento.
   NOTA: è fondamentale che i campioni siano conservati sul ghiaccio e trasferiti al termociclatore solo dopo che il termociclatore ha raggiunto i 20 °C.
6. Eseguire una rotazione rapida a 100 × g per raccogliere tutto il liquido dai lati del tubo, aggiungere 3 μL di enzima di escissione uracile e incubare i tubi nel termociclatore a 37 °C per 15 minuti con il coperchio riscaldato impostato su ≥47 °C.
   NOTA: questo è un punto di arresto sicuro; conservare i campioni a -20 °C o continuare direttamente fino al punto 11.7. Se si continua direttamente al passaggio 11.7, incubare le perle di purificazione del DNA a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.
7. Aggiungere 154,4 μL (~ 1,6x volume del campione) delle perle di purificazione del DNA alla reazione di legatura dell'adattatore dal passaggio 11.6. Pipettare-mescolare e incubare i campioni per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Posizionare i tubi sul rack magnetico e, una volta che il liquame è stato eliminato, rimuovere con cura e scartare il surnatante usando una pipetta.
9. Aggiungere 200 μL di etanolo all'80% appena preparato a temperatura ambiente ai tubi e incubare a temperatura ambiente per 30 s. Rimuovere e scartare con cura il surnatante usando una pipetta e ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi con etanolo all'80%.
10. Ruotare brevemente i tubi a 100 × g. Riposizionare i tubi sul rack magnetico e rimuovere l'etanolo residuo utilizzando una pipetta. Asciugare all'aria le perline per 5 minuti mentre i tubi rimangono sul rack magnetico con il coperchio aperto.
    NOTA: Non superare i 5 minuti di tempo di asciugatura in quanto ciò può ridurre significativamente la resa finale del DNA.
11. Rimuovere i tubi dal rack magnetico ed eluire il DNA dalle perline aggiungendo 17 μL di 0,1x TE a pH 8. Mescolare bene e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
12. Posizionare i tubi sul rack magnetico fino a quando il liquame diventa chiaro. Una volta che il liquame è stato eliminato, trasferire con cura 15 μL del surnatante in un tubo PCR sterile da 0,2 ml.
13. Creare un master mix di 25 μL di DNA Polymerase Master Mix e 5 μL di Universal Forward Library Amplification Primer (10 μM) per campione.
    NOTA: preparare un campione aggiuntivo di miscela master per tenere conto delle perdite di pipettaggio.
14. Aggiungere 30 μL della miscela master ai 15 μL del campione di DNA legato all'adattatore. Aggiungere 5 μL di Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer (10 μM) a ciascun campione per portare il volume finale a un totale di 50 μL. Mescolare accuratamente tubando su e giù 10 volte. Eseguire le condizioni di ciclo PCR nella Tabella 9.
    NOTA: Incubare le perle di purificazione del DNA a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.
15. Vortex le perle di purificazione del DNA da risospendere. Aggiungere 35 μL (~ 0,7x volume del campione) delle perline risospese ai campioni di DNA amplificati dalla PCR. Mescolare e incubare i campioni su un nutator per 5 minuti a temperatura ambiente.
16. Posizionare i tubi sul rack magnetico e, una volta che il liquame è libero, trasferire il surnatante contenente il DNA in un nuovo tubo a striscia PCR da 0,2 mL a 8 pozzetti.
17. Aggiungere 119 μL (~ 1,4x volume del campione) di perline al campione e mescolare pipettando su e giù 5 volte. Incubare i campioni su un nutator per 5 minuti a temperatura ambiente.
18. Posizionare i tubi sul rack magnetico e, una volta che il liquame è stato eliminato, rimuovere con cura e scartare il surnatante usando una pipetta.
19. Aggiungere 200 μL di etanolo all'80% appena preparato a temperatura ambiente ai tubi e incubare a temperatura ambiente per 30 s. Rimuovere con cura e scartare il surnatante usando una pipetta; ripetere il passaggio per un totale di due lavaggi con etanolo all'80%.
20. Ruotare brevemente i tubi a 100 × g. Riposizionare i tubi sul rack magnetico e rimuovere l'etanolo residuo utilizzando una pipetta. Asciugare all'aria le perline per 5 minuti mentre i tubi rimangono sul rack magnetico con il coperchio aperto.
    NOTA: Non superare i 5 minuti di tempo di asciugatura in quanto ciò può ridurre significativamente la resa finale del DNA.
21. Rimuovere i tubi dal rack magnetico ed eluire il DNA dalle perline aggiungendo 14 μL di 0,1x TE a pH 8. Mescolare bene e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
22. Posizionare i tubi sul rack magnetico fino a quando il liquame diventa chiaro. Una volta che il liquame è stato eliminato, trasferire con cura 13 μL del surnatante in un tubo PCR sterile da 0,2 ml.
23. Preparare 1x Tris-borato-EDTA (TBE) fresco e inserire il gel TBE prefabbricato al 10% commerciale di acrilammide nell'apparato di elettroforesi su gel riempito con 1x TBE.
24. Nel primo pozzo, aggiungere 2 μL di scala del DNA a bassa gamma. Miscelare 3 μL di colorante di carico 6x con 13 μL del campione precedentemente raccolto dal passaggio 11.22. Aggiungere con attenzione 15 μL in ogni pozzetto del gel. Eseguire il gel per 90 minuti a 70 V.
    NOTA: Si consiglia di lasciarne uno nel gel vuoto tra ciascun campione, in quanto ciò riduce la probabilità di contaminazione incrociata del campione. Gli utenti esperti possono trovare appropriato utilizzare tutti i pozzetti evitando accuratamente la contaminazione incrociata, in particolare durante l'elaborazione di un gran numero di campioni.
25. Rimuovere il gel cast dalla scatola di gel. Aprire il gel cast secondo le istruzioni del produttore, rimuovere delicatamente il gel dal gel cast e posizionarlo all'interno di un vassoio di contenimento del gel contenente 100 ml di 1x TBE.
    NOTA: Assicurarsi di rimuovere delicatamente il gel dal gel cast per evitare di strappare il gel in quanto è sottile e fragile. È fondamentale prewet guanti e il gel con 1x TBE ogni volta che si maneggia il gel. Il vassoio di mantenimento del gel deve essere leggermente più grande della dimensione del gel (circa 0,5 "su ciascun lato). I coperchi in plastica dotati di scatole di stoccaggio a tubo PCR a 96 pozzetti sono comodi vassoi di contenimento per dimensioni standard di mini gel.
26. Aggiungere 10 μL della macchia di gel di acido nucleico al vassoio e ruotare delicatamente. Coprire con un foglio per proteggere dalla luce e incubare staticamente a temperatura ambiente per 10 minuti.
27. Risciacquare il gel due volte con 100 ml di acqua di rubinetto deionizzata. Immagine del gel sotto l'illuminazione a luce blu utilizzando un coperchio del filtro ambra (Figura 2).
    NOTA: le librerie riuscite mostrano uno striscio compreso tra 100 e 500 bp. Ci sarà anche una prominente banda dimero adattatore ~ 125. La presenza di dimeri adattatori non è un indicatore di scarsa qualità della libreria. Questa quantità di dimeri adattatori è inevitabile per gli esperimenti CUT&RUN eseguiti su TF a bassa abbondanza ed è una conseguenza della bassa quantità di materiale di input utilizzato per preparare queste librerie. Non usare la luce ultravioletta, che può danneggiare il DNA.
28. Come mostrato nella Figura 2, per ogni libreria, tagliare il gel leggermente sopra la banda dimero dell'adattatore prominente ~125 bp (assicurandosi di evitare di toccare la banda dimero dell'adattatore) e sotto il segno della scala di 400 bp.
    NOTA: è fondamentale evitare la banda dimero dell'adattatore ~125. Anche piccole quantità di dimeri adattatori ridurranno significativamente la qualità della libreria.
29. Forare il fondo di un tubo da 0,65 mL utilizzando un ago da 22 G e posizionare il tubo forato all'interno di un tubo microfugo sterile da 2 mL. Trasferire la fetta di gel nel tubo forato all'interno del tubo di microfuga da 2 ml.
30. Centrifugare il tubo di microfuga da 2 mL contenente la provetta forata da 0,65 mL e il campione a 10.000 × g a temperatura ambiente per 2 minuti per raccogliere il liquame di gel all'interno del tubo di microfuga da 2 mL.
    NOTA: il tubo forato deve ora essere vuoto e può essere scartato. Se il tubo forato ha ancora del gel rimasto all'interno, riposizionare il tubo forato all'interno del tubo del microfugo da 2 ml e centrifugare nuovamente a 10.000 × g a temperatura ambiente per altri 2 minuti.
31. Al liquame di gel all'interno del tubo di microfuga da 2 mL, aggiungere 300 μL di tampone di eluizione gel ghiacciato e mescolare su un nutatore a temperatura ambiente per un minimo di 3 ore o durante la notte (12-16 h).
32. Trasferire tutti i liquami liquidi e gel in una colonna filtrante da 0,22 μm. Centrifuga a 10.000 × g a temperatura ambiente per 1 min; il volume raccolto dovrebbe essere ~300 μL.
33. Aggiungere 450 μL (~ 1,5x volume del campione) di perline di purificazione del DNA, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti su un nutatore, quindi posizionare il campione sul rack magnetico fino a quando il liquame non è chiaro.
    NOTA: Incubare le perle di purificazione del DNA a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.
34. Rimuovere e scartare 500 μL del surnatante, assicurandosi di non disturbare le perline.
35. Rimuovere il campione dal rack magnetico e mescolare le perline tubando su e giù 5 volte. Trasferire 200 μL del campione in un nuovo tubo di striscia PCR.
36. Posizionare il tubo della striscia sul rack magnetico e, una volta che il liquame è stato eliminato, rimuovere con cura e scartare il surnatante usando una pipetta.
37. Aggiungere 200 μL di etanolo all'80% appena preparato a temperatura ambiente ai tubi e incubare a temperatura ambiente per 30 s. Rimuovere con cura e scartare il surnatante usando una pipetta; ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi con etanolo all'80%.
38. Ruotare brevemente i tubi a 100 × g. Riposizionare i tubi sul rack magnetico e rimuovere l'etanolo residuo utilizzando una pipetta. Asciugare all'aria le perline per un massimo di 5 minuti mentre i tubi rimangono sul rack magnetico con il coperchio aperto.
    NOTA: Non superare i 5 minuti di tempo di asciugatura in quanto ciò può ridurre significativamente la resa finale del DNA.
39. Rimuovere i tubi dal rack magnetico ed eluire il DNA dalle perline aggiungendo 17 μL di 0,1x TE a pH 8. Mescolare bene e incubare i tubi per 5 minuti a temperatura ambiente.
40. Posizionare i tubi sul rack magnetico fino a quando il liquame diventa chiaro. Una volta che il liquame è stato eliminato, trasferire con cura 15 μL del surnatante in un tubo PCR sterile da 0,2 ml.
41. Misurare la quantità finale della libreria utilizzando il fluorometro; utilizzare questa libreria finale per la sequenziazione.
    NOTA: fino a 48 librerie possono essere raggruppate e sequenziate in una singola corsia utilizzando una piattaforma di sequenziamento che fornisce almeno 300 milioni di letture a 40 bp o più.

12. Analisi della sequenza CUT&RUN

NOTA: in questa sezione viene presentato il protocollo computazionale utilizzato per analizzare i dati della sequenza CUT&RUN. Il protocollo inizia con la configurazione dell'ambiente virtuale computazionale e guida gli utenti attraverso l'esecuzione dei comandi sul proprio computer locale. Questo protocollo funzionerà su tutte le risorse computazionali, come macchine locali, server cloud virtuali e cluster di calcolo ad alte prestazioni. Tutti i dati CUT&RUN presentati in questo documento sono accessibili presso NCBI GEO con il numero di adesione GSE193803.

1. Scarica il codice sorgente per l'analisi CUT&RUN da https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
   NOTA: il flusso di lavoro funzionerà meglio su un sistema operativo MacOS o Linux. Gli utenti Windows possono eseguire il flusso di lavoro utilizzando GitBash (vedere la Tabella dei materiali).
   1. Scarica direttamente il codice dalla pagina GitHub facendo clic sul pulsante verde Codice | Scarica l'opzione ZIP. Decomprimere la cartella in una posizione pertinente sul computer locale.
2. Installare l'ambiente Conda (vedere la Tabella dei materiali) ed eseguire una sola volta.
   NOTA: questo flusso di lavoro utilizza l'ambiente degli strumenti da riga di comando Conda per installare tutto il software e gli strumenti necessari.
3. Una volta installato Conda (eseguito una sola volta), creare un ambiente virtuale utilizzando il File Supplementare 2 fornito con il seguente comando:
   conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
4. Attivare l'ambiente virtuale ogni volta che questo flusso di lavoro deve essere eseguito utilizzando:
   conda activate
5. Organizza i file FASTQ raw di input in una singola cartella, idealmente una cartella per esperimento CUT&RUN.

13. Generazione del file del genoma per l'allineamento

1. Generare il file del genoma per l'allineamento (eseguire solo una volta per ogni file del genoma). Creare una cartella per salvare tutti i file del genoma di C. albicans , ad esempio:
   mkdir ca_genome_files

14. Download dell'assemblaggio del genoma di C. albicans 21

1. Scaricare l'assemblaggio del genoma di C. albicans 21 dal database del genoma di Candida utilizzando strumenti wget o curl (vedere la tabella dei materiali)¹⁸.
   NOTA: L'assemblaggio 21 di C. albicans è stato utilizzato qui per confrontare i risultati CUT&RUN con i risultati del chip ChIP precedentemente pubblicati, che erano allineati all'Assemblaggio 21. Gli utenti possono scaricare altre versioni di assembly ed eseguire comandi simili per generare file di genoma rilevanti per le loro esigenze di allineamento.

15. Generare un database di indice Bowtie 2 (nome del database: ca21)

1. Utilizzare quanto segue:
   bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
   bowtie2-inspect -s ca21

16. Eseguire la pipeline di analisi CUT&RUN

1. Leggere la sezione della Guida per acquisire familiarità con i parametri della pipeline.
   bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Eseguire il file cut_n_run_pipeline.sh con i parametri pertinenti

1. Eseguire lo script:
   bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y > /path/to/output.log 2>&1
   NOTA: i parametri rilevanti con descrizioni dettagliate alle righe 19-36 del codice sono descritti nella pagina GitHub https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. Organizza i file di output

1. Unisci picchi significativi da tutte le repliche chiamate da MACS2 che si trovano in /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 usando la funzione di unione BedTools¹⁹.
   cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sort -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last,mean,first,mean,mean,mean > /path/to/merged_output.bed
   NOTA: Per ulteriori informazioni e best practice sulla valutazione dei picchi sovrapposti nei campioni replicati, fare riferimento a Landt et ^al.20 e Boyd et ^al.21.

19. Rimuovi le corrispondenze alle regioni genomiche bloccate utilizzando la funzione di sottrazione BedTools

1. Utilizzare quanto segue: sottraereBed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
   NOTA: Le regioni bloccate nel genoma di C. albicans sono fornite come file .bed nel file supplementare 3. L'elenco è costituito principalmente da elementi di sequenza altamente ripetitivi e regioni come ripetizioni telomeriche e centromeri che comunemente producono risultati falsi positivi nei set di dati CUT&RUN, ChIP-seq e ChIP-chip di C. albicans . Pertanto, si consiglia di rimuovere le regioni bloccate. Tuttavia, per alcuni bersagli proteici, può essere inappropriato o indesiderabile escludere questi loci. Gli utenti possono saltare questo passaggio per conservare i segnali contenuti in queste aree bloccate o creare le proprie aree bloccate.

20. Unisci i file BigWig dalle repliche utilizzando la funzione UCSC bigWigMerge²²

1. Usa quanto segue: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
2. Converti l'output BedGraph da bigWigMerge a BigWig utilizzando la funzione UCSC bedGraphToBigWig.
   bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

Risultati

Questo robusto protocollo CUT&RUN è stato adattato e ottimizzato per studiare la localizzazione a livello di genoma di TF specifici in biofilm e colture planctoniche di C. albicans (vedere la Figura 2 per una panoramica dell'approccio sperimentale). È inoltre inclusa una pipeline di analisi dei dati approfondita per facilitare l'analisi dei dati di sequenziamento CUT&RUN risultanti e richiede agli utenti di avere competenze minime nella codifica o nella bioinformatica (vedere la <...

Discussione

Questo protocollo presenta una pipeline sperimentale e computazionale completa per la localizzazione a livello di genoma di TF regolatori in C. albicans. È progettato per essere altamente accessibile a chiunque abbia una formazione standard in microbiologia e biologia molecolare. Sfruttando l'elevata gamma dinamica e i bassi requisiti di input del campione del test CUT&RUN e includendo ottimizzazioni per la localizzazione delle interazioni di legame TF-DNA nel biofilm di C. albicans e nelle colture pla...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes	VWR	490003-190
1 M CaCl2	Fisher Scientific	50-152-341
1 M PIPES	Fisher Scientific	AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates	Corning	351143
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
2% Digitonin	Fisher Scientific	CHR103MI
50 mL conical tubes	VWR	89039-658
5x phusion HF buffer	Fisher Scientific	F530S	Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar	Criterion	C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads	Beckman Coulter	A63880
Agilent Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific	VWR	89133-910
Bacto peptone	BD Biosciences	211677
Benchling primer design tool	Benchling		https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine	Fisher Scientific	AAJ77507AB
Calcofluor white stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
Candida Genome Database			http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads	Polysciences	86057-3
Conda software			https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit	Epicypher	14-1048	Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)	New England Biolabs	N0447S
Dextrose (D-glucose)	Fisher Scientific	D163
Difco D-mannitol	BD Biosciences	217020
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)	Fisher Scientific	R0611
DreamTaq green DNA polymerase	Fisher Scientific	EP0713	Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer	Fisher Scientific	EP0713	Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA	Epicypher	18-1401
ELMI Microplate incubator	ELMI	TRMS-04	Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof	VWR	89125-170
FastDigest MssI	Fisher Scientific	FD1344	Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer	Fisher Scientific	FD1344	Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400	Fisher BioReagents	BP525-25
Fluorescence microscope			User-dependent
Gel electrophoresis apparatus			User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder	Fisher Scientific	FERSM1192
GitBash workflow			https://gitforwindows.org/
GitHub source code			https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5	Boston BioProducts	BBH-75-K
High-speed centrifuge			User-dependent
Isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1830-4
Lens paper	VWR	52846-001
Ligation Enhancer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate	MP Biomedicals	215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody	Takara	632592	User-dependent
MACS2			https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes	Epicypher	10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes	Fisher Scientific	MR02
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC	Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView			http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
NaCl	VWR	470302-522
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
NCBI GEO			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit	New England Biolabs	E7645S	Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)	Goldbio	N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well	Fisher Scientific	EC62755BOX
Nutating mixer	VWR	82007-202
Nutrient broth	Criterion	C6471
pADH110	Addgene	90982	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119	Addgene	90985	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137	Addgene	90986	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139	Addgene	90987	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140	Addgene	90988	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase	Epicypher	15-1016 or 15-1116	50 rxn or 250 rxn
pCE1	Addgene	174434	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid	Fisher Scientific	FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase	Fisher Scientific	F530S	Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350	VWR	10791-816
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q33230
Qubit fluorometer	Life Technologies	Q33216	Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody	Epicypher	13-0042
RNase A	Sigma-Aldrich	10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets	Sigma-Aldrich	5056489001
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
Shaking incubator	Eppendorf	M12820004	User-dependent
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters	Fisher Scientific	07-200-385
Sterile inoculating loops	VWR	30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Fisher Scientific	S11494
SYTO 13 nucleic acid stain	Fisher Scientific	S7575	Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler			User-dependent
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sigma-Aldrich	252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution	Invitrogen	15632011
USER Enzyme			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer	VWR	10153-834
wget tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
Yeast extract	Criterion	C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)	Fisher Scientific	NC0439194