Perfil de todo el genoma de las interacciones de unión al factor de transcripción-ADN en Candida albicans: un método cut&RUN completo y un flujo de trabajo de análisis de datos

Resumen

Este protocolo describe un método experimental y un flujo de trabajo de análisis de datos para la escisión bajo objetivos y la liberación utilizando nucleasa (CUT&RUN) en el patógeno fúngico humano Candida albicans.

Resumen

Los factores de transcripción reguladores controlan muchos procesos biológicos importantes, incluida la diferenciación celular, las respuestas a las perturbaciones y tensiones ambientales, y las interacciones huésped-patógeno. Determinar la unión de todo el genoma de los factores de transcripción reguladores al ADN es esencial para comprender la función de los factores de transcripción en estos procesos biológicos a menudo complejos. La escisión bajo objetivos y la liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es un método moderno para el mapeo de todo el genoma de las interacciones de unión proteína-ADN in vivo que es una alternativa atractiva a la inmunoprecipitación de cromatina tradicional y ampliamente utilizada seguida por el método de secuenciación (ChIP-seq). CUT&RUN es susceptible de una configuración experimental de mayor rendimiento y tiene un rango dinámico sustancialmente más alto con menores costos de secuenciación por muestra que ChIP-seq. Aquí, se describe un protocolo cut&RUN completo y el flujo de trabajo de análisis de datos que lo acompaña adaptado para el análisis de todo el genoma de las interacciones de unión al factor de transcripción-ADN en el patógeno fúngico humano Candida albicans . Este protocolo detallado incluye todos los procedimientos experimentales necesarios, desde el etiquetado de epítopos de genes codificantes de factores de transcripción hasta la preparación de bibliotecas para la secuenciación; además, incluye un flujo de trabajo computacional personalizado para el análisis de datos CUT&RUN.

Introducción

Candida albicans es un patógeno fúngico humano polimórfico clínicamente relevante que existe en una variedad de modos diferentes de crecimiento, como el modo de crecimiento planctónico (flotante libre) y como comunidades de células estrechamente adheridas protegidas por una matriz extracelular, conocida como el modo de crecimiento de biopelícula ^1,2,3. Al igual que otros procesos de desarrollo y celulares, el desarrollo de biopelículas es un rasgo importante de virulencia de C. albicans que se sabe que está controlado a nivel transcripcional por factores de transcripción reguladores (TF) que se unen al ADN de una manera específica de la secuencia⁴. Recientemente, los reguladores de cromatina y los modificadores de histonas también han surgido como importantes reguladores de la formación de biopelículas de C. albicans ⁵ y la morfogénesis⁶ al mediar la accesibilidad del ADN. Para comprender la compleja biología de este importante patógeno fúngico, son valiosos los métodos efectivos para determinar la localización de todo el genoma de TF específicos durante distintos procesos de desarrollo y celulares.

La inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación (ChIP-seq) es un método ampliamente utilizado para investigar las interacciones proteína-ADN en C. albicans ^5,6 y ha reemplazado en gran medida el método de inmunoprecipitación de cromatina más clásico seguido de microarray (ChIP-chip)⁹. Sin embargo, tanto los métodos ChIP-seq como ChIP-chip requieren un gran número de células de entrada¹⁰, lo que puede ser un factor complicado cuando se investigan TF en el contexto de muestras y modos de crecimiento específicos, como biopelículas recolectadas de pacientes o modelos animales de infección. Además, el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) a menudo produce una cantidad significativa de señal de fondo en todo el genoma, lo que requiere un alto nivel de enriquecimiento para que el objetivo de interés separe suficientemente la señal del ruido. Si bien el ensayo de chip ChIP está en gran medida desactualizado hoy en día, las profundidades de secuenciación necesarias para ChIP-seq hacen que este ensayo sea prohibitivamente costoso para muchos investigadores, particularmente aquellos que estudian múltiples TF y / o proteínas asociadas a la cromatina.

La escisión bajo objetivos y la liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es una alternativa atractiva a ChIP-seq. Fue desarrollado por el laboratorio Henikoff en 2017 para eludir las limitaciones de la escisión endógena ChIP-seq y la cromatina seguida de la secuenciación ChEC-seq^11,12, otro método para identificar las interacciones proteína-ADN a nivel de todo el genoma, al tiempo que proporciona un mapeo de alta resolución de todo el genoma de TF y proteínas asociadas a la cromatina¹³ . CUT&RUN se basa en la digestión dirigida de la cromatina dentro de los núcleos permeabilizados utilizando nucleasas microcócicas atadas, seguidas de la secuenciación de los fragmentos de ADN digeridos ^9,10. Como los fragmentos de ADN se generan específicamente en los loci que están unidos por una proteína de interés, en lugar de generarse en todo el genoma a través de la fragmentación aleatoria como en los ensayos ChIP, el enfoque CUT&RUN da como resultado señales de fondo muy reducidas y, por lo tanto, requiere 1/10^de la profundidad de secuenciación en comparación con ChIP-seq^{11,13, 14}. Estas mejoras conducen en última instancia a reducciones significativas en los costos de secuenciación y reducciones en el número total de células de entrada necesarias como material de partida para cada muestra.

Aquí, se describe un robusto protocolo CUT&RUN que ha sido adaptado y optimizado para determinar la localización de todo el genoma de TF en células de C. albicans aisladas de biopelículas y cultivos planctónicos. También se presenta una tubería de análisis de datos exhaustiva, que permite el procesamiento y análisis de los datos de secuencia resultantes y requiere que los usuarios tengan una experiencia mínima en codificación o bioinformática. Brevemente, este protocolo describe el etiquetado de epítopos de genes codificantes de TF, la recolección de biopelículas y células planctónicas, el aislamiento de núcleos permeabilizados intactos, la incubación con anticuerpos primarios contra la proteína específica o la proteína marcada con epítopos de interés, la vinculación de las proteínas de fusión quiméricas de nucleasa microcócica A / G (pAG-MNasa) a los anticuerpos primarios, la recuperación del ADN genómico después de la digestión de la cromatina y la preparación de bibliotecas de ADN genómico para la secuenciación.

El protocolo experimental CUT&RUN es seguido por una tubería de análisis de datos especialmente diseñada, que toma lecturas de secuenciación de ADN en bruto en formato FASTQ e implementa todos los pasos de procesamiento requeridos para proporcionar una lista completa de loci significativamente enriquecidos unidos por el TF de interés (dirigido por el anticuerpo primario). Tenga en cuenta que varios pasos del protocolo de preparación de bibliotecas descrito se han adaptado y optimizado específicamente para el análisis CUT&RUN de TF (a diferencia de los nucleosomas). Si bien los datos presentados en este manuscrito se generaron utilizando adaptaciones específicas de TF de un kit comercial CUT&RUN, estos protocolos también se han validado utilizando componentes de origen individual (es decir, enzima pAG-MNasa y perlas de purificación de ADN magnético) y tampones preparados internamente, lo que puede reducir significativamente el costo experimental. Los protocolos experimentales y de análisis de datos completos se describen en detalle a continuación en un formato paso a paso. Todos los reactivos y equipos críticos, así como las recetas de tampón y medios, se enumeran en la Tabla de Materiales y el Archivo Complementario 1, respectivamente.

Protocolo

1. Etiquetado de epítopos de cepas de C. albicans

1. Cargue el gen de interés, junto con sus secuencias de flanqueo ascendentes y descendentes de 1 kb, desde la base de datos del genoma de Candida a la herramienta de diseño de imprimación (consulte la Tabla de materiales). Diseñe un ARN guía (ARNg) resaltando 50 pb aguas arriba y aguas abajo del codón de parada, y haga clic en la herramienta de selección de ARNg a la derecha. Seleccione Diseñar y analizar guías. Utilice el genoma de Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploide)) y un motivo adyacente (PAM) del protoespaciador NGG (SpCas9, 3' side) para los parámetros de la guía, y haga clic en Finalizar. La Figura 1 describe el flujo de trabajo para el etiquetado de epítopos de un gen de interés de C. albicans con proteína fluorescente verde mejorada (eGFP).
   1. En la página siguiente, confirme la región de destino para el diseño de ARNg y presione el botón verde. Ordenar los gRNAs por la puntuación on-target.
      NOTA: La herramienta de diseño de imprimación calcula las puntuaciones en el objetivo y fuera del objetivo para cuantificar la especificidad de los gRNAs. Una guía ideal tiene una puntuación en el objetivo de >60, una puntuación fuera del objetivo de ~ 33 y se superpone al codón de parada. Esto permite una alta especificidad de gRNA mientras se ablaciona la orientación de gRNA después de la integración de GFP. Un ARNg con una puntuación fuera del objetivo de ~50 indica variación alélica; por lo tanto, solo un alelo será reconocido por el ARNg.
   2. Agregue las secuencias (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') y (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') a los extremos 5' y 3', respectivamente, de la secuencia diana de ARNg de 20 pb, creando un cebador/oligonucleótido de 60 pb. Alternativamente, copie la secuencia de 20 pb a la calculadora de ARNg suministrada por Nguyen et ^al.15. Solicite el oligonucleótido gRNA personalizado de 60 pb.
   3. Amplificar el "fragmento A universal" con 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') y 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') y el "fragmento B único" con el oligonucleótido gRNA personalizado de 60 pb (100 mM) del paso 1.1.2. y 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGGGTTTAAACACCG-3') utilizando pADH110 (ID de repositorio de plásmidos Nº 90982) y pADH139 (ID de repositorio de plásmidos Nº 90987), respectivamente, como ADN de plantilla. Utilice las condiciones de reacción y ciclo de PCR proporcionadas en la Tabla 1.
      NOTA: pADH139 es específico para cepas que llevan el marcador heterólogo Candida maltosa LEU2 . Si utiliza una cepa con una sola copia del gen C. albicans LEU2 , sustituya pADH119 (repositorio de plásmidos ID# 90985) en lugar de pADH139.
   4. Confirme la amplificación exitosa verificando 5 μL de la PCR en un gel de agarosa al 1%. Busque ~1 kb A y B fragmentos amplicones.
   5. Mezcle 1 μL cada uno de los fragmentos A y B y coselos utilizando las condiciones de reacción y ciclo de PCR proporcionadas en la Tabla 2 para crear un fragmento C de longitud completa.
   6. Añadir 0,5 μL de 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') y 0,5 μL de 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') a cada reacción de PCR, mezclar bien mediante pipeteo y completar las condiciones de ciclo enumeradas en la Tabla 3.
      NOTA: Si utiliza pADH119 en lugar de pADH139, sustituya AHO1238 (5'-TGTATTTTTTTTTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') en lugar de AHO1453.
   7. Confirme la costura y amplificación adecuadas del fragmento de C comprobando 5 μL de la PCR en un gel de agarosa al 1%. Busque un amplicon de ~2 kb. Guarde el fragmento C a -20 °C hasta que esté listo para su uso.
      NOTA: Si la costura y la amplificación dan como resultado múltiples bandas inespecíficas o frotis, realice una limpieza por PCR de los fragmentos A y B y repita el paso 1.1.5.
2. Agregue toda la eGFP monomérica optimizada para CTG con secuencia enlazadora (RIPLING)¹⁶ (pCE1, repositorio de plásmidos ID# 174434) inmediatamente aguas arriba del codón de parada del gen de interés utilizando la herramienta de diseño de imprimación, creando una fusión traslacional C-terminal. Utilice este constructo para diseñar oligonucleótidos para amplificar el ADN del donante (dDNA) a partir de pCE1.
   1. Diseñe un oligonucleótido hacia adelante con homología de 18-22 pb a la secuencia enlazadora y homología de >50 pb al extremo 3' del marco de lectura abierto (ORF).
      NOTA: La homología de 18-22 pb crea una temperatura de recocido para la amplificación entre 55 °C y 58 °C. Si el oligonucleótido de longitud completa forma dímeros de imprimación, ajuste la homología a la secuencia del enlazador / GFP o al genoma en consecuencia.
   2. Cree un oligonucleótido inverso con homología de 18-22 pb al extremo 3' de GFP y homología de >50 pb a la secuencia no codificante aguas abajo del ORF a etiquetar.
   3. Ordene estos oligonucleótidos y amplifique el dDNA utilizando las condiciones de ciclo de PCR de aterrizaje proporcionadas en la Tabla 4.
3. Diseñar dos conjuntos de oligonucleótidos de PCR de colonias (cPCR) para confirmar la integración de GFP mediante la amplificación a través de los sitios de integración de flanqueo. Primero, seleccione el oligonucleótido dDNA hacia adelante utilizando la herramienta de diseño de imprimación y haga clic en el botón Imprimación a la derecha.
   1. Haga clic en Crear cartillas | | del asistente Tm Param y confirmar que el algoritmo está configurado en SantaLucia 1998. Haga clic en Usar selección para introducir las coordenadas del oligonucleótido directo diseñado en 1.2.1 como secuencia de destino.
   2. Ajuste la temperatura óptima de imprimación a 55 °C y el tamaño máximo del amplicó a 900 pb, y haga clic en el botón Generar imprimaciones en la parte superior derecha.
   3. Seleccione el par de oligonucleótidos con la puntuación de penalización más baja y confirme que los cebadores se amplifican en el sitio de integración de 5'. Asegúrese de que el cebador cPCR hacia adelante se encuentra aguas arriba de la secuencia del cebador dDNA hacia adelante y el cebador cPCR inverso completamente dentro de la etiqueta eGFP o la secuencia del enlazador.
   4. Repita los pasos 1.3-1.3.3. con el oligonucleótido dDNA inverso para crear el segundo conjunto de oligonucleótidos cPCR que se amplifican a través del sitio de integración 3'. Asegúrese de que el cebador cPCR hacia adelante se encuentre completamente dentro de la etiqueta eGFP o la secuencia del enlazador y el cebador cPCR inverso aguas abajo de la secuencia del cebador dDNA inverso.
   5. Ordene estos oligonucleótidos.
4. Digest 2.500 ng de pADH140, que contiene Cas9 (repositorio de plásmidos ID# 90988), con enzima de restricción para cada gen que debe ser marcado con GFP. Establecer el volumen total de cada digestión en 15 μL; ajustar el volumen de agua en consecuencia en función de la concentración de plásmidos pADH140. Utilice las condiciones de digestión especificadas en la Tabla 5. Guarde el plásmido digerido a -20 °C hasta que esté listo para su uso.
   NOTA: Si transforma una cepa con una sola copia del gen C. albicans LEU2 , en lugar del marcador heterólogo C. maltosa LEU2 , sustituya pADH137 (repositorio de plásmidos ID# 90986) en lugar de pADH140.
5. Desnaturalizar 12 μL de ADN de espermatozoides de salmón de 10 mg/ml para cada gen que será marcado con GFP a 99 °C durante 10 min y se enfriará rápidamente a ≤4 °C. Conservar a -20 °C hasta que esté listo para su uso.
6. Coloque una cepa sensible a la nourseotricina hemicigota LEU2 de C. albicans sobre placas de levadura peptona dextrosa (YPD) e incube a 30 °C durante dos días.
7. Seleccione una sola colonia y transfiérala a 4 ml de YPD líquido. Incubar durante 12-16 h a 30 °C con agitación a 250 rpm.
8. Mida la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) del cultivo nocturno (12-16 h) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta desechable (1 ml, 1 cm de longitud de trayectoria).
9. Diluya el cultivo nocturno en un matraz Erlenmeyer a un OD₆₀₀ de 0.1 en YPD. Tenga en cuenta 5 ml por reacción e incluya 5 ml adicionales para verificar el OD₆₀₀ más tarde.
   NOTA: El volumen de la cultura depende del número de reacciones de transformación.
10. Incubar el cultivo diluido durante la noche en una incubadora de agitación a 30 °C con agitación a 250 rpm hasta que alcance un OD₆₀₀ de 0.5-0.8.
11. Centrifugadora a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 5 min; retire y deseche el sobrenadante.
12. Resuspenda el pellet celular en 1 ml de agua estéril mediante una mezcla suave de pipetas con puntas de filtro y transfiéralo a un tubo de microfuge estéril de 1,5 ml.
13. Pellet de las células mediante centrifugación a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 1 min; retire y deseche el sobrenadante. Resuspend en 1 ml de agua estéril y repetir durante un total de dos lavados.
14. Resuspend el pellet en 1/100^del volumen utilizado en el paso 1.10. Por ejemplo, si se utilizaron 15 ml, resuspenda el pellet en 150 μL de agua estéril.
15. En un tubo separado para cada reacción de transformación, mezcle 50 μL de fragmento C, 50 μL de dDNA, 2.500 ng de pADH140 digerida por enzimas de restricción y 10 μL de ADN de espermatozoides de salmón desnaturalizados.
16. Añadir 50 μL de la suspensión celular del paso 1.14 y mezclar mediante pipeteo.
17. Haga un inventario de la mezcla de placas (Archivo Suplementario 1) para transformaciones n + 1.
18. Agregue 1 ml de la mezcla de placas a la mezcla de células / ADN y mezcle invirtiendo 5 veces.
    NOTA: Toque la parte inferior de los tubos mientras invierte para desalojar cualquier líquido restante.
19. Coloque la mezcla en una incubadora a 30 °C durante la noche (12-16 h) sin agitar.
20. Choque térmico de las células durante 15 min a 44 °C en un baño de agua.
21. Centrifugar los tubos de microfuge de 1,5 ml a 5.000 × g a temperatura ambiente durante 2 min.
22. Retire la mezcla PLATE por aspiración al vacío utilizando puntas de pipeta estériles, teniendo cuidado de no molestar el pellet celular.
23. Resuspendir el pellet celular en 1 mL de YPD, pellet por centrifugación a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 1 min, y retirar y desechar el sobrenadante. Repita para un segundo lavado, vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de YPD y transfiera la suspensión a un tubo de cultivo desechable de fondo redondo de 10 ml que contenga 1 ml adicional de YPD (2 ml de volumen final). Recuperar las células a 30 °C con agitación a 250 rpm durante 5 h.
24. Centrifugar los tubos a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 5 min; retire y deseche el sobrenadante.
25. Resuspend el pellet celular en 100 μL de agua estéril y placa en YPD suplementado con 200 μg/mL de nourseotricina (NAT200). Incubar a 30 °C durante 2-3 días.
26. Alícuota 100 μL de 20 mM naOH en los pozos de una placa PCR de 96 pocillos, con cada pozo correspondiente a una colonia individual que creció en las placas NAT200. Usando un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta, elija colonias transformadas individuales, aplíquelas en una nueva placa NAT200 y agite las células restantes en un pozo con 20 mM NaOH. Repita para las colonias restantes para crear el lisado celular utilizado como plantilla de ADN para la reacción cPCR.
27. Selle la placa de PCR e incube durante 10 min a 99 °C en un termociclador con tapa caliente.
28. Configure dos reacciones de cPCR con los oligonucleótidos diseñados en los pasos 1.3-1.3.5. Aumente el número de reacciones según sea necesario. Realizar la reacción de PCR con el lisado celular preparado en el paso 1.26 siguiendo las condiciones de ciclo y las mezclas de reacción de PCR de la Tabla 6. Ejecute 10-20 μL de cada pozo en un gel de agarosa al 1%. Busque colonias con amplificación de los dos conjuntos de cebadores cPCR que indiquen GFP dDNA incorporado correctamente.
29. Colonias restreak que incorporaron GFP en medios sintéticos completos (SC) carentes de leucina. Incubar en una incubadora de 30 °C durante 2-3 días. Elija colonias individuales y aplique parches en YPD e YPD complementados con placas de nourseotricina (NAT400) de 400 μg / ml. Identifique las colonias que no crecen en las placas NAT400 después de 24 h como aquellas que han perdido con éxito los componentes CRISPR.
30. Confirme que la etiqueta GFP se conserva repitiendo los pasos 1.25-1.28 utilizando celdas de la placa de parche YPD. Si las bandas correctas están presentes, inocule en 4 ml de YPD y crezca durante la noche (12-16 h), como se describe en el paso 1.7.
31. Mezcle el cultivo nocturno de la nueva cepa marcada con GFP con glicerol al 50% esterilizado por filtro en una proporción de 1: 1 en un criotubo estéril. Conservar a -80 °C y volver a colocar en placas YPD según sea necesario.
    NOTA: Se recomienda validar las cepas marcadas con GFP confirmando la localización nuclear de la TF marcada a través de microscopía fluorescente y confirmando un fenotipo de tipo salvaje en un ensayo fenotípico apropiado.

2. Preparación de muestras de cultivos de biopelículas

1. Streak C. albicans cepa(s) marcada(s) con GFP en placas de agar YPD e incubar a 30 °C durante 2-3 días. Usando una sola colonia aislada de la placa de agar, inocule en 4 ml de medio líquido YPD. Incubar a 30 °C con agitación durante la noche (12-16 h). Determinar el OD₆₀₀ de la(s) cultura(s) nocturna(s).
   NOTA: Se recomienda utilizar tres réplicas biológicas por muestra para los experimentos CUT&RUN.
2. Inocular una placa de cultivo celular estéril de 12 pocillos sin tratar con el cultivo nocturno a un OD₆₀₀ final de 0.5 (equivalente a 2 × 10⁷ células / ml) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medio a un volumen final de 2 ml. Incubar durante 90 min a 37 °C en una incubadora de microplacas con agitación a 250 rpm.
   NOTA: Se recomienda utilizar una placa de cultivo celular de 12 pocillos por cepa con un pocillo sin ininocular como control de contaminación medio solo. Este protocolo se ha aplicado con éxito utilizando tan solo 1/^{10 de} una placa de cultivo celular de 12 pocillos (o tan solo 5 millones de células). El uso de un mayor número de células aumenta el rendimiento total de ADN, lo que generalmente resulta en bibliotecas de secuenciación de alta calidad.
3. Retire las células sin herrar por aspiración utilizando puntas de pipeta estériles unidas a través de tubos de plástico flexibles a un aparato trampa de vacío. Lave las células adheridas una vez con 2 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 1x. Añadir 2 ml de medio RPMI-1640 fresco a los pocillos e incubar durante 24 h a 37 °C con agitación a 250 rpm.
   NOTA: Cambie las puntas de las pipetas entre pozos de diferentes cepas y/o condiciones. No raspe el fondo del pozo con la punta mientras aspira.
4. Al final de la incubación de 24 horas, recolecte y agrupe el material líquido y de biopelícula de cada uno de los 11 pozos inoculados en un solo tubo cónico estéril de 50 ml. Repita según sea necesario con grupos independientes si procesa más de una cepa o condición de crecimiento al mismo tiempo.
   NOTA: Raspe los fondos y bordes de cada pozo con una punta de filtro de pipeta para desalojar las celdas que permanecen adheridas a la superficie. Utilice la pipeta para homogeneizar las biopelículas.
5. Muestras de pellets por centrifugación a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 5 min. Decantar la mayor cantidad posible del sobrenadante, teniendo cuidado de minimizar la interrupción del pellet. Congele el pellet en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C inmediatamente después de la recolección o continúe directamente con el paso 4 (aislamiento de núcleos).

3. Preparación de muestras de cultivos planctónicos

1. Streak C. albicans cepa(s) marcada(s) con GFP en placas de agar YPD e incubar a 30 °C durante 2-3 días. Usando una sola colonia aislada de la placa de agar, inocule en 4 ml de medio líquido YPD. Incubar a 30 °C con agitación durante la noche (12-16 h). Determinar el OD₆₀₀ de la(s) cultura(s) nocturna(s).
2. Volver a diluir los cultivos durante la noche a OD₆₀₀ de 0,1 en 50 ml de medio líquido RPMI-1640 e incubar a 30 °C con agitación a 225 rpm durante 2-5 h hasta que OD₆₀₀ esté entre 0,5 y 0,8.
   NOTA: Las células deben pasar por al menos dos duplicaciones antes de ser cosechadas. Las condiciones utilizadas para los cultivos planctónicos se pueden ajustar según sea necesario.
3. Pellet las muestras por centrifugación a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 5 min. Decantar la mayor cantidad posible del sobrenadante, teniendo cuidado de minimizar la interrupción del pellet. Congele el pellet en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C inmediatamente después de la recolección o continúe directamente con el paso 4 (aislamiento de núcleos).

4. Aislamiento de núcleos

NOTA: El día del experimento, prepare Ficoll Buffer fresco, agregue 2-mercaptoetanol e inhibidor de proteasa a las alícuotas del Tampón de Resuspensión y agregue el inhibidor de proteasa a las alícuotas del Tampón SPC (consulte el Archivo Suplementario 1). Para resuspendir los gránulos, pipetee suavemente usando puntas de pipeta de 200 μL o 1 ml para evitar dañar las células o los núcleos. Antes de comenzar el aislamiento de los núcleos, encienda el bloque de calor para precalentarlo a 30 °C. Todas las puntas y tubos de pipeta para el resto de este protocolo deben estar certificados libres de ADN / ARN y DNasa / RNasa, y se recomienda el uso de puntas de filtro para todos los pasos posteriores de pipeteo.

1. Resuspend pellet(s) en 1 mL de Tampón de Resuspensión a temperatura ambiente y transfiéralo a un tubo estéril de microfuge de 1,5 mL. Pellet a 2.000 × g a temperatura ambiente durante 2 min en una centrífuga de mesa y retira el sobrenadante.
   NOTA: Retire el sobrenadante con la punta de pipeta de 200 μL o 1 ml, teniendo cuidado de minimizar la interrupción de los gránulos.
2. Resuspend el gránulo(s) en 200 μL de Tampón de Resuspensión a temperatura ambiente. Del pellet resuspendido, transfiera una alícuota de 5 μL a un nuevo tubo de PCR y guárdela a 4 °C para su uso posterior.
   NOTA: Esta alícuota se utilizará como control durante un paso posterior de control de calidad para evaluar la calidad de los núcleos aislados.
3. Pellet a 2.000 × g durante 2 min y retira y desecha el sobrenadante con una pipeta. Repita el paso de lavado dos veces con 200 μL de tampón de resuspensión.
4. Centrifugar a 2.000 × g a temperatura ambiente durante 2 min y retirar el sobrenadante. Añadir 300 μL de tampón de resuspensión y 10 μL de solución de liticasa (50 mg/ml, consulte la Tabla de materiales). Incubar durante 30 min a 30 °C en un bloque de calor.
   NOTA: Alternativamente, también se puede usar un baño de agua calentado a 30 ° C en lugar de un bloque de calor. Las condiciones de esferoplastación utilizadas aquí se han optimizado para ser efectivas tanto para la levadura como para las células hifales de C. albicans. Se recomienda optimizar las condiciones de esferoplastación al aplicar este protocolo a células de C. albicans con mutaciones que afectan la integridad de la pared celular u otras morfologías celulares. Durante este paso de incubación de 30 minutos, el usuario tiene la opción de completar el paso 5 (Concanavalin A Bead Activation) con anticipación para ahorrar tiempo.
   1. PASO CRÍTICO: Después de la etapa de incubación de 30 minutos, transfiera una alícuota de 5 μL a un nuevo tubo de PCR. A los 5 μL de núcleos aislados y a la alícuota de 5 μL de células intactas almacenadas a 4 °C a partir del paso 4.2, añadir 1 μL de calcofluor blanco (un colorante fluorescente de la pared celular) y 1 μL de SYTO 13 (una tinción de ácido nucleico). Incubar a 30 °C en la oscuridad durante 30 min.
   2. Inspeccione visualmente la integridad y pureza de los núcleos aislados utilizando un microscopio de fluorescencia. Busque núcleos aislados que muestren núcleos intactos prominentemente teñidos (utilizando un filtro de excitación de 488-509 nm) y asegúrese de que no haya tinción en la pared celular por el tinte blanco calcofluor (utilizando un filtro de excitación de 390-420 nm). En las células de control intactas, busque una tinción prominente de la pared celular mediante el tinte blanco calcofluor (utilizando un filtro de excitación de 390-420 nm) y núcleos intactos teñidos (utilizando un filtro de excitación de 488-509 nm).
5. Centrifugar a 2.000 × g a 4 °C durante 5 min y retirar el sobrenadante. Resuspend el pellet en 500 μL de Tampón de Resuspensión helado usando puntas de filtro de 1 ml pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Centrifugar a 2.000 × g a 4 °C durante 5 min, y retirar el sobrenadante con una pipeta de 1 ml. Resuspender el pellet con 1 ml de Ficoll Buffer helado recién hecho.
   NOTA: Mantenga las muestras y los búferes en hielo desde este punto en adelante.
6. Centrifugar las muestras a 5.000 × g a 4 °C durante 10 min y retirar el sobrenadante. Resuspend el pellet en 500 μL de tampón SPC helado.
   NOTA: A partir de este momento, manipule los núcleos con extrema suavidad para evitar dañarlos.
7. Centrifugar las muestras a 5.000 × g a 4 °C durante 10 min y retirar la mayor cantidad posible del sobrenadante sin interrumpir el pellet. Coloque los tubos que contienen los núcleos granulados sobre hielo y proceda al paso 5. Si el paso 5 ya se completó antes de tiempo en el paso 4.4, continúe con el paso 6 o congele los gránulos en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 ° C inmediatamente después de la recolección.

5. Activación de cuentas de Concanavalin A

NOTA: Este es un paso crítico. A partir de este momento, los usuarios tienen la opción de continuar con el protocolo utilizando un kit CUT&RUN disponible comercialmente o componentes clave de origen individualmente y preparar búferes internamente. Si utiliza el kit comercial, todos los tampones y reactivos utilizados a continuación se incluyen en el kit a menos que se indique lo contrario. Los números de catálogo individuales para el abastecimiento de reactivos de forma independiente también se proporcionan en la Tabla de materiales. Enfríe todos los tampones en hielo antes de usarlos. Una vez que se completa el paso 5, se recomienda proceder al paso 6 inmediatamente. Evite la congelación y descongelación múltiple de núcleos aislados, ya que se sabe que aumenta el daño al ADN y podría conducir a resultados de mala calidad.

1. Resusped suavemente las cuentas de concanavalina A (ConA) usando una pipeta. Transfiera 22 μL de suspensión de perlas ConA por muestra para ser procesada en un solo tubo de microfuge de 1,5 ml. Coloque el tubo en una rejilla magnética hasta que la suspensión de cuentas esté clara; retire y deseche el sobrenadante con una pipeta.
   NOTA: Al realizar CUT&RUN para un total de 10 muestras, por ejemplo, transfiera 220 μL de la suspensión de perlas ConA a un tubo de microfuge de 1,5 ml.
2. Retire el tubo que contiene las perlas ConA de la rejilla magnética e inmediatamente agregue 200 μL de búfer de activación de perlas helado y mezcle suavemente con una pipeta. Coloque el tubo en la rejilla magnética hasta que la suspensión de cuentas esté clara; retire y deseche el sobrenadante con una pipeta. Repita este paso para un total de dos lavados.
3. Resuspendir las perlas en 22 μL de Bead Activation Buffer helado por muestra de núcleos a procesar. Mantenga las cuentas en hielo hasta que sea necesario.
   NOTA: El rendimiento de los pasos siguientes depende del número y la capacidad de los bastidores de tubos magnéticos disponibles. El procesamiento de 32 muestras en dos bastidores de tubos de 16 pocillos es un número manejable para la mayoría de los usuarios de este protocolo. Sin embargo, un mayor rendimiento es posible para usuarios más experimentados, o si hay sistemas robóticos de manejo de líquidos disponibles.

6. Unión de núcleos a perlas activadas

NOTA: Enfríe todos los tampones en hielo antes de usarlos. Todos los tampones suplementados con inhibidores de la proteasa deben prepararse frescos el día del experimento. Se recomienda utilizar tubos de tira de 0,2 ml en los pasos siguientes.

1. Resuspend los núcleos granulados del paso 4 en 100 μL de SPC Buffer helado y transfiéralos a una nueva tira de 8 tubos y 0,2 ml. Agregue 20 μL de las perlas activadas a cada muestra y pipetee suavemente para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min sin agitación.
2. Coloque los tubos en la rejilla magnética hasta que la suspensión esté clara; retire y deseche el sobrenadante con una pipeta. Retire los tubos de la rejilla magnética y agregue 200 μL de tampón de lavado helado a cada muestra. Resuspend las cuentas canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Transfiera 100 alícuotas de μL de cada muestra a una nueva tira de 8 tubos y 0,2 ml.
   1. PASO CRÍTICO: Divida cada muestra de CUT&RUN en dos alícuotas separadas. Use una de las alícuotas para el anticuerpo de control negativo (por ejemplo, anticuerpo de control negativo IgG) y la otra para el anticuerpo objetivo contra la proteína de interés (por ejemplo, anticuerpo anti-GFP).
      NOTA: Ambas muestras son necesarias para que la canalización computacional identifique con precisión las señales de enriquecimiento específicas del TF de interés. También se puede realizar un control adicional utilizando anticuerpos anti-GFP con una cepa no etiquetada. Este control ha mostrado resultados comparables al uso de anticuerpos IgG en una cepa marcada con GFP. Por lo tanto, para simplificar, se recomienda utilizar el control IgG estándar para todos los experimentos.

7. Unión primaria a anticuerpos

NOTA: La proteína de fusión pAG-MNasa se une bien a los anticuerpos IgG de conejo, cabra, burro, conejillo de indias y ratón¹⁷. En general, la mayoría de los anticuerpos comerciales certificados por ChIP-seq son compatibles con los procedimientos CUT&RUN. La cantidad de anticuerpo primario utilizado depende de la eficiencia del anticuerpo, y la titulación del anticuerpo (por ejemplo, dilución final 1:50, 1:100, 1:200 y 1:400) puede ser necesaria si el anticuerpo de interés no se ha probado previamente en experimentos ChIP o CUT&RUN. Enfríe todos los tampones en hielo antes de usarlos. Todos los tampones utilizados para los pasos de unión de anticuerpos deben prepararse frescos el día del experimento.

1. Coloque los tubos en una rejilla magnética y espere hasta que la suspensión esté completamente clara; retire y deseche el sobrenadante con una pipeta. Añadir 50 μL del antibody Buffer y mezclar suavemente mediante pipeteo.
2. Añadir 3 μL del anticuerpo policlonal anti-GFP (o 0,5 μg si se utiliza un anticuerpo no probado). Incubar los tubos en una batidora nutating a 4 °C durante 2 h.
   NOTA: Algunos protocolos CUT&RUN informan un mayor rendimiento al agregar un anticuerpo secundario antes de la adición de pAG-MNasa¹⁴; sin embargo, no se observó una mejoría significativa con este paso adicional y, por lo tanto, no está incluido en este protocolo.
3. Centrifugar brevemente los tubos a 100 × g a temperatura ambiente durante 5 s, colocar los tubos en una rejilla magnética y, una vez que la suspensión esté clara, retirar y desechar el sobrenadante con una pipeta. Mientras los tubos que contienen las perlas todavía están en el bastidor magnético, agregue 200 μL de tampón de permeabilización celular helado directamente sobre las cuentas. Retire y deseche el sobrenadante con una pipeta. Repita para un total de dos lavados con el tampón de permeabilización celular helado.
4. Agregue 50 μL de tampón de permeabilización celular helado a cada tubo y mezcle suavemente mediante pipeteo.
   NOTA: Las cuentas a menudo se agregan en este punto, pero se pueden dispersar fácilmente mezclando suavemente con una pipeta de 200 μL.

8. Unión de la pAG-MNasa al anticuerpo

1. Añadir 2,5 μL de la pAG-Mnase (20x stock) a cada muestra y mezclar suavemente mediante pipeteo. Coloque las muestras (ligeramente elevadas en un ángulo de ~45°) en un nutator a 4 °C. Encienda el nutator e incube las muestras durante 1 h.
2. Centrifugar brevemente los tubos de la tira a 100 × g a temperatura ambiente durante 5 s, colocar los tubos en una rejilla magnética y, una vez que la suspensión esté despejada, retirar y desechar el sobrenadante con una pipeta.
   NOTA: Este paso es crítico. El anticuerpo de arrastre que queda en la tapa o los lados de los tubos después de este paso aumentará significativamente la cantidad de señal de fondo.
3. Mientras los tubos que contienen las perlas todavía están en el bastidor magnético, agregue 200 μL de tampón de permeabilización celular helado, permita que la suspensión se despeje y retire y deseche el sobrenadante con una pipeta. Repita este paso para un total de dos lavados con el tampón de permeabilización celular.
4. Agregue 100 μL del tampón de permeabilización celular helado a las muestras y pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces.

9. Digestión y liberación de cromatina dirigida

1. Incubar los tubos que contienen la(s) muestra(s) en un baño de hielo húmedo durante 5 min. Añadir 3 μL de CaCl₂ de 100 mM a cada muestra utilizando una pipeta multicanal. Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces, devuelva inmediatamente los tubos al baño de hielo húmedo e incube durante 30 minutos.
2. Agregue 66 μL del Stop Buffer a cada muestra y mezcle suavemente el vórtice. Incubar muestras durante 10 min a 37 °C en un baño seco.
   NOTA: Se recomienda agregar 1,5 pg de ADN heterólogo de E. coli por muestra en el Stop Buffer. La adición de 1.5 pg de ADN de pico de E. coli da como resultado 1,000-10,000 lecturas de pico mapeadas para 1-10 millones de lecturas experimentales mapeadas¹⁴. El PICO de ADN se utiliza para calibrar la profundidad de secuenciación y es especialmente importante para comparar muestras en una serie. La adición de E. coli es muy recomendable, pero no esencial. El kit comercial CUT&RUN incluye ADN de pico de E. coli , pero también se puede comprar por separado.
3. Coloque los tubos en el bastidor magnético y transfiera 160 μL del sobrenadante a un tubo de microfuge de 1,5 ml. Transfiera 80 μL de la muestra a un nuevo tubo de microfugio de 2 ml y guárdelo a -20 °C en caso de que se necesite una muestra de respaldo. Continúe con el paso 10 con la muestra de 80 μL.

10. Limpieza de muestras de ADN recogidas

NOTA: Incubar perlas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso. Prechill 100% isopropanol sobre hielo. Al mezclar las muestras, pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces.

1. Perlas de purificación de ADN de vórtice para homogeneizar la suspensión de cuentas. Agregue 50 μL (~ 0.6x volumen de muestra) de las perlas resuspendidas a cada muestra. Mezcle con pipeta e incube las muestras en un nutator durante 5 min a temperatura ambiente.
   NOTA: La proporción de perlas de purificación de ADN con respecto a la muestra utilizada es crítica. El uso de un volumen de 0,6 veces de solución de perla de purificación de ADN en relación con la muestra permite que las perlas magnéticas se unan a grandes fragmentos de ADN liberados de núcleos dañados. Los fragmentos de ADN enriquecidos con CUT&RUN son mucho más pequeños que estos grandes fragmentos de ADN y, por lo tanto, se retienen en el sobrenadante en este paso.
2. Coloque los tubos en un bastidor magnético y transfiera 130 μL del sobrenadante que contiene el ADN a una tira de 8 tubos de 0,2 ml. Agregue 30 μL adicionales de perlas de purificación de ADN a la(s) muestra(s) (el volumen total es de 160 μL).
3. Agregue 170 μL (~ 1x volumen de muestra) de isopropanol 100% helado, mezcle bien mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces, e incube en hielo durante 10 minutos.
   NOTA: Es fundamental que se utilice isopropanol 100% frío para este paso para que las perlas de purificación de ADN capturen eficientemente los pequeños fragmentos enriquecidos con CUT&RUN.
4. Coloque los tubos en la rejilla magnética y, una vez que la suspensión se haya despejado, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
5. Mientras los tubos están en el estante magnético, agregue 200 μL de etanol recién preparado al 80% a temperatura ambiente a los tubos e incube a temperatura ambiente durante 30 s. Retire con cuidado y deseche el sobrenadante con una pipeta. Repita este paso para un total de dos lavados con etanol al 80%.
6. Gire rápidamente los tubos a 100 × g, vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y retire el etanol residual con una pipeta después de que la suspensión se haya eliminado. Seque al aire las perlas durante 5 minutos mientras los tubos permanecen en la rejilla magnética con la tapa abierta.
   NOTA: No exceda los 5 minutos de tiempo de secado, ya que esto puede reducir significativamente el rendimiento final de ADN.
7. Retire los tubos del bastidor magnético y eluya el ADN de las perlas agregando 17 μL de 0.1x Tris-EDTA (TE) a pH 8. Mezclar bien e incubar los tubos durante 5 min a temperatura ambiente.
8. Coloque los tubos en la rejilla magnética hasta que la suspensión se aclare. Una vez que la suspensión se haya eliminado, transfiera cuidadosamente 15 μL del sobrenadante a un tubo de PCR estéril de 0,2 ml.
9. Mida la concentración del ADN recolectado usando un fluorómetro siguiendo el protocolo del fabricante.
   NOTA: Típicamente, la concentración del ADN recolectado es de ~1 ng/μL. A veces, la concentración del ADN recolectado es demasiado baja para cuantificarla usando un fluorómetro. Esto no es un indicador de un experimento fallido. Continúe con la preparación de la biblioteca independientemente de la concentración del ADN recolectado.
10. Continúe con el paso 11 o guarde las muestras a -20 °C hasta que estén listas.

11. Preparación de la biblioteca para la secuenciación

NOTA: Los pasos siguientes utilizan un kit de preparación de biblioteca disponible comercialmente. Al realizar los pasos con la Mezcla Maestra de Ligación, minimice tocar los tubos y manténgalos siempre en hielo.

1. Usando 0.1x TE a pH 8, eleve el volumen total del ADN CUT&RUN a 50 μL. Haga una mezcla maestra de 3 μL de End Prep Enzyme Mix y 7 μL de End Prep Reaction Buffer por muestra. Agregue 10 μL de mezcla maestra al ADN CUT&RUN y mezcle bien canalizando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
2. Realice un giro rápido a 100 × g para recoger todo el líquido de los lados del tubo. Coloque los tubos en un termociclador con la tapa calefactada configurada a ≥75 °C y ejecute las condiciones de ciclo en la Tabla 7.
   NOTA: Dependiendo de las concentraciones iniciales de ADN de entrada recogidas del paso 10, siga la dilución del adaptador requerida de la Tabla 8.
3. Añadir 2,5 μL de adaptador por muestra y mezclar bien mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
   NOTA: Es fundamental que el adaptador se agregue a la muestra y se mezcle a fondo antes de agregar la mezcla maestra de ligadura.
4. Haga una mezcla maestra de 30 μL de Ligation Master Mix y 1 μL de Ligation Enhancer. Añadir 31 μL de la mezcla maestra a la(s) muestra(s). Mezclar bien mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
5. Incubar a 20 °C durante 15 min en un termociclador con la tapa caliente apagada.
   NOTA: Es fundamental que las muestras se mantengan en hielo y se transfieran al termociclador solo después de que el termociclador haya alcanzado los 20 °C.
6. Realice un giro rápido a 100 × g para recoger todo el líquido de los lados del tubo, agregue 3 μL de enzima de escisión de uracilo e incube los tubos en el termociclador a 37 ° C durante 15 minutos con la tapa calentada a ≥47 ° C.
   NOTA: Este es un punto de parada seguro; conservar las muestras a -20 °C o continuar directamente hasta el paso 11.7. Si continúa directamente con el paso 11.7, incube las perlas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso.
7. Agregue 154.4 μL (~ 1.6x volumen de muestra) de las perlas de purificación de ADN a la reacción de ligadura del adaptador del paso 11.6. Pipete-mezclar e incubar las muestras durante 5 min a temperatura ambiente.
8. Coloque los tubos en la rejilla magnética y una vez que la suspensión se haya despejado, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
9. Añadir 200 μL de etanol recién preparado, a temperatura ambiente al 80% a los tubos e incubar a temperatura ambiente durante 30 s. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y repita este paso durante un total de dos lavados con etanol al 80%.
10. Gire los tubos brevemente a 100 × g. Vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y retire el etanol residual con una pipeta. Seque al aire las perlas durante 5 minutos mientras los tubos permanecen en la rejilla magnética con la tapa abierta.
    NOTA: No exceda los 5 minutos de tiempo de secado, ya que esto puede reducir significativamente el rendimiento final de ADN.
11. Retire los tubos del bastidor magnético y eluya el ADN de las perlas agregando 17 μL de 0.1x TE a pH 8. Mezclar bien e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
12. Coloque los tubos en la rejilla magnética hasta que la suspensión se aclare. Una vez que la suspensión se haya eliminado, transfiera cuidadosamente 15 μL del sobrenadante a un tubo de PCR estéril de 0,2 ml.
13. Haga una mezcla maestra de 25 μL de DNA Polymerase Master Mix y 5 μL de Universal Forward Library Amplification Primer (10 μM) por muestra.
    NOTA: Prepare una muestra adicional de mezcla maestra para tener en cuenta las pérdidas de pipeteo.
14. Agregue 30 μL de la mezcla maestra a los 15 μL de la muestra de ADN ligada por el adaptador. Agregue 5 μL de imprimación de amplificación de biblioteca indexada de forma única inversa (10 μM) a cada muestra para llevar el volumen final a un total de 50 μL. Mezcle bien canalizando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Realizar las condiciones de ciclo de PCR en la Tabla 9.
    NOTA: Incubar las perlas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso.
15. Vórtice las cuentas de purificación de ADN para resuspend. Agregue 35 μL (~ 0.7x volumen de muestra) de las perlas resuspendidas a las muestras de ADN amplificadas por PCR. Mezclar e incubar las muestras en un nutator durante 5 min a temperatura ambiente.
16. Coloque los tubos en el bastidor magnético y, una vez que la suspensión esté despejada, transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un nuevo tubo de tira de PCR de 8 pocillos de 0,2 ml.
17. Agregue 119 μL (~ 1.4x volumen de muestra) de cuentas a la muestra y mezcle mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Incubar las muestras en un nutator durante 5 min a temperatura ambiente.
18. Coloque los tubos en la rejilla magnética y una vez que la suspensión se haya despejado, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
19. Añadir 200 μL de etanol recién preparado, a temperatura ambiente al 80% a los tubos e incubar a temperatura ambiente durante 30 s. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta; repita el paso para un total de dos lavados con etanol al 80%.
20. Gire los tubos brevemente a 100 × g. Vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y retire el etanol residual con una pipeta. Seque al aire las perlas durante 5 minutos mientras los tubos permanecen en la rejilla magnética con la tapa abierta.
    NOTA: No exceda los 5 minutos de tiempo de secado, ya que esto puede reducir significativamente el rendimiento final de ADN.
21. Retire los tubos del bastidor magnético y eluya el ADN de las perlas agregando 14 μL de 0.1x TE a pH 8. Mezclar bien e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
22. Coloque los tubos en la rejilla magnética hasta que la suspensión se aclare. Una vez que el purín se haya eliminado, transfiera cuidadosamente 13 μL del sobrenadante a un tubo de PCR estéril de 0,2 ml.
23. Prepare 1x Tris-borate-EDTA fresco (TBE) e inserte gel de TBE de acrilamida al 10% prefabricado y comercial en el aparato de electroforesis en gel lleno de 1x TBE.
24. En el primer pozo, agregue 2 μL de escalera de ADN de bajo rango. Mezclar 3 μL de colorante de carga 6x con 13 μL de la muestra previamente recogida en el paso 11.22. Agregue cuidadosamente 15 μL en cada pocillo del gel. Pasar el gel durante 90 min a 70 V.
    NOTA: Se recomienda dejar un pozo en el gel vacío entre cada muestra, ya que esto reduce la probabilidad de contaminación cruzada de la muestra. Los usuarios experimentados pueden encontrar apropiado usar todos los pozos evitando cuidadosamente la contaminación cruzada, particularmente cuando procesan una gran cantidad de muestras.
25. Retire el gel yeso de la caja de gel. Abra el molde de gel según las instrucciones del fabricante, retire suavemente el gel del molde de gel y colóquelo dentro de una bandeja de retención de gel que contenga 100 ml de 1x TBE.
    NOTA: Asegúrese de quitar suavemente el gel del molde de gel para evitar rasgar el gel, ya que es delgado y frágil. Es fundamental prewet guantes y el gel con 1x TBE siempre que se manipule el gel. La bandeja de sujeción del gel debe ser ligeramente más grande que el tamaño del gel (aproximadamente 0.5 "en cada lado). Las tapas de plástico provistas con cajas de almacenamiento de tubos de PCR de 96 pocillos son bandejas de sujeción convenientes para tamaños de mini gel estándar.
26. Agregue 10 μL de la mancha de gel de ácido nucleico a la bandeja y revuelva suavemente. Cubra con papel de aluminio para proteger de la luz e incube estáticamente a temperatura ambiente durante 10 min.
27. Enjuague el gel dos veces con 100 ml de agua del grifo desionizada. Imagine el gel bajo iluminación de luz azul usando una cubierta de filtro ámbar (Figura 2).
    NOTA: Las bibliotecas exitosas muestran una mancha entre 100 y 500 pb. También habrá una banda prominente de dímero adaptador ~ 125. La presencia de dímeros adaptadores no es un indicador de mala calidad de la biblioteca. Esta cantidad de dímeros adaptadores es inevitable para los experimentos CUT&RUN realizados en TF de baja abundancia y es una consecuencia de la baja cantidad de material de entrada utilizado para preparar estas bibliotecas. No use luz ultravioleta, que puede dañar el ADN.
28. Como se muestra en la Figura 2, para cada biblioteca, corte el gel ligeramente por encima de la banda prominente del dímero del adaptador de ~ 125 pb (asegurándose de evitar tocar la banda del dímero del adaptador) y por debajo de la marca de la escalera de 400 pb.
    NOTA: Es fundamental evitar la banda del dímero del adaptador ~ 125. Incluso pequeñas cantidades de dímeros adaptadores reducirán significativamente la calidad de la biblioteca.
29. Perfore la parte inferior de un tubo de 0,65 ml con una aguja de 22 G y coloque el tubo perforado dentro de un tubo de microfugio estéril de 2 ml. Transfiera la rodaja de gel al tubo perforado dentro del tubo de microfuge de 2 ml.
30. Centrifugar el tubo de microfuge de 2 ml que contiene el tubo perforado de 0,65 ml y la muestra a 10.000 × g a temperatura ambiente durante 2 minutos para recoger la suspensión de gel dentro del tubo de microfugio de 2 ml.
    NOTA: El tubo perforado ahora debe estar vacío y se puede desechar. Si el tubo perforado todavía tiene gel restante en el interior, coloque el tubo perforado de nuevo dentro del tubo de microfuge de 2 ml y centrífique nuevamente a 10,000 × g a temperatura ambiente durante 2 minutos adicionales.
31. A la suspensión de gel dentro del tubo de microfuge de 2 ml, agregue 300 μL de tampón de elución de gel helado y mezcle en un nutator a temperatura ambiente durante un mínimo de 3 h o durante la noche (12-16 h).
32. Transfiera toda la suspensión de líquido y gel a una columna de filtro de 0,22 μm. Centrifugadora a 10.000 × g a temperatura ambiente durante 1 min; el volumen recolectado debe ser de ~300 μL.
33. Agregue 450 μL (~ 1.5x volumen de muestra) de perlas de purificación de ADN, incube a temperatura ambiente durante 5 minutos en un nutator y luego coloque la muestra en el estante magnético hasta que la suspensión esté clara.
    NOTA: Incubar las perlas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso.
34. Retire y deseche 500 μL del sobrenadante, asegurándose de no interrumpir las perlas.
35. Retire la muestra del bastidor magnético y mezcle las perlas mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Transfiera 200 μL de la muestra a un nuevo tubo de tira de PCR.
36. Coloque el tubo de tira en la rejilla magnética y, una vez que la suspensión se haya despejado, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
37. Añadir 200 μL de etanol recién preparado, a temperatura ambiente al 80% a los tubos e incubar a temperatura ambiente durante 30 s. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta; repita este paso para un total de dos lavados con etanol al 80%.
38. Gire los tubos brevemente a 100 × g. Vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y retire el etanol residual con una pipeta. Seque al aire las perlas durante un máximo de 5 minutos mientras los tubos permanecen en la rejilla magnética con la tapa abierta.
    NOTA: No exceda los 5 minutos de tiempo de secado, ya que esto puede reducir significativamente el rendimiento final de ADN.
39. Retire los tubos del bastidor magnético y eluya el ADN de las perlas agregando 17 μL de 0.1x TE a pH 8. Mezclar bien e incubar los tubos durante 5 min a temperatura ambiente.
40. Coloque los tubos en la rejilla magnética hasta que la suspensión se aclare. Una vez que la suspensión se haya eliminado, transfiera cuidadosamente 15 μL del sobrenadante a un tubo de PCR estéril de 0,2 ml.
41. Mida la cantidad final de la biblioteca utilizando el fluorómetro; utilice esta biblioteca final para la secuenciación.
    NOTA: Se pueden agrupar y secuenciar hasta 48 bibliotecas en un solo carril utilizando una plataforma de secuenciación que proporciona al menos 300 millones de lecturas de extremo pareado de 40 pb o más.

12. Análisis de secuencia CUT&RUN

NOTA: En esta sección se presenta el protocolo computacional utilizado para analizar los datos de secuencia cut&RUN. El protocolo comienza con la configuración del entorno virtual computacional y guía a los usuarios a través de la ejecución de los comandos en su máquina local. Este protocolo funcionará en todos los recursos computacionales, como máquinas locales, servidores virtuales en la nube y clústeres de computación de alto rendimiento. Se puede acceder a todos los datos de CUT&RUN presentados en este documento en NCBI GEO con el número de acceso GSE193803.

1. Descargue el código fuente para el análisis CUT&RUN desde https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
   NOTA: El flujo de trabajo funcionará mejor en un sistema operativo MacOS o Linux. Los usuarios de Windows pueden ejecutar el flujo de trabajo con GitBash (consulte la Tabla de materiales).
   1. Descargue directamente el código de la página de GitHub haciendo clic en el botón verde Código | Descargar opción ZIP . Descomprima la carpeta en una ubicación relevante en el equipo local.
2. Instale el entorno Conda (consulte la Tabla de materiales) y ejecútelo solo una vez.
   NOTA: Este flujo de trabajo utiliza el entorno de herramientas de línea de comandos de Conda para instalar todo el software y las herramientas necesarias.
3. Una vez instalado Conda (ejecutarse solo una vez), cree un entorno virtual utilizando el archivo complementario 2 proporcionado con el siguiente comando:
   conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
4. Active el entorno virtual cada vez que se vaya a ejecutar este flujo de trabajo utilizando:
   conda activate
5. Organice los archivos FASTQ sin procesar de entrada en una sola carpeta, idealmente una carpeta por experimento CUT&RUN.

13. Generación del archivo del genoma para la alineación

1. Genere el archivo del genoma para la alineación (ejecute solo una vez para cada archivo del genoma). Cree una carpeta para guardar todos los archivos del genoma de C. albicans , como:
   mkdir ca_genome_files

14. Descarga del ensamblaje del genoma de C. albicans 21

1. Descargue el ensamblaje del genoma de C. albicans 21 de la base de datos del genoma de Candida utilizando herramientas wget o curl (consulte la Tabla de materiales)¹⁸.
   NOTA: El ensamblaje 21 de C. albicans se utilizó aquí para comparar los resultados de CUT&RUN con los resultados de chIP-chip publicados anteriormente, que se alinearon con el ensamblaje 21. Los usuarios pueden descargar otras versiones de ensamblaje y ejecutar comandos similares para generar archivos de genoma relevantes para sus necesidades de alineación.

15. Generar una base de datos de índice Bowtie 2 (nombre de la base de datos: ca21)

1. Utilice lo siguiente:
   bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
   pajarita2-inspeccionar -s ca21

16. Ejecute la canalización de análisis cut&RUN

1. Lea la sección de ayuda para familiarizarse con los parámetros de la canalización.
   bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Ejecute el archivo cut_n_run_pipeline.sh con los parámetros relevantes

1. Ejecute el script:
   bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
   NOTA: Los parámetros relevantes con descripciones detalladas en las líneas 19-36 del código se describen en la página de GitHub https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. Organizar archivos de salida

1. Combine picos significativos de todas las réplicas llamadas por MACS2 ubicadas en /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 utilizando la función de combinación de BedTools¹⁹.
   cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files ordenar -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last,mean,first,mean,mean,mean,mean > /path/to/merged_output.bed
   NOTA: Para obtener información adicional y mejores prácticas sobre la evaluación de picos superpuestos en muestras replicadas, consulte Landt et ^al.20 y Boyd et ^al.21.

19. Elimine las coincidencias en las regiones genómicas listadas en bloque utilizando la función de restar de BedTools

1. Utilice lo siguiente: subtractBed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
   NOTA: Las regiones bloqueadas en el genoma de C. albicans se proporcionan como un archivo .bed en el archivo complementario 3. La lista consiste principalmente en elementos y regiones de secuencia altamente repetitivos, como repeticiones teloméricas y centrómeros que comúnmente producen resultados falsos positivos en conjuntos de datos de C. albicans CUT&RUN, ChIP-seq y ChIP-chip. Por lo tanto, se recomienda eliminar las regiones bloqueadas. Sin embargo, para ciertos objetivos de proteínas, puede ser inapropiado o indeseable excluir estos loci. Los usuarios pueden omitir este paso para conservar las señales contenidas en estas regiones bloqueadas o crear sus propias regiones bloqueadas.

20. Combinar archivos BigWig de réplicas utilizando la función UCSC bigWigMerge²²

1. Utilice lo siguiente: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
2. Convierta la salida de BedGraph de bigWigMerge a BigWig utilizando la función BEDGraphToBigWig de UCSC.
   bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

Resultados

Este robusto protocolo CUT&RUN fue adaptado y optimizado para investigar la localización de todo el genoma de TF específicos en biopelículas de C. albicans y cultivos planctónicos (ver Figura 2 para una visión general del enfoque experimental). También se incluye una tubería de análisis de datos exhaustiva para facilitar el análisis de los datos de secuenciación CUT&RUN resultantes y requiere que los usuarios tengan una experiencia mínima en codificación o bioinformátic...

Discusión

Este protocolo presenta una tubería experimental y computacional integral para la localización de todo el genoma de TF reguladores en C. albicans. Está diseñado para ser altamente accesible para cualquier persona con capacitación estándar en microbiología y biología molecular. Al aprovechar los requisitos de alto rango dinámico y bajo ingreso de muestra del ensayo CUT&RUN e incluir optimizaciones para la localización de las interacciones de unión TF-DNA en cultivos de biopelícula y planctónica d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes	VWR	490003-190
1 M CaCl2	Fisher Scientific	50-152-341
1 M PIPES	Fisher Scientific	AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates	Corning	351143
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
2% Digitonin	Fisher Scientific	CHR103MI
50 mL conical tubes	VWR	89039-658
5x phusion HF buffer	Fisher Scientific	F530S	Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar	Criterion	C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads	Beckman Coulter	A63880
Agilent Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific	VWR	89133-910
Bacto peptone	BD Biosciences	211677
Benchling primer design tool	Benchling		https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine	Fisher Scientific	AAJ77507AB
Calcofluor white stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
Candida Genome Database			http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads	Polysciences	86057-3
Conda software			https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit	Epicypher	14-1048	Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)	New England Biolabs	N0447S
Dextrose (D-glucose)	Fisher Scientific	D163
Difco D-mannitol	BD Biosciences	217020
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)	Fisher Scientific	R0611
DreamTaq green DNA polymerase	Fisher Scientific	EP0713	Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer	Fisher Scientific	EP0713	Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA	Epicypher	18-1401
ELMI Microplate incubator	ELMI	TRMS-04	Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof	VWR	89125-170
FastDigest MssI	Fisher Scientific	FD1344	Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer	Fisher Scientific	FD1344	Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400	Fisher BioReagents	BP525-25
Fluorescence microscope			User-dependent
Gel electrophoresis apparatus			User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder	Fisher Scientific	FERSM1192
GitBash workflow			https://gitforwindows.org/
GitHub source code			https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5	Boston BioProducts	BBH-75-K
High-speed centrifuge			User-dependent
Isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1830-4
Lens paper	VWR	52846-001
Ligation Enhancer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate	MP Biomedicals	215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody	Takara	632592	User-dependent
MACS2			https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes	Epicypher	10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes	Fisher Scientific	MR02
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC	Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView			http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
NaCl	VWR	470302-522
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
NCBI GEO			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit	New England Biolabs	E7645S	Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)	Goldbio	N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well	Fisher Scientific	EC62755BOX
Nutating mixer	VWR	82007-202
Nutrient broth	Criterion	C6471
pADH110	Addgene	90982	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119	Addgene	90985	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137	Addgene	90986	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139	Addgene	90987	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140	Addgene	90988	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase	Epicypher	15-1016 or 15-1116	50 rxn or 250 rxn
pCE1	Addgene	174434	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid	Fisher Scientific	FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase	Fisher Scientific	F530S	Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350	VWR	10791-816
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q33230
Qubit fluorometer	Life Technologies	Q33216	Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody	Epicypher	13-0042
RNase A	Sigma-Aldrich	10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets	Sigma-Aldrich	5056489001
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
Shaking incubator	Eppendorf	M12820004	User-dependent
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters	Fisher Scientific	07-200-385
Sterile inoculating loops	VWR	30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Fisher Scientific	S11494
SYTO 13 nucleic acid stain	Fisher Scientific	S7575	Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler			User-dependent
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sigma-Aldrich	252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution	Invitrogen	15632011
USER Enzyme			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer	VWR	10153-834
wget tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
Yeast extract	Criterion	C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)	Fisher Scientific	NC0439194