Genomweite Profilierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen in Candida albicans: Eine umfassende CUT&RUN-Methode und Datenanalyse-Workflow

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine experimentelle Methode und einen Datenanalyse-Workflow für die Spaltung unter Targets und die Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) im humanen Pilzpathogen Candida albicans.

Zusammenfassung

Regulatorische Transkriptionsfaktoren steuern viele wichtige biologische Prozesse, einschließlich der zellulären Differenzierung, der Reaktionen auf Umweltstörungen und -belastungen sowie der Wechselwirkungen zwischen Wirt und Krankheitserreger. Die Bestimmung der genomweiten Bindung von regulatorischen Transkriptionsfaktoren an die DNA ist essentiell, um die Funktion von Transkriptionsfaktoren in diesen oft komplexen biologischen Prozessen zu verstehen. Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) ist eine moderne Methode zur genomweiten Kartierung von In-vivo-Protein-DNA-Bindungsinteraktionen, die eine attraktive Alternative zur traditionellen und weit verbreiteten Chromatin-Immunpräzipitationsmethode mit anschließender Sequenzierung (ChIP-seq) darstellt. CUT&RUN ist für einen experimentellen Aufbau mit höherem Durchsatz geeignet und hat einen wesentlich höheren Dynamikbereich mit niedrigeren Sequenzierungskosten pro Probe als ChIP-seq. Hier werden ein umfassendes CUT&RUN-Protokoll und ein begleitender Datenanalyse-Workflow beschrieben, der auf die genomweite Analyse von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen im menschlichen Pilzpathogen Candida albicans zugeschnitten ist. Dieses detaillierte Protokoll umfasst alle notwendigen experimentellen Verfahren, vom Epitop-Tagging von Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen bis zur Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung; Darüber hinaus enthält es einen angepassten Berechnungsworkflow für die CUT&RUN-Datenanalyse.

Einleitung

Candida albicans ist ein klinisch relevanter, polymorpher humaner Pilzpathogen, der in einer Vielzahl von verschiedenen Wachstumsmodi vorkommt, wie der planktonischen (frei schwebenden) Wachstumsweise und als Gemeinschaften eng haftender Zellen, die durch eine extrazelluläre Matrix geschützt sind, die als Biofilm-Wachstumsmodus ^1,2,3 bekannt ist. Ähnlich wie bei anderen Entwicklungs- und zellulären Prozessen ist die Biofilmentwicklung ein wichtiges Virulenzmerkmal von C. albicans, von dem bekannt ist, dass es auf transkriptioneller Ebene durch regulatorische....

Protokoll

1. Epitop-Markierung von C. albicans-Stämmen

1. Laden Sie das interessierende Gen zusammen mit seinen 1 kb vor- und nachgeschalteten flankierenden Sequenzen aus der Candida-Genomdatenbank in das Primer-Design-Tool hoch (siehe Materialtabelle). Entwerfen Sie eine Leit-RNA (gRNA), indem Sie 50 bp vor und nach dem Stopp-Codon markieren und rechts auf das gRNA-Auswahlwerkzeug klicken. Wählen Sie Hilfslinien entwerfen und analysieren aus. Verwenden Sie das Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) Genom und ein NGG (SpCas9, 3' side) Protospacer Adjacent Motif (....

Ergebnisse

Dieses robuste CUT&RUN-Protokoll wurde angepasst und optimiert, um die genomweite Lokalisierung spezifischer TFs in C. albicans-Biofilmen und planktonischen Kulturen zu untersuchen (siehe Abbildung 2 für einen Überblick über den experimentellen Ansatz). Eine gründliche Datenanalyse-Pipeline ist ebenfalls enthalten, um die Analyse der resultierenden CUT&RUN-Sequenzierungsdaten zu erleichtern, und erfordert von den Benutzern minimale Kenntnisse in der Kodierung oder Bioinformatik .......

Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine umfassende experimentelle und rechnerische Pipeline für die genomweite Lokalisierung regulatorischer TFs in C. albicans dar. Es wurde entwickelt, um für jeden mit Standard-Mikrobiologie- und Molekularbiologie-Ausbildung sehr zugänglich zu sein. Durch die Nutzung des hohen Dynamikbereichs und der geringen Anforderungen an den Probeneingang des CUT&RUN-Assays und die Einbeziehung von Optimierungen für die Lokalisierung von TF-DNA-Bindungsinteraktionen in C. albicans-Biofilm

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes	VWR	490003-190
1 M CaCl2	Fisher Scientific	50-152-341
1 M PIPES	Fisher Scientific	AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates	Corning	351143
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
2% Digitonin	Fisher Scientific	CHR103MI
50 mL conical tubes	VWR	89039-658
5x phusion HF buffer	Fisher Scientific	F530S	Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar	Criterion	C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads	Beckman Coulter	A63880
Agilent Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific	VWR	89133-910
Bacto peptone	BD Biosciences	211677
Benchling primer design tool	Benchling		https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine	Fisher Scientific	AAJ77507AB
Calcofluor white stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
Candida Genome Database			http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads	Polysciences	86057-3
Conda software			https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit	Epicypher	14-1048	Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)	New England Biolabs	N0447S
Dextrose (D-glucose)	Fisher Scientific	D163
Difco D-mannitol	BD Biosciences	217020
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)	Fisher Scientific	R0611
DreamTaq green DNA polymerase	Fisher Scientific	EP0713	Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer	Fisher Scientific	EP0713	Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA	Epicypher	18-1401
ELMI Microplate incubator	ELMI	TRMS-04	Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof	VWR	89125-170
FastDigest MssI	Fisher Scientific	FD1344	Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer	Fisher Scientific	FD1344	Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400	Fisher BioReagents	BP525-25
Fluorescence microscope			User-dependent
Gel electrophoresis apparatus			User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder	Fisher Scientific	FERSM1192
GitBash workflow			https://gitforwindows.org/
GitHub source code			https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5	Boston BioProducts	BBH-75-K
High-speed centrifuge			User-dependent
Isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1830-4
Lens paper	VWR	52846-001
Ligation Enhancer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate	MP Biomedicals	215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody	Takara	632592	User-dependent
MACS2			https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes	Epicypher	10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes	Fisher Scientific	MR02
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC	Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView			http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
NaCl	VWR	470302-522
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
NCBI GEO			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit	New England Biolabs	E7645S	Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)	Goldbio	N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well	Fisher Scientific	EC62755BOX
Nutating mixer	VWR	82007-202
Nutrient broth	Criterion	C6471
pADH110	Addgene	90982	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119	Addgene	90985	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137	Addgene	90986	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139	Addgene	90987	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140	Addgene	90988	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase	Epicypher	15-1016 or 15-1116	50 rxn or 250 rxn
pCE1	Addgene	174434	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid	Fisher Scientific	FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase	Fisher Scientific	F530S	Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350	VWR	10791-816
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q33230
Qubit fluorometer	Life Technologies	Q33216	Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody	Epicypher	13-0042
RNase A	Sigma-Aldrich	10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets	Sigma-Aldrich	5056489001
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
Shaking incubator	Eppendorf	M12820004	User-dependent
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters	Fisher Scientific	07-200-385
Sterile inoculating loops	VWR	30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Fisher Scientific	S11494
SYTO 13 nucleic acid stain	Fisher Scientific	S7575	Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler			User-dependent
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sigma-Aldrich	252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution	Invitrogen	15632011
USER Enzyme			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer	VWR	10153-834
wget tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
Yeast extract	Criterion	C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)	Fisher Scientific	NC0439194