JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה ניסיונית וזרימת עבודה של ניתוח נתונים עבור ביקוע תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN) בפתוגן הפטרייתי האנושי קנדידה אלביקנס.

Abstract

גורמי שעתוק רגולטוריים שולטים בתהליכים ביולוגיים חשובים רבים, כולל התמיינות תאית, תגובות להפרעות ולחצים סביבתיים, ואינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן. קביעת הקשירה הכלל-גנומית של גורמי שעתוק רגולטוריים לדנ"א חיונית להבנת תפקידם של גורמי שעתוק בתהליכים ביולוגיים מורכבים אלה. ביקוע תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN) היא שיטה מודרנית למיפוי כלל-גנומי של אינטראקציות קושרות חלבון-דנ"א in vivo המהווה חלופה אטרקטיבית לתפיסת החיסון המסורתית והנפוצה של כרומטין ואחריה לריצוף (ChIP-seq). CUT&RUN מקובל על מערך ניסיוני בעל תפוקה גבוהה יותר ויש לו טווח דינמי גבוה משמעותית עם עלויות ריצוף נמוכות יותר לכל מדגם מאשר ChIP-seq. כאן מתוארים פרוטוקול CUT&RUN מקיף וזרימת עבודה נלווית של ניתוח נתונים המותאמים לניתוח כלל-גנומי של אינטראקציות קושרות גורמי שעתוק-DNA בפתוגן הפטרייתי האנושי קנדידה אלביקנס . פרוטוקול מפורט זה כולל את כל ההליכים הניסוייים הדרושים, החל מתיוג אפיטופים של גנים המקודדים גורמי שעתוק וכלה בהכנת ספרייה לריצוף; בנוסף, הוא כולל זרימת עבודה חישובית מותאמת אישית לניתוח נתונים CUT&RUN.

Introduction

קנדידה אלביקנס היא פתוגן פטרייתי אנושי פולימורפי רלוונטי מבחינה קלינית, שקיים במגוון מצבי גדילה שונים, כגון מצב הצמיחה הפלנקטוני (צף חופשי) וכקהילות של תאים דבוקים היטב המוגנים על ידי מטריצה חוץ-תאית, המכונה מצב הביופילם של צמיחה 1,2,3. בדומה לתהליכים התפתחותיים ותאיים אחרים, פיתוח ביופילם הוא תכונת אלימות חשובה של C. albicans, הידועה כמבוקרת ברמת השעתוק על ידי גורמי שעתוק רגולטוריים (TFs) הנקשרים לדנ"א באופן ספציפי לרצף4. לאחרונה, רגולטורים של כרומטין ומשני היסטון התגלו גם כרגולטורים חשובים של היווצרות ביופילם C. albicans 5 ומורפוגנזה6 על ידי תיווך נגישות DNA. כדי להבין את הביולוגיה המורכבת של הפתוגן הפטרייתי החשוב הזה, שיטות יעילות לקביעת לוקליזציה כלל-גנומית של TFs ספציפיים במהלך תהליכים התפתחותיים ותאיים שונים הן בעלות ערך.

קדם חיסוני של כרומטין ואחריו ריצוף (ChIP-seq) היא שיטה נפוצה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א ב- C. albicans 5,6 והחליפה במידה רבה את מערכת החיסון הקלאסית יותר של כרומטין ואחריה את שיטת המיקרו-מערך (ChIP-chip)9. עם זאת, הן שיטות ChIP-seq והן ChIP-chip דורשות מספר רב של תאי קלט10, מה שיכול להיות גורם מסבך כאשר חוקרים TFs בהקשר של דגימות ספציפיות ודרכי גדילה, כגון ביופילמים שנאספו מחולים או מודלים של זיהום בעלי חיים. בנוסף, בדיקת הכרומטין החיסונית (ChIP) מניבה לעתים קרובות כמות משמעותית של אות רקע לאורך הגנום, הדורשת רמה גבוהה של העשרה עבור המטרה המעניינת כדי להפריד מספיק את האות מהרעש. בעוד שהבדיקה של ChIP-chip מיושנת במידה רבה כיום, עומקי הריצוף הדרושים ל-ChIP-seq הופכים את הבדיקה הזו ליקרה מאוד עבור חוקרים רבים, במיוחד אלה שחוקרים מספר TFs ו/או חלבונים הקשורים לכרומטין.

מחשוף תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN) הוא חלופה אטרקטיבית ל- ChIP-seq. הוא פותח על ידי מעבדת Henikoff בשנת 2017 כדי לעקוף את המגבלות של ChIP-seq ו chromatin endogenous cleavage ואחריו רצף ChEC-seq11,12, שיטה נוספת לזיהוי אינטראקציות חלבון-DNA ברמה כלל-גנומית, תוך מתן מיפוי רחב גנום ברזולוציה גבוהה של TFs וחלבונים הקשורים לכרומטין13 . CUT&RUN מסתמך על עיכול ממוקד של כרומטין בתוך גרעינים חודרים באמצעות נוקלאזות מיקרו-קוקליות קשורות, ולאחר מכן ריצוף של מקטעי הדנ"א המעוכלים 9,10. מכיוון שמקטעי דנ"א נוצרים באופן ספציפי במוקדים הקשורים לחלבון בעל עניין, במקום להיווצר לאורך כל הגנום באמצעות פיצול אקראי כמו במבחני ChIP, גישת CUT&RUN מביאה להפחתהמשמעותית של אותות רקע, ולכן דורשת 1/10 מעומק הריצוף בהשוואה ל-ChIP-seq11,13, 14. שיפורים אלה מובילים בסופו של דבר להפחתה משמעותית בעלויות הריצוף ולהפחתה במספר הכולל של תאי הקלט הדרושים כחומר התחלתי עבור כל דגימה.

כאן מתואר פרוטוקול CUT&RUN חזק שהותאם והותאם ומוטב לקביעת לוקליזציה כלל-גנומית של TFs בתאי C. albicans שבודדו מביופילמים ותרביות פלנקטוניות. כמו כן מוצג צינור ניתוח נתונים יסודי, המאפשר עיבוד וניתוח של נתוני הרצף המתקבלים ודורש מהמשתמשים מומחיות מינימלית בקידוד או בביואינפורמטיקה. בקצרה, פרוטוקול זה מתאר תיוג אפיטופים של גנים המקודדים TF, קצירת תאים ביופילם ופלנקטוניים, בידוד של גרעינים חודרים שלמים, דגירה עם נוגדנים ראשוניים כנגד החלבון הספציפי או החלבון המתויג באפיטופ, קשירת חלבוני ההיתוך הכימריים A/G-micrococcal Nuclease (pAG-MNase) לנוגדנים העיקריים, התאוששות DNA גנומית לאחר עיכול כרומטין, והכנת ספריות DNA גנומיות לריצוף.

פרוטוקול CUT&RUN הניסיוני מלווה בצנרת ניתוח נתונים ייעודית, שלוקחת קריאות ריצוף DNA גולמיות בפורמט FASTQ ומיישמת את כל שלבי העיבוד הנדרשים כדי לספק רשימה מלאה של מוקדים מועשרים באופן משמעותי הקשורים ל- TF של עניין (ממוקד על ידי הנוגדן העיקרי). שים לב ששלבים מרובים של פרוטוקול הכנת הספרייה המתואר הותאמו והותאמו במיוחד לניתוח CUT&RUN של TFs (בניגוד לנוקלאוזומים). בעוד שהנתונים המוצגים בכתב יד זה נוצרו באמצעות התאמות ספציפיות ל-TF של ערכת CUT&RUN מסחרית, פרוטוקולים אלה אומתו גם באמצעות רכיבים שמקורם בנפרד (כלומר, אנזים pAG-MNase וחרוזי טיהור DNA מגנטיים) ובמאגרים מוכנים בתוך הבית, מה שיכול להפחית באופן משמעותי את עלות הניסוי. פרוטוקולי הניסוי וניתוח הנתונים המקיפים מתוארים בפירוט להלן בפורמט שלב אחר שלב. כל הריאגנטים והציוד הקריטי, כמו גם מתכוני המאגר והמדיה, מפורטים בטבלת החומרים ובקובץ המשלים 1, בהתאמה.

Protocol

1. תיוג אפיטופי של זנים C. albicans

  1. העלה את הגן המעניין, יחד עם רצפי האגף שלו באורך 1 קילו במעלה הזרם ובמורד הזרם, ממסד הנתונים של הגנום של קנדידה לכלי עיצוב הפריימר (ראה טבלת החומרים). תכננו רנ"א מנחה (gRNA) על ידי הדגשת 50 bp במעלה הזרם ובמורד הזרם מקודון העצירה, ולחצו על כלי בחירת ה-gRNA מימין. בחר מדריכי תכנון וניתוח. השתמש בגנום Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) ובמוטיב הסמוך של פרוטוספייסר NGG (SpCas9, 3' side) (PAM) עבור הפרמטרים המנחים, ולחץ על סיום. איור 1 מתאר את זרימת העבודה לתיוג אפיטופים של גן C. albicans בעל עניין עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP).
    1. בעמוד הבא, אשר את אזור היעד לתכנון gRNA ולחץ על הכפתור הירוק. מיין את ה-gRNA לפי הניקוד ביעד.
      הערה: כלי תכנון הפריימרים מחשב ציוני יעד ומחוץ ליעד כדי לכמת את הספציפיות של ה-gRNA. למדריך אידיאלי יש ציון על המטרה של >60, ציון מחוץ למטרה של ~33, והוא חופף את קודון העצירה. זה מאפשר ספציפיות גבוהה של gRNA תוך כדי התמקדות ב-gRNA לאחר שילוב GFP. gRNA עם ציון מחוץ למטרה של כ-50 מצביע על שונות אללית; לפיכך, רק אלל אחד יוכר על ידי gRNA.
    2. הוסף את הרצפים (5'-CGTAAACTATTTTTTTTTG-3') ו-(5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') לקצוות 5' ו-3', בהתאמה, של רצף המטרה gRNA של 20 bp, תוך יצירת פריימר/אוליגונוקלאוטיד של 60 bp. לחלופין, העתק את רצף 20 bp למחשבון gRNA שסופק על ידי Nguyen et al.15. הזמינו את 60 bp מותאם אישית gRNA oligonucleotide.
    3. הגבר את "שבר A אוניברסלי" עם 100 mM AHO1096 (5 '-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') ו- 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') ואת "שבר B ייחודי" עם 60 bp gRNA מותאם אישית אוליגונוקלאוטיד (100 mM) משלב 1.1.2. ו- 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3') באמצעות pADH110 (מזהה מאגר פלסמידים# 90982) ו- pADH139 (מזהה מאגר פלסמיד מס' 90987), בהתאמה, כדנ"א תבניתי. השתמש בתגובת PCR ובתנאי הרכיבה על אופניים המופיעים בטבלה 1.
      הערה: pADH139 הוא ספציפי לזנים הנושאים את הסמן ההטרולוגי Candida maltosa LEU2 . אם אתה משתמש בזן עם עותק יחיד של הגן C. albicans LEU2 , החלף pADH119 (מזהה מאגר פלסמיד מס' 90985) במקום pADH139.
    4. אשר הגברה מוצלחת על ידי בדיקת 5 μL של ה- PCR על ג'ל אגרוז 1%. חפש אמפליקונים של קטעים של ~ 1 kb A ו- B.
    5. ערבבו 1 μL כל אחד מקטעי A ו-B ותפרו אותם יחד באמצעות תגובת ה-PCR ותנאי הרכיבה על אופניים המסופקים בטבלה 2 כדי ליצור מקטע C באורך מלא.
    6. הוסף 0.5 μL של 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGACTATTGAAG-3') ו- 0.5 μL של 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGAGCTTCGACAATCG-3') לכל תגובת PCR, ערבב היטב על ידי צנרת והשלם את תנאי המחזור המפורטים בטבלה 3.
      הערה: אם אתה משתמש ב- pADH119 במקום pADH139, החלף את AHO1238 (5'-TGTATTTTTTTTTTAAAATTTTTAGTGACTGTTTC-3') במקום AHO1453.
    7. אשרו תפירה והגברה נאותים של שבר C על ידי בדיקת 5 μL של ה-PCR על ג'ל אגרוז של 1%. חפשו אמפליקון של כ-2 קילובייט. אחסנו את שבר C בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לשימוש.
      הערה: אם תפירה והגברה גורמים לפסים מרובים ולא ספציפיים או למריחה, בצע ניקוי PCR של שברי A ו- B וחזור משלב 1.1.5.
  2. הוסף את כל ה- eGFP המונומרי המותאם ל- CTG עם רצף מקשר (RIPLING)16 (pCE1, מזהה מאגר פלסמיד# 174434) מיד במעלה הזרם של קודון העצירה של הגן המעניין באמצעות כלי תכנון הפריימר, יצירת היתוך תרגומי C-terminal. השתמש במבנה זה כדי לתכנן אוליגונוקלאוטידים להגברת הדנ"א התורם (dDNA) מ-pCE1.
    1. תכנן אוליגונוקלאוטיד קדמי עם הומולוגיה של 18-22 bp לרצף המקשר והומולוגיה >50 bp לקצה 3' של מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF).
      הערה: ההומולוגיה של 18-22 bp יוצרת טמפרטורת חישול להגברה בין 55 °C (55 °F) ל-58 °C (75 °F). אם האוליגונוקלאוטיד באורך מלא יוצר דימרים של פריימרים, התאם את ההומולוגיה לרצף המקשר/GFP או לגנום בהתאם.
    2. צור אוליגונוקלאוטיד הפוך עם הומולוגיה של 18-22 bp לסוף 3' של GFP והומולוגיה של >50 bp לרצף הלא-מקודד במורד הזרם של ה-ORF כדי להיות מתויג.
    3. הזמינו את האוליגונוקלאוטידים האלה והגבירו את ה-dDNA באמצעות תנאי הרכיבה של ה-PCR לטאצ'דאון שסופקו בטבלה 4.
  3. תכנן שתי קבוצות של אוליגונוקלאוטידים של מושבה PCR (cPCR) לאישור האינטגרציה של GFP על ידי הגברה באתרי האינטגרציה של האגפים. ראשית, בחר את dDNA oligonucleotide קדימה באמצעות כלי עיצוב הפריימר ולחץ על כפתור הפריימר בצד ימין.
    1. לחץ על צור פריימרים | | הקוסם Tm Param ולאשר כי האלגוריתם מוגדר SantaLucia 1998. לחץ על השתמש בבחירה כדי להזין את הקואורדינטות של האוליגונוקלאוטיד הקדמי שתוכנן ב- 1.2.1 כרצף היעד.
    2. הגדר את טמפרטורת הפריימר האופטימלית ל- 55 °C ואת גודל האמפליקון המרבי ל- 900 bp, ולחץ על לחצן צור פריימרים בפינה השמאלית העליונה.
    3. בחר את זוג האוליגונוקלאוטידים עם ציון העונשין הנמוך ביותר וודא שהפריימרים מגבירים את אתר האינטגרציה של 5 אינץ'. ודא שהפריימר cPCR הקדמי נמצא במעלה הזרם של רצף פריימר ה-dDNA הקדמי ופריימר cPCR ההפוך במלואו בתוך תג eGFP או רצף המקשר.
    4. חזור על שלבים 1.3-1.3.3. עם dDNA הפוך oligonucleotide כדי ליצור את הקבוצה השנייה של cPCR oligonucleotides כי להגביר על פני אתר האינטגרציה 3 '. ודא שפריימר cPCR הקדמי נמצא כולו בתוך תג eGFP או רצף המקשר ופריימר cPCR ההפוך במורד הזרם של רצף פריימר dDNA ההפוך.
    5. להזמין את האוליגונוקלאוטידים האלה.
  4. עכל 2,500 ננוגרם של pADH140, המכיל Cas9 (מאגר פלסמיד ID# 90988), עם אנזים הגבלה עבור כל גן להיות מתויג GFP. הגדר את הנפח הכולל של כל עיכול על 15 μL; להתאים את נפח המים בהתאם בהתבסס על ריכוז הפלסמיד pADH140. השתמש בתנאי העיכול המפורטים בטבלה 5. אחסנו את הפלסמיד המעוכל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לשימוש.
    הערה: אם הופכים זן בעותק יחיד של הגן C. albicans LEU2 , במקום הסמן ההטרולוגי C. maltosa LEU2 , החליפו את pADH137 (מזהה מאגר פלסמידים מס' 90986) במקום pADH140.
  5. דנטורציה 12 μL של 10 מ"ג / מ"ל דנ"א זרע סלמון עבור כל גן אשר יתויג GFP ב 99 °C (99 °F) למשך 10 דקות ויתקרר במהירות ≤4 °C (≤ מעלות צלזיוס). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לשימוש.
  6. Streak a C. albicans LEU2 hemizygous nourseothricin-רגיש ללחחות שמרים פפטון דקסטרוז (YPD) ודגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
  7. בחר מושבה אחת והעבר אותה ל-4 מ"ל של YPD נוזלי. דגירה למשך 12-16 שעות ב-30 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-250 סל"ד.
  8. מדוד את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר (OD600) של תרבית הלילה (12-16 שעות) בספקטרופוטומטר באמצעות קובט חד פעמי (1 מ"ל, אורך נתיב של 1 ס"מ).
  9. דיללו את תרבות הלילה לכדי בקבוקון ארלנמאייר ל-OD600 של 0.1 ב-YPD. קח בחשבון 5 מ"ל לכל תגובה וכלול 5 מ"ל נוספים לבדיקת OD600 מאוחר יותר.
    הערה: נפח התרבות תלוי במספר התגובות לשינוי.
  10. דגירה של תרבות הלילה המדוללת באינקובטור רועד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעד ב-250 סל"ד עד שתגיע ל-OD600 של 0.5-0.8.
  11. צנטריפוגה ב 4,000 × גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות; להסיר ולהשליך את supernatant.
  12. יש להחיות את גלולת התא ב-1 מ"ל של מים סטריליים באמצעות ערבוב פיפטה עדין עם קצוות מסנן ולהעביר לצינור מיקרו-פוג' סטרילי של 1.5 מ"ל.
  13. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4,000 × גרם בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת; להסיר ולהשליך את supernatant. יש לבצע החייאה ב-1 מ"ל של מים סטריליים ולחזור על הפעולה בסך הכל במשך שתי שטיפות.
  14. בצעו החייאה של הכדור ב-1/100th של הנפח שבו נעשה שימוש בשלב 1.10. לדוגמה, אם נעשה שימוש ב-15 מ"ל, החייאת הכדור ב-150 μL של מים סטריליים.
  15. בצינור נפרד לכל תגובת טרנספורמציה, יש לערבב 50 μL של שבר C, 50 μL של dDNA, 2,500 ננוגרם של pADH140 המעוכל על ידי אנזים הגבלה, ו-10 μL של DNA זרע סלמון שעבר דנטורציה.
  16. הוסיפו 50 μL של חרטום התאים משלב 1.14 וערבבו על ידי צנרת.
  17. צור מלאי של תערובת הצלחת (קובץ משלים 1) עבור טרנספורמציות n + 1.
  18. מוסיפים 1 מ"ל מתערובת הצלחת לתערובת התא/דנ"א ומערבבים על ידי היפוך 5 פעמים.
    הערה: הקש על החלק התחתון של הצינורות תוך כדי היפוך כדי לנתק כל נוזל שנותר.
  19. מניחים את התערובת באינקובטור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה (12-16 שעות) מבלי לרעוד.
  20. הלם חום התאים במשך 15 דקות ב 44 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  21. צנטריפוגה צינורות מיקרופוג 1.5 מ"ל ב 5,000 × גרם בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
  22. הסר את תערובת ה- PLATE על ידי שאיפת ואקום באמצעות קצות פיפטה סטריליים, תוך הקפדה על הימנעות מהפרעה לכדור התא.
  23. בצעו החייאה של גלולת התא ב-1 מ"ל של YPD, כדור על ידי צנטריפוגה ב-4,000 × גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת, והסירו והשליכו את הסופרנאטנט. חזרו על הפעולה לצורך שטיפה שנייה, בצעו החייאה של גלולת התא ב-1 מ"ל של YPD, והעבירו את המתלים לצינור תרבית חד-פעמי בעל תחתית עגולה של 10 מ"ל, המכיל תוספת של 1 מ"ל של YPD (נפח סופי של 2 מ"ל). שחזרו את התאים ב-30 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-250 סל"ד למשך 5 שעות.
  24. צנטריפוגה הצינורות ב 4,000 × גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות; להסיר ולהשליך את supernatant.
  25. בצעו החייאה של גלולת התא ב-100 μL של מים סטריליים וצלחת על YPD בתוספת 200 מיקרוגרם/מ"ל נורזאותריצ'ין (NAT200). דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים.
  26. Aliquot 100 μL של 20 mM NaOH לתוך בארות של צלחת PCR 96 בארות, כאשר כל באר מתאימה למושבה בודדת שגדלה על צלחות NAT200. באמצעות קיסם עקם סטרילי או קצה פיפטה, בחרו מושבות בודדות שעברו טרנספורמציה, תיקנו אותן על גבי צלחת NAT200 חדשה וסובבו את התאים הנותרים לבאר עם NaOH של 20 mM. חזרו על הפעולה עבור המושבות הנותרות כדי ליצור את ה-lysate של התאים המשמשים כתבנית הדנ"א של תגובת ה-cPCR.
  27. אטמו את צלחת ה-PCR ודגרו למשך 10 דקות בטמפרטורה של 99 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר עם מכסה מחומם.
  28. הגדר שתי תגובות cPCR עם אוליגונוקלאוטידים שתוכננו בשלבים 1.3-1.3.5. הגדל את מספר התגובות לפי הצורך. בצע את תגובת ה-PCR עם ליזט התא שהוכן בשלב 1.26 לאחר תנאי מחזור ותערובות תגובת PCR מטבלה 6. הפעילו 10-20 מיקרול מכל באר על ג'ל אגרוז 1%. חפש מושבות עם הגברה של שתי קבוצות פריימר cPCR המציינות GFP dDNA משולב כראוי.
  29. להקים מחדש מושבות ששילבו GFP במדיה סינתטית שלמה (SC) חסרת לאוצין. אינקובציה באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים. בחרו מושבות בודדות ותדביקו על לוחות YPD ו-YPD בתוספת לוחות 400 מיקרוגרם/מ"ל נורסאותריצ'ין (NAT400). זהה מושבות שלא מצליחות לגדול על לוחות NAT400 לאחר 24 שעות ככאלה שאיבדו בהצלחה את רכיבי הקריספר.
  30. ודא שתג GFP נשמר על-ידי שלבים חוזרים 1.25-1.28 באמצעות תאים מלוח התיקון של YPD. אם הפסים הנכונים קיימים, חסן לתוך 4 מ"ל של YPD וגדל בן לילה (12-16 שעות), כמתואר בשלב 1.7.
  31. ערבבו את תרבית הלילה של הזן החדש המתויג כ-GFP עם 50% גליצרול מעוקר במסנן ביחס של 1:1 בקריו-צינורית סטרילית. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ולהיצמד מחדש לצלחות YPD לפי הצורך.
    הערה: מומלץ לאמת את הזנים המתויגים על ידי GFP על ידי אישור לוקליזציה גרעינית של ה- TF המתויג באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ואישור פנוטיפ מסוג פראי בבדיקה פנוטיפית מתאימה.

2. הכנה לדוגמה של תרביות ביופילם

  1. Streak C. albicans מתויג GFP-מתויג זן(ים) על צלחות אגר YPD ודגירה ב 30 °C (66 °F) במשך 2-3 ימים. באמצעות מושבה מבודדת אחת מלוח האגר, חסן לתוך 4 מ"ל של תווך נוזלי YPD. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס עם רעידות לילה (12-16 שעות). קבע את ה-OD600 של תרבויות הלילה.
    הערה: מומלץ להשתמש בשלושה שכפולים ביולוגיים לכל דגימה עבור ניסויי CUT&RUN.
  2. לחסן צלחת תרבית תאים סטרילית בתרבית תאים לא מטופלת של 12 בארות עם תרבית הלילה ל-OD600 סופי של 0.5 (שווה ערך ל-2 × 107 תאים/מ"ל) במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI)-1640 בינוני עד כרך סופי של 2 מ"ל. דגירה במשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור מיקרו-לוחית עם רעידות ב-250 סל"ד.
    הערה: מומלץ להשתמש בצלחת תרבית תאים אחת של 12 בארות לכל זן עם צלחת אחת לא מנוצלת היטב כבקרת זיהום בינונית בלבד. פרוטוקול זה יושם בהצלחה תוך שימושב-1 /10 בלבד מתוך צלחת תרבית תאים אחת של 12 בארות (או עד 5 מיליון תאים בלבד). שימוש במספר גבוה יותר של תאים מגדיל את תפוקת הדנ"א הכוללת, מה שבדרך כלל גורם לספריות ריצוף באיכות גבוהה.
  3. הסר תאים לא מזוהמים על ידי שאיפה באמצעות קצוות פיפטה סטריליים המחוברים באמצעות צינורות פלסטיק גמישים למנגנון מלכודת ואקום. שטפו את התאים המודבקים פעם אחת עם 2 מ"ל של מלח סטרילי 1x בעל מאגר פוספט (PBS). הוסף 2 מ"ל של RPMI-1640 טרי בינוני לבארות ודגירה במשך 24 שעות ב 37 °C עם רעידות ב 250 סל"ד.
    הערה: החליפו טיפים לפיפטה בין בארות של זנים ו/או תנאים שונים. אין לגרד את תחתית הבאר עם הקצה תוך כדי שאיפה.
  4. בתום הדגירה בת 24 השעות, אספו ואגדו את הנוזל והחומר הביופילם מכל אחת מ-11 הבארות המחוסנות לצינור חרוטי יחיד, סטרילי של 50 מ"ל. חזרו על הפעולה לפי הצורך עם מאגרים עצמאיים אם אתם מעבדים יותר מזן אחד או מצב גדילה אחד בו-זמנית.
    הערה: גרד את התחתונים והקצוות של כל באר עם קצה מסנן פיפטה כדי לעקור תאים שנותרו דבוקים לפני השטח. השתמש בפיפטה כדי להומוגניות את הביופילמים.
  5. דגימות כדוריות על ידי צנטריפוגה ב 4,000 × גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. דקאנט כמה שיותר מהסופרנאטנט, תוך הקפדה על צמצום ההפרעה של הכדור. הקפיאו את הכדור בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס מיד לאחר האיסוף או המשיכו ישירות לשלב 4 (בידוד גרעינים).

3. הכנה לדוגמה של תרבויות פלנקטוניות

  1. Streak C. albicans מתויג GFP-מתויג זן(ים) על צלחות אגר YPD ודגירה ב 30 °C (66 °F) במשך 2-3 ימים. באמצעות מושבה מבודדת אחת מלוח האגר, חסן לתוך 4 מ"ל של תווך נוזלי YPD. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס עם רעידות לילה (12-16 שעות). קבע את ה-OD600 של תרבויות הלילה.
  2. מדולל בחזרה תרביות לילה ל- OD600 של 0.1 ב- 50 מ"ל של מדיום נוזלי RPMI-1640 ודגירה ב- 30 ° C עם רעידות ב - 225 סל"ד למשך 2-5 שעות עד ש- OD600 הוא בין 0.5 ל - 0.8.
    הערה: תאים צריכים לעבור לפחות שתי הכפלות לפני שהם נקצרים. ניתן להתאים את התנאים המשמשים לתרבויות פלנקטוניות לפי הצורך.
  3. גלול את הדגימות על ידי צנטריפוגה ב 4,000 × גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. דקאנט כמה שיותר מהסופרנאטנט, תוך הקפדה על צמצום ההפרעה של הכדור. הקפיאו את הכדור בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס מיד לאחר האיסוף או המשיכו ישירות לשלב 4 (בידוד גרעינים).

4. בידוד גרעינים

הערה: ביום הניסוי, הכינו מאגר פיקול טרי, הוסיפו 2-מרקפטואתנול ומעכב פרוטאזות לאליקוט(ים) של מאגר ההחייאה, והוסיפו מעכב פרוטאזות לאליקוט(ים) של מאגר SPC (ראו קובץ משלים 1). כדי להחיות את הכדורים, פיפט בעדינות באמצעות 200 μL או 1 מ"ל פיפטה טיפים כדי למנוע נזק לתאים או גרעינים. לפני תחילת בידוד הגרעינים, הפעל את גוש החום כדי לחמם אותו מראש ל -30 מעלות צלזיוס. כל הטיפים והצינורות של פיפטה למשך שארית פרוטוקול זה צריכים להיות מאושרים כ-DNA/RNA ו-DNase/RNase-free, והשימוש בעצות למסנן מומלץ לכל שלבי הצינור הבאים.

  1. גלולות Resuspend ב-1 מ"ל של חיץ החייאה בטמפרטורת החדר והעברה לצינור מיקרו-פוג' סטרילי בגודל 1.5 מ"ל. מטילים כדור ב-2,000 × גרם בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות בצנטריפוגה שולחנית ומסירים את ה-supernatant.
    הערה: הסר את חומר העל באמצעות קצה פיפטה של 200 μL או 1 מ"ל, תוך הקפדה על מזעור ההפרעה לכדורים.
  2. בצעו החייאה של הכדור(ים) ב-200 μL של חיץ החייאה בטמפרטורת החדר. מהכדור המחודש, מעבירים אליקווט 5 μL לצינור PCR חדש ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
    הערה: aliquot זה ישמש כבקרה במהלך שלב בקרת איכות לאחר מכן כדי להעריך את איכות הגרעינים המבודדים.
  3. מטילים כדור ב-2,000 × גרם למשך 2 דקות ומסירים ומשליכים את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה. חזור על שלב הכביסה פעמיים באמצעות 200 μL של מאגר החייאה.
  4. צנטריפוגה ב 2,000 × גרם בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות ולהסיר את supernatant. הוסף 300 μL של מאגר החייאה ו- 10 μL של תמיסת lyticase (50 מ"ג / מ"ל, ראה את טבלת החומרים). דגירה במשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס בבלוק חום.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש באמבט מים מחומם ל-30 מעלות צלזיוס במקום בלוק חום. התנאים הספרופלסטיים המשמשים כאן הותאמו להיות יעילים הן עבור שמרים והן עבור תאי hyphal של C. albicans. מומלץ לייעל את תנאי הספרופלסטיקה בעת החלת פרוטוקול זה על תאי C. albicans עם מוטציות המשפיעות על שלמות דופן התא או על מורפולוגיות תאיות אחרות. במהלך שלב דגירה זה של 30 דקות, למשתמש יש אפשרות להשלים את שלב 5 (הפעלת חרוזים של Concanavalin A) מראש כדי לחסוך זמן.
    1. שלב קריטי: לאחר שלב הדגירה של 30 דקות, העבירו אליקווט של 5 μL לצינור PCR חדש. ל-5 μL של גרעינים מבודדים ול-5 μL aliquot של תאים שלמים המאוחסנים ב-4°C משלב 4.2, הוסיפו 1 μL calcofluor white (צבע דופן תא פלואורסצנטי) ו-1 μL של SYTO 13 (כתם חומצת גרעין). דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות.
    2. בדקו באופן חזותי את שלמותם וטוהרם של הגרעינים המבודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חפשו גרעינים מבודדים המציגים גרעינים שלמים מוכתמים באופן בולט (באמצעות מסנן עירור של 488-509 ננומטר) וודאו שאין צביעה בדופן התא על ידי הצבע הלבן של העגל (באמצעות מסנן עירור של 390-420 ננומטר). בתאי הבקרה השלמים, חפשו צביעה בולטת של דופן התא על ידי הצבע הלבן של העגל (באמצעות מסנן עירור של 390-420 ננומטר) וגרעינים שלמים מוכתמים (באמצעות מסנן עירור של 488-509 ננומטר).
  5. צנטריפוגה ב 2,000 × g ב 4 °C (85 °F) במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. בצעו החייאה של הכדור ב-500 μL של מאגר החייאה קר כקרח באמצעות קצוות מסנן של 1 מ"ל על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה 5 פעמים. צנטריפוגה ב 2,000 × גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant באמצעות פיפטה 1 מ"ל. בצעו החייאה של הכדור עם 1 מ"ל של חיץ פיקול קר כקרח טרי.
    הערה: שמור את הדגימות והמאגרים על קרח מנקודה זו והלאה.
  6. צנטריפוגה את הדגימות ב 5,000 × גרם ב 4 °C (6 °F) במשך 10 דקות ולהסיר את supernatant. החזירו את הכדור ב-500 μL של חיץ SPC קר כקרח.
    הערה: מנקודה זו ואילך, טפלו בגרעינים בעדינות רבה כדי למנוע פגיעה בהם.
  7. צנטריפוגות הדגימות ב-5,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והסירו כמה שיותר מהסופרנטנט מבלי לשבש את הכדור. הניחו את הצינורות המכילים את הגרעינים המכוסים על הקרח והמשיכו לשלב 5. אם שלב 5 כבר הושלם מראש בשלב 4.4, המשך לשלב 6 או הצמד את הכדורים בחנקן נוזלי ואחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס מיד לאחר האיסוף.

5. הפעלת חרוזים של Concanavalin

הערה: זהו שלב קריטי. מנקודה זו והלאה, למשתמשים יש אפשרות להמשיך עם הפרוטוקול באמצעות ערכת CUT&RUN זמינה מסחרית או רכיבי מפתח מקור בנפרד ולהכין מאגרים בתוך החברה. אם משתמשים בערכה המסחרית, כל המאגרים והריאגנטים המשמשים להלן כלולים בערכה, אלא אם כן צוין אחרת. מספרים קטלוגיים בודדים למיקור ריאגנטים באופן עצמאי מסופקים גם בטבלת החומרים. מצננים את כל המאגרים על קרח לפני השימוש. לאחר השלמת שלב 5, מומלץ להמשיך לשלב 6 באופן מיידי. הימנעו מהפשרה מרובה בהקפאה של גרעינים מבודדים, שכן ידוע כי היא מגבירה את הנזק לדנ"א ועלולה להוביל לתוצאות באיכות ירודה.

  1. בצעו החייאה עדינה של חרוזי הקונקנאבלין A (ConA) באמצעות פיפטה. העברת 22 μL של מתלה חרוז ConA לכל דגימה כדי להיות מעובד בצינור microfuge יחיד 1.5 מ"ל. מניחים את הצינור על מדף מגנטי עד שהחרוזים ברורים; להסיר ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה.
    הערה: בעת ביצוע CUT&RUN עבור סך של 10 דגימות, לדוגמה, העבר 220 μL של מתלה חרוז ConA לצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל.
  2. הסר את הצינור המכיל את חרוזי ConA מהמדף המגנטי ומיד הוסף 200 μL של מאגר הפעלת חרוזים קר כקרח וערבב בעדינות באמצעות פיפטה. מניחים את הצינור על המדף המגנטי עד שהחרוזים ברורים; להסיר ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה. חזרו על שלב זה בסך הכל לשתי שטיפות.
  3. שחזרו את החרוזים ב-22 μL של מאגר הפעלת חרוזים קר כקרח לכל דגימה של גרעינים שיש לעבד. שמור את החרוזים על הקרח עד הצורך.
    הערה: התפוקה של השלבים הבאים תלויה במספר ובקיבולת של מדפי הצינורות המגנטיים הזמינים. עיבוד 32 דגימות בשני ארונות תקשורת צינוריים של 16 בארות הוא מספר הניתן לניהול עבור רוב המשתמשים בפרוטוקול זה. עם זאת, תפוקה גבוהה יותר אפשרית למשתמשים מנוסים יותר, או אם קיימות מערכות רובוטיות לטיפול בנוזלים.

6. קשירת גרעינים לחרוזים פעילים

הערה: יש לצנן את כל המאגרים על קרח לפני השימוש. כל המאגרים בתוספת מעכבי פרוטאזות צריכים להיות מוכנים טריים ביום הניסוי. מומלץ להשתמש בצינורות רצועה 0.2 מ"ל בשלבים הבאים.

  1. בצעו שימוש חוזר בגרעיני הכדורים משלב 4 ב-100 μL של SPC Buffer קר כקרח והעבירו לרצועה חדשה של 0.2 מ"ל עם 8 צינורות. מוסיפים 20 μL של החרוזים המופעלים לכל דגימה ומקטרים בעדינות כדי לערבב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ללא תסיסה.
  2. מניחים את הצינורות על המדף המגנטי עד שהסלסול ברור; להסיר ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה. הסר את הצינורות מהמדף המגנטי, והוסף 200 μL של מאגר שטיפה קר כקרח לכל דגימה. בצעו החייאה של החרוזים על ידי צביעה עדינה למעלה ולמטה 5 פעמים. העבר 100 μL aliquots מכל דגימה לתוך רצועת 0.2 מ"ל חדשה של 8 צינורות.
    1. שלב קריטי: חלקו כל דגימת CUT&RUN לשני אליקוטים נפרדים. השתמש באחד ה-aliquots עבור נוגדן הבקרה השלילית (למשל, נוגדן הבקרה השלילית IgG) והשני עבור נוגדן המטרה כנגד החלבון המעניין (למשל, נוגדן נגד GFP).
      הערה: שתי הדגימות נדרשות עבור הצינור החישובי כדי לזהות במדויק אותות העשרה ספציפיים ל- TF המעניין. ניתן גם לבצע בדיקה נוספת באמצעות נוגדנים נגד GFP עם זן לא מתויג. בקרה זו הראתה תוצאות דומות לשימוש בנוגדני IgG בזן המתויג כ-GFP. לכן, למען הפשטות, מומלץ להשתמש בבקרת IgG הסטנדרטית עבור כל הניסויים.

7. קשירת נוגדנים ראשונית

הערה: חלבון היתוך pAG-MNase נקשר היטב לנוגדני IgG של ארנב, עז, חמור, שרקן ועכבר17. באופן כללי, רוב הנוגדנים המסחריים המסחריים המאושרים על ידי ChIP-seq תואמים להליכי CUT&RUN. כמות הנוגדן הראשוני שבו נעשה שימוש תלויה ביעילות הנוגדן, וטיטרציה של הנוגדן (למשל, 1:50, 1:100, 1:200 ו-1:400 דילול סופי) עשויה להיות נחוצה אם הנוגדן המעניין לא נבדק בעבר בניסויי ChIP או CUT&RUN. מצננים את כל המאגרים על קרח לפני השימוש. כל המאגרים המשמשים לשלבי קשירת נוגדנים צריכים להיות מוכנים טריים ביום הניסוי.

  1. הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי והמתינו עד שהסלרי יהיה ברור לחלוטין; להסיר ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה. מוסיפים 50 μL של מאגר הנוגדנים ומערבבים בעדינות על ידי צנרת.
  2. הוסף 3 μL של הנוגדן הפוליקלונלי anti-GFP (או 0.5 מיקרוגרם אם משתמשים בנוגדן שלא נבדק). דגירה של הצינורות על מיקסר אגוזים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    הערה: חלק מפרוטוקולי CUT&RUN מדווחים על עלייה בתפוקה על ידי הוספת נוגדן משני לפני תוספת pAG-MNase14; עם זאת, לא נצפה שיפור משמעותי באמצעות שלב נוסף זה, ולכן, הוא אינו נכלל בפרוטוקול זה.
  3. צנטריפוגה קצרה של הצינורות ב-100 × גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 שניות, הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי, וברגע שהסלרי ברור, הסירו והשליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה. בזמן שהצינורות המכילים את החרוזים עדיין נמצאים על המדף המגנטי, הוסיפו 200 μL של חיץ חדירת תאים קר כקרח ישירות על החרוזים. מסירים ומשליכים את ה-supernatant באמצעות פיפטה. חזרו על הפעולה בסך הכל למשך שתי שטיפות עם מאגר חדירת התאים הקר כקרח.
  4. הוסיפו 50 μL של מאגר חדירת תאים קר כקרח לכל צינור וערבבו בעדינות על ידי צנרת.
    הערה: חרוזים נצברים לעתים קרובות בנקודה זו, אך ניתן לפזר אותם בקלות על ידי ערבוב עדין באמצעות פיפטה של 200 μL.

8. קשירת pAG-MNase לנוגדן

  1. הוסיפו 2.5 μL של pAG-Mnase (מלאי של 20x) לכל דגימה וערבבו בעדינות על ידי צנרת. מקם את הדגימות (מעט מוגבהות בזווית של ~ 45 °) על nutator ב- 4 °C (74 °F). מפעילים את המנוטע ומדגרים את הדגימות למשך שעה אחת.
  2. צנטריפוגה קצרה של צינורות הרצועה ב-100 × גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 שניות, הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי, וברגע שהסלרי ברור, הסירו והשליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה.
    הערה: שלב זה הוא קריטי. נוגדן נשיאה שנותר בפקק או בצידי הצינורות לאחר שלב זה יגדיל באופן משמעותי את כמות אות הרקע.
  3. בעוד הצינורות המכילים את החרוזים עדיין נמצאים על המדף המגנטי, הוסיפו 200 μL של חיץ חדירת תאים קר כקרח, אפשרו לתעלה להתנקות, והסירו והשליכו את ה-supernatant באמצעות פיפטה. חזור על שלב זה לקבלת שתי שטיפות בסך הכל עם מאגר חדירת התאים.
  4. מוסיפים 100 μL של מאגר חדירת התאים הקר כקרח לדגימות ומקטרים בעדינות למעלה ולמטה 5 פעמים.

9. עיכול ושחרור כרומטין ממוקדים

  1. דגירה של הצינורות המכילים את הדגימות באמבט קרח רטוב למשך 5 דקות. הוסף 3 μL של 100 mM CaCl2 לכל דגימה באמצעות פיפטה רב-ערוצית. פיפט בעדינות למעלה ולמטה 5 פעמים, מיד להחזיר את הצינורות לאמבטיית הקרח הרטובה, ולדגום במשך 30 דקות.
  2. הוסיפו 66 μL של ה-Stop Buffer לכל דגימה והתערבבו בעדינות כדי לערבב. דגימות דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבטיה יבשה.
    הערה: מומלץ להוסיף 1.5 pg של דנ"א הטרולוגי E. coli spike-in לכל דגימה ב- Stop Buffer. התוספת של 1.5 pg של E. coli spike-in DNA מביאה ל-1,000-10,000 קריאות ספייק-אין ממופות עבור 1-10 מיליון ניסויים ממופים קוראים14. הדנ"א של ספייק-אין משמש לכיול עומק הריצוף והוא חשוב במיוחד להשוואת דגימות בסדרה. התוספת של E. coli בספייק-אין מומלצת מאוד אך לא חיונית. ערכת CUT&RUN המסחרית כוללת דנ"א של E. coli spike-in, אך ניתן לרכוש אותה גם בנפרד.
  3. מניחים את הצינורות על המדף המגנטי ומעבירים 160 μL של ה-supernatant לתוך צינור מיקרו-פוג' של 1.5 מ"ל. העבר 80 μL של הדגימה לתוך צינור microfuge חדש 2 מ"ל ואחסן ב -20 °C במקרה שיש צורך בדגימת גיבוי. המשך לשלב 10 עם דגימת 80 μL.

10. ניקוי דגימות דנ"א שנאספו

הערה: דגירה של חרוזי טיהור DNA בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש. Prechill 100% איזופרופנול על קרח. בעת ערבוב הדגימות, פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים.

  1. חרוזי טיהור DNA של מערבולת להומוגניזציה של תרחיף החרוזים. הוסיפו 50 μL (נפח דגימה של כ-0.6x) של החרוזים המחודשים לכל דגימה. פיפט-מערבבת ומדגרת את הדגימות על מחט במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: היחס בין חרוזי טיהור DNA לדגימה שבה נעשה שימוש הוא קריטי. שימוש בנפח 0.6x של תמיסת חרוזי טיהור DNA ביחס לדגימה מאפשר לחרוזים המגנטיים להיקשר למקטעי דנ"א גדולים המשתחררים מגרעינים פגומים. מקטעי דנ"א מועשרים ב-CUT&RUN קטנים בהרבה מקטעי הדנ"א הגדולים האלה, ולכן הם נשמרים בסופרנט בשלב זה.
  2. הניחו את הצינורות על מדף מגנטי והעבירו 130 μL של הסופרנאטנט המכיל את הדנ"א לרצועת צינורות של 0.2 מ"ל 8. הוסף 30 μL נוספים של חרוזי טיהור DNA לדגימות (הנפח הכולל הוא 160 μL).
  3. הוסיפו 170 μL (~פי 1 מדגם נפח) של 100% איזופרופנול קר כקרח, ערבבו היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים, ודגרו על קרח למשך 10 דקות.
    הערה: זה קריטי כי 100% isopropanol קר כקרח משמש עבור שלב זה עבור חרוזי טיהור DNA כדי ללכוד ביעילות את השברים הקטנים מועשרים CUT&RUN.
  4. הניחו את הצינורות על המדף המגנטי, ולאחר שהתבהרה ההחלקה, הסירו והשליכו בזהירות את ה-supernatant באמצעות פיפטה.
  5. בזמן שהצינורות נמצאים על המדף המגנטי, הוסיפו 200 μL של אתנול טרי בטמפרטורת החדר 80% לצינורות ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות. יש להסיר ולהשליך בזהירות את ה-supernatant באמצעות פיפטה. חזור על שלב זה לקבלת סך של שתי שטיפות עם 80% אתנול.
  6. סובבו במהירות את הצינורות במהירות של 100 × גרם, הניחו את הצינורות בחזרה על המדף המגנטי, והסירו כל שאריות אתנול באמצעות פיפטה לאחר שהסלרי התבהר. מייבשים את החרוזים באוויר למשך 5 דקות בעוד הצינורות נשארים על המדף המגנטי כשהמכסה פתוח.
    הערה: אל תעלה על 5 דקות של זמן ייבוש מכיוון שהדבר יכול להפחית באופן משמעותי את תפוקת הדנ"א הסופית.
  7. הסר את הצינורות מהמדף המגנטי והרחיק את הדנ"א מהחרוזים על ידי הוספת 17 μL של 0.1x Tris-EDTA (TE) ב- pH 8. מערבבים היטב ומדגרים את הצינורות למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. מניחים את הצינורות על המדף המגנטי עד שהסלרי מתבהר. לאחר שהסלורי התבהר, העבירו בזהירות 15 μL של חומר העל לצינור PCR סטרילי של 0.2 מ"ל.
  9. מדוד את ריכוז הדנ"א שנאסף באמצעות פלואורומטר בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    הערה: בדרך כלל, ריכוז הדנ"א שנאסף הוא ~1 ng/μL. לפעמים, ריכוז הדנ"א שנאסף נמוך מכדי לכמת אותו באמצעות פלואורומטר. זה לא אינדיקטור לניסוי כושל. המשך בהכנת הספרייה ללא קשר לריכוז הדנ"א שנאסף.
  10. המשך לשלב 11 או אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 °C (75 °F) עד שיהיו מוכנות.

11. הכנת הספרייה לריצוף

הערה: השלבים הבאים משתמשים בערכת הכנת ספרייה זמינה מסחרית. בעת ביצוע שלבים באמצעות Ligation Master Mix, מזערו את הנגיעה בצינורות ושמרו אותם תמיד על הקרח.

  1. באמצעות 0.1x TE ב- pH 8, העלה את הנפח הכולל של ה- DNA CUT&RUN ל- 50 μL. צור תערובת מאסטר של 3 μL של תערובת אנזימי End Prep ו- 7 μL של מאגר תגובת הכנה סופית לכל דגימה. הוסיפו 10 μL של תערובת מאסטר לדנ"א של CUT&RUN וערבבו היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים.
  2. בצע סיבוב מהיר ב 100 × גרם כדי לאסוף את כל הנוזלים מצידי הצינור. הניחו את הצינורות בתרמוציפלר כשהמכסה המחומם מוגדר ל-≥75 מעלות צלזיוס והפעילו את תנאי הרכיבה על אופניים בטבלה 7.
    הערה: בהתאם לריכוזי הדנ"א של הקלט ההתחלתי שנאסף משלב 10, בצע את דילול המתאם הנדרש מטבלה 8.
  3. הוסיפו 2.5 μL של מתאם לכל דגימה וערבבו היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים.
    הערה: חשוב מאוד שהמתאם יתווסף לדוגמה ויערבב היטב לפני הוספת תערובת ההצמדה הראשית.
  4. צור תערובת מאסטר של 30 μL של Ligation Master Mix ו- 1 μL של משפר Ligation. הוסף 31 μL של תערובת המאסטר לדגימות(ים). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים.
  5. דגירה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתרמוציקלר עם המכסה המחומם כבוי.
    הערה: חשוב מאוד לשמור דגימות על קרח ולהעבירן לתרמוציקלר רק לאחר שהתרמוציקלר הגיע ל-20 מעלות צלזיוס.
  6. בצע סיבוב מהיר ב 100 × גרם כדי לאסוף את כל הנוזלים מצידי הצינור, להוסיף 3 μL של אנזים כריתת Uracil, ולדגום את הצינורות ב thermocycler ב 37 ° C במשך 15 דקות עם המכסה המחומם מוגדר ≥47 ° C.
    הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה; אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או המשך ישירות לשלב 11.7. אם ממשיכים ישירות לשלב 11.7, דגרו את חרוזי טיהור הדנ"א בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש.
  7. הוסף 154.4 μL (נפח דגימה של פי 1.6 בקירוב) של חרוזי טיהור הדנ"א לתגובת קשירת המתאם משלב 11.6. פיפט-לערבב ולדגום את הדגימות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. הניחו את הצינורות על המדף המגנטי ולאחר שהסלרי התבהר, הסירו והשליכו בזהירות את ה-supernatant באמצעות פיפטה.
  9. הוסיפו 200 μL של אתנול טרי, בטמפרטורת החדר 80% אתנול לצינורות ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות. יש להסיר ולהשליך בזהירות את ה-supernatant באמצעות פיפטה ולחזור על שלב זה במשך שתי שטיפות בסך הכל עם 80% אתנול.
  10. סובבו את הצינורות לזמן קצר ב-100 × גרם. הניחו את הצינורות בחזרה על המדף המגנטי והסירו כל שאריות אתנול באמצעות פיפטה. אוויר לייבש את החרוזים במשך 5 דקות בעוד הצינורות נשארים על המדף המגנטי עם המכסה פתוח.
    הערה: אל תעלה על 5 דקות של זמן ייבוש מכיוון שהדבר יכול להפחית באופן משמעותי את תפוקת הדנ"א הסופית.
  11. הסר את הצינורות מהמדף המגנטי והרחיק את הדנ"א מהחרוזים על ידי הוספת 17 μL של 0.1x TE ב- pH 8. מערבבים היטב ודגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. מניחים את הצינורות על המדף המגנטי עד שהסלרי מתבהר. לאחר שהסלורי התבהר, העבירו בזהירות 15 μL של חומר העל לצינור PCR סטרילי של 0.2 מ"ל.
  13. צרו תערובת מאסטר של 25 μL של דנ"א פולימראז מאסטר מיקס ו-5 μL של פריימר הגברה אוניברסלי של הספרייה הקדמית (10 μM) לכל דגימה.
    הערה: הכן מדגם אחד נוסף של תערובת מאסטר כדי לקחת בחשבון הפסדי צנרת.
  14. הוסף 30 μL של התערובת הראשית ל-15 μL של דגימת דנ"א הקשורה למתאם. הוסף 5 μL של פריימר הגברה הפוך של ספריה עם אינדקס ייחודי (10 μM) לכל דגימה כדי להביא את עוצמת הקול הסופית לסך כולל של 50 μL. יש לערבב ביסודיות על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים. בצע את תנאי רכיבת האופניים של PCR בטבלה 9.
    הערה: דגירה של חרוזי טיהור הדנ"א בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש.
  15. מערבולת חרוזי טיהור הדנ"א להחייאה. הוסף 35 μL (נפח דגימה של כ-0.7x) של החרוזים המוחזקים בהחייאה לדגימות הדנ"א המוגברות ב-PCR. מערבבים ומדגרים את הדגימות על מנוטע במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  16. הניחו את הצינורות על המדף המגנטי וברגע שהסלרי ברור, העבירו את ה-supernatant המכיל את הדנ"א לצינור רצועת PCR חדש של 0.2 מ"ל 8 בארות.
  17. הוסף 119 μL (~ פי 1.4 מדגם נפח) של חרוזים לדגימה, וערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים. דגירה של הדגימות על מנוטע למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  18. הניחו את הצינורות על המדף המגנטי ולאחר שהסלרי התבהר, הסירו והשליכו בזהירות את ה-supernatant באמצעות פיפטה.
  19. הוסיפו 200 μL של אתנול טרי, בטמפרטורת החדר 80% אתנול לצינורות ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות. בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה; חזור על השלב בסך הכל שתי שטיפות עם 80% אתנול.
  20. סובבו את הצינורות לזמן קצר ב-100 × גרם. הניחו את הצינורות בחזרה על המדף המגנטי והסירו כל שאריות אתנול באמצעות פיפטה. מייבשים את החרוזים באוויר למשך 5 דקות בעוד הצינורות נשארים על המדף המגנטי כשהמכסה פתוח.
    הערה: אל תעלה על 5 דקות של זמן ייבוש מכיוון שהדבר יכול להפחית באופן משמעותי את תפוקת הדנ"א הסופית.
  21. הסר את הצינורות מהמדף המגנטי והרחיק את הדנ"א מהחרוזים על ידי הוספת 14 μL של 0.1x TE ב- pH 8. מערבבים היטב ודגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  22. מניחים את הצינורות על המדף המגנטי עד שהסלרי מתבהר. לאחר שהסלרי התבהר, העבירו בזהירות 13 μL של ה-supernatant לצינור PCR סטרילי של 0.2 מ"ל.
  23. מכינים טרי 1x Tris-borate-EDTA (TBE) ומכניסים ג'ל TBE 10% אקרילאמיד 10% קרמי מוכן מראש למנגנון האלקטרופורזה של הג'ל המלא ב-1x TBE.
  24. בבאר הראשונה, הוסף 2 μL של סולם DNA לטווח נמוך. יש לערבב 3 μL של 6x צבע טעינה עם 13 μL של הדגימה שנאספה בעבר משלב 11.22. יש להוסיף בזהירות 15 μL לכל באר של הג'ל. הפעל את הג'ל במשך 90 דקות ב 70 V.
    הערה: מומלץ להשאיר באר אחת בג'ל ריקה בין כל דגימה, מכיוון שהדבר מקטין את הסבירות לזיהום צולב של דגימה. משתמשים מנוסים עשויים למצוא לנכון להשתמש בכל הבארות תוך הימנעות זהירה מזיהום צולב, במיוחד בעת עיבוד מספר רב של דגימות.
  25. מוציאים את יציקת הג'ל מקופסת הג'ל. פתחו את יציקת הג'ל בהתאם להוראות היצרן, הסירו בעדינות את הג'ל מיציקת הג'ל והניחו אותו בתוך מגש החזקת ג'ל המכיל 100 מ"ל של 1x TBE.
    הערה: הקפידו להסיר בעדינות את הג'ל מיציקת הג'ל כדי להימנע מקריעת הג'ל מכיוון שהוא דק ושברירי. זה קריטי לכפפות prewet ואת הג'ל עם 1x TBE בכל פעם טיפול בג'ל. מגש החזקת הג'ל צריך להיות מעט גדול יותר מגודל הג'ל (כ-0.5 אינץ' בכל צד). מכסי הפלסטיק המסופקים עם קופסאות אחסון של צינורות PCR 96 בארות הם מגשי אחיזה נוחים לגדלים סטנדרטיים של מיני ג'ל.
  26. מוסיפים 10 μL של כתם הג'ל של חומצת הגרעין למגש ומסתחררים בעדינות. יש לכסות בנייר כסף כדי להגן מפני אור ולדגום באופן סטטי בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  27. יש לשטוף את הג'ל פעמיים עם 100 מ"ל של מי ברז שעברו דה-יוניזציה. דמיינו את הג'ל תחת תאורת אור כחול באמצעות כיסוי מסנן ענבר (איור 2).
    הערה: ספריות מצליחות מציגות כתם בין 100 ל- 500 bp. תהיה גם רצועת דימר בולטת של כ-125 מתאם. הנוכחות של דימרים מתאם אינה אינדיקציה לאיכות ספרייה ירודה. כמות זו של דימרים של מתאמים היא בלתי נמנעת עבור ניסויי CUT&RUN המבוצעים על TFs בעלי שפע נמוך והיא תוצאה של הכמות הנמוכה של חומר קלט המשמש להכנת ספריות אלה. אין להשתמש באור אולטרה סגול, שעלול לפגוע בדנ"א.
  28. כפי שניתן לראות באיור 2, עבור כל ספרייה, חתכו את הג'ל מעט מעל רצועת הדימר הבולטת של המתאם באורך של ~125 bp (הקפדה להימנע מלגעת ברצועת הדימר של המתאם) ומתחת לסימן הסולם של 400 bp.
    הערה: חשוב להימנע מפס הדימר של ~125 מתאם. אפילו כמויות זעירות של דימרים מתאמים יפחיתו משמעותית את איכות הספרייה.
  29. נקבו את החלק התחתון של צינור 0.65 מ"ל באמצעות מחט 22 G והניחו את הצינור המנוקב בתוך צינור מיקרופוג' סטרילי של 2 מ"ל. מעבירים את פרוסת הג'ל לצינור המנוקב בתוך צינור המיקרופוג' 2 מ"ל.
  30. צנטריפוגה צינור מיקרופוגה 2 מ"ל המכיל את הצינור המנוקב 0.65 מ"ל ודגימה ב 10,000 × גרם בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות כדי לאסוף את סלסול הג'ל בתוך צינור מיקרופוג 2 מ"ל.
    הערה: הצינור המנוקב צריך להיות כעת ריק וניתן להשליך אותו. אם לצינור המנוקב עדיין נותר ג'ל כלשהו בפנים, הניחו את הצינור המנוקב בחזרה בתוך צינור המיקרופוגה 2 מ"ל והצנטריפוגה שוב על 10,000 × גרם בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות נוספות.
  31. לתעלת הג'ל שבתוך צינור המיקרופוג' 2 מ"ל, הוסיפו 300 μL של חיץ ג'ל קר כקרח וערבבו על מתזיט בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות לפחות או למשך הלילה (12-16 שעות).
  32. העבר את כל הנוזלים והג'לים לעמודת סינון של 0.22 מיקרומטר. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת; הנפח שנאסף צריך להיות ~ 300 μL.
  33. הוסיפו 450 μL (נפח דגימה של פי 1.5 בקירוב) של חרוזי טיהור DNA, דגירו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות על מחטף, ולאחר מכן הניחו את הדגימה על המדף המגנטי עד שהסלרי ברור.
    הערה: דגירה של חרוזי טיהור הדנ"א בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש.
  34. הסר והשליכו 500 μL של ה-supernatant, תוך הקפדה לא לשבש את החרוזים.
  35. הסר את הדגימה מהמדף המגנטי וערבב את החרוזים על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים. העבר 200 μL של הדגימה לתוך צינור רצועת PCR חדש.
  36. הניחו את שפופרת הפס על המדף המגנטי, ולאחר שהסלרי התפנה, הסירו והשליכו בזהירות את ה-supernatant באמצעות פיפטה.
  37. הוסיפו 200 μL של אתנול טרי, בטמפרטורת החדר 80% אתנול לצינורות ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות. בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה; חזור על שלב זה בסך הכל שתי שטיפות עם 80% אתנול.
  38. סובבו את הצינורות לזמן קצר ב-100 × גרם. הניחו את הצינורות בחזרה על המדף המגנטי והסירו כל שאריות אתנול באמצעות פיפטה. יש לייבש את החרוזים באוויר למשך עד 5 דקות, בעוד הצינורות נשארים על המדף המגנטי כשהמכסה פתוח.
    הערה: אל תעלה על 5 דקות של זמן ייבוש מכיוון שהדבר יכול להפחית באופן משמעותי את תפוקת הדנ"א הסופית.
  39. הסר את הצינורות מהמדף המגנטי והרחיק את הדנ"א מהחרוזים על ידי הוספת 17 μL של 0.1x TE ב- pH 8. מערבבים היטב ומדגרים את הצינורות למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  40. מניחים את הצינורות על המדף המגנטי עד שהסלרי מתבהר. לאחר שהסלורי התבהר, העבירו בזהירות 15 μL של חומר העל לצינור PCR סטרילי של 0.2 מ"ל.
  41. מדוד את כמות הספרייה הסופית באמצעות הפלואורומטר; השתמש בספריה סופית זו לריצוף.
    הערה: ניתן לאגד ולרצף עד 48 ספריות יחד בנתיב אחד באמצעות פלטפורמת ריצוף המספקת לפחות 300 מיליון קריאות של 40 bp או קריאות קצה זוגיות ארוכות יותר.

12. ניתוח רצף CUT&RUN

הערה: סעיף זה מציג את הפרוטוקול החישובי המשמש לניתוח נתוני רצף CUT&RUN. הפרוטוקול מתחיל בהגדרת הסביבה הווירטואלית החישובית ומלווה את המשתמשים בביצוע הפקודות במחשב המקומי שלהם. פרוטוקול זה יעבוד על כל המשאבים החישוביים, כגון מכונות מקומיות, שרתי ענן וירטואליים ואשכולות מחשוב בעלי ביצועים גבוהים. ניתן לגשת לכל נתוני CUT&RUN המוצגים במאמר זה ב- NCBI GEO תחת מספר ההצטרפות GSE193803.

  1. הורד את קוד המקור לניתוח CUT&RUN מ- https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
    הערה: זרימת העבודה תפעל בצורה הטובה ביותר במערכת הפעלה MacOS או Linux. משתמשי Windows יכולים להפעיל את זרימת העבודה באמצעות GitBash (ראה טבלת החומרים).
    1. הורד ישירות את הקוד מהדף GitHub על ידי לחיצה על לחצן הקוד הירוק | הורד את אפשרות ZIP . פתח את התיקיה למיקום רלוונטי במחשב המקומי.
  2. התקן את סביבת Conda (ראה טבלת החומרים) והפעל רק פעם אחת.
    הערה: זרימת עבודה זו משתמשת בסביבת כלי שורת הפקודה Conda כדי להתקין את כל התוכנות והכלים הנדרשים.
  3. לאחר התקנת Conda (הפעלה פעם אחת בלבד), צור סביבה וירטואלית באמצעות הקובץ המשלים 2 המצורף לפקודה הבאה:
    conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
  4. הפעל את הסביבה הווירטואלית בכל פעם שזרימת עבודה זו תבוצע באמצעות:
    conda הפעל
  5. ארגן את קבצי ה-FASTQ הגולמיים של הקלט לתיקיה אחת, באופן אידיאלי תיקיה אחת לכל ניסוי CUT&RUN.

13. יצירת קובץ הגנום ליישור

  1. צור את קובץ הגנום ליישור (הפעל רק פעם אחת עבור כל קובץ גנום). צור תיקיה לשמירת כל קבצי הגנום של C. albicans , כגון:
    mkdir ca_genome_files

14. הורדת מכלול הגנום של C. albicans 21

  1. הורד את מכלול הגנום של C. albicans 21 ממסד הנתונים של הגנום של קנדידה באמצעות כלי wget או curl (ראה טבלת החומרים)18.
    הערה: מכלול C. albicans 21 שימש כאן כדי להשוות את תוצאות CUT&RUN עם תוצאות שבב ChIP שפורסמו בעבר, אשר היו מיושרות לאסיפה 21. משתמשים יכולים להוריד גרסאות הרכבה אחרות ולהפעיל פקודות דומות כדי ליצור קבצי גנום רלוונטיים לצרכי היישור שלהם.

15. צור מסד נתונים של אינדקס Bowtie 2 (שם מסד הנתונים: ca21)

  1. השתמש בפעולות הבאות:
    bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
    bowtie2-inspect -s ca21

16. הפעל את צינור הניתוח CUT&RUN

  1. קרא את סעיף העזרה כדי להכיר את הפרמטרים של הצינור.
    bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. בצע את קובץ cut_n_run_pipeline.sh עם פרמטרים רלוונטיים

  1. הפעל את הסקריפט:
    bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
    הערה: הפרמטרים הרלוונטיים עם תיאורים מפורטים בשורות 19-36 של הקוד מתוארים בדף GitHub https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. ארגון קבצי פלט

  1. מזג פסגות משמעותיות מכל השכפולים הנקראים על-ידי MACS2 הממוקמים ב-/path/to/input/folder/peakcalling/macs2 באמצעות פונקציית המיזוג BedTools19.
    cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sort -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o אחרון,ממוצע,ראשון,ממוצע,ממוצע,ממוצע,ממוצע > /path/to/merged_output.bed
    הערה: לקבלת מידע נוסף ושיטות עבודה מומלצות להערכת פסגות חופפות בדגימות משוכפלות, עיין ב- Landt et al.20 ו- Boyd et al.21.

19. הסר התאמות לאזורים גנומיים ברשימת חסימות באמצעות פונקציית החיסור של BedTools

  1. השתמש באפשרויות הבאות: חיסור מיטה -a /נתיב/אל/merged_output.מיטה -b /path/to/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
    הערה: האזורים החסומים בגנום של C. albicans מסופקים כקובץ .bed בקובץ משלים 3. הרשימה מורכבת בעיקר מרכיבי רצף ואזורים שחוזרים על עצמם מאוד, כגון חזרות טלומריות וצנטרומרים שבדרך כלל מניבים תוצאות חיוביות כוזבות בערכות נתונים C. albicans CUT&RUN, ChIP-seq ו-ChIP-chip. לפיכך, מומלץ להסיר את האזורים החסומים. עם זאת, עבור מטרות חלבון מסוימות, זה עשוי להיות לא הולם או לא רצוי להחריג את המוקדים האלה. משתמשים יכולים לדלג על שלב זה כדי לשמור אותות הכלולים באזורים אלה ברשימת החסימות או ליצור אזורים חסומים משלהם.

20. מיזוג קבצי BigWig משכפולים באמצעות הפונקציה UCSC bigWigMerge22

  1. השתמש בדברים הבאים: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
  2. המר את פלט ה- BedGraph מ- bigWigMerge ל- BigWig באמצעות הפונקציה UCSC bedGraphToBigWig.
    bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

תוצאות

פרוטוקול CUT&RUN חזק זה הותאם והותאם לחקר לוקליזציה כלל-גנומית של TFs ספציפיים בביופילמים של C. albicans ובתרביות פלנקטוניות (ראו איור 2 לסקירה כללית של הגישה הניסויית). צינור ניתוח נתונים יסודי נכלל גם כדי להקל על ניתוח נתוני הריצוף של CUT&RUN שהתקבלו, ודורש מהמשתמשים מומחיות מיני...

Discussion

פרוטוקול זה מציג צינור ניסיוני וחישובי מקיף ללוקליזציה כלל-גנומית של TFs רגולטוריים ב- C. albicans. הוא מתוכנן להיות נגיש מאוד לכל מי שיש לו הכשרה סטנדרטית במיקרוביולוגיה וביולוגיה מולקולרית. על ידי מינוף הטווח הדינמי הגבוה ודרישות קלט הדגימה הנמוכות של מבחן CUT&RUN וכולל אופטימיזציות ללוקלי?...

Disclosures

קלריסה ג'יי נובל היא מייסדת שותפה של BioSynesis, Inc., חברה המפתחת דיאגנוסטיקה וטיפולים לזיהומי ביופילם.

Acknowledgements

אנו מודים לכל חברי מעבדות נובל והרנדאי בעבר ובהווה על המשוב על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) מספר R35GM124594 ועל ידי משפחת קמנגר בצורה של כיסא ניחן ל- C.J.N. עבודה זו נתמכה גם על ידי פרס המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של NIH (NIAID) מספר R15AI137975 ל- A.D.H.C.L.E. נתמך על ידי מלגת המכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניופציאלי של NIH (NIDCR) מספר מלגת F31DE028488. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של הכותבים ואינו מייצג את דעותיהם של המממנים. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר; באיסוף, ניתוח או פרשנות של נתונים; בכתיבת כתב היד; או בהחלטה לפרסם את התוצאות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm filterMillipore SigmaSLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubesVWR490003-190
1 M CaCl2Fisher Scientific50-152-341
1 M PIPESFisher ScientificAAJ61224AK
12-well untreated cell culture platesCorning351143
2-mercaptoethanolSigma-Aldrich60-24-2
2% DigitoninFisher ScientificCHR103MI
50 mL conical tubesVWR89039-658
5x phusion HF bufferFisher ScientificF530SItem part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
AgarCriterionC5001
Agencourt AMPure XP magnetic beadsBeckman CoulterA63880
Agilent BioanalyzerAgilentG2939BAReferred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport ScientificVWR89133-910
Bacto peptoneBD Biosciences211677
Benchling primer design toolBenchlinghttps://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
BetaineFisher ScientificAAJ77507AB
Calcofluor white stainSigma-Aldrich18909-100ML-F
Candida Genome Databasehttp://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beadsPolysciences 86057-3
Conda softwarehttps://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl toolhttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kitEpicypher14-1048Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)New England BiolabsN0447S
Dextrose (D-glucose)Fisher ScientificD163
Difco D-mannitol BD Biosciences217020
Disposable cuvettesFisher Scientific14-955-127
Disposable transfer pipetsFisher Scientific13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)Fisher ScientificR0611
DreamTaq green DNA polymeraseFisher ScientificEP0713Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase bufferFisher ScientificEP0713Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNAEpicypher18-1401
ELMI Microplate incubatorELMITRMS-04Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction BufferItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proofVWR89125-170
FastDigest MssIFisher ScientificFD1344Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI BufferFisher ScientificFD1344Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400Fisher BioReagentsBP525-25
Fluorescence microscopeUser-dependent
Gel electrophoresis apparatusUser-dependent
GeneRuler low range DNA ladderFisher ScientificFERSM1192
GitBash workflowhttps://gitforwindows.org/
GitHub source codehttps://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5Boston BioProductsBBH-75-K
High-speed centrifugeUser-dependent
IsopropanolSigma-AldrichPX1830-4
Lens paperVWR52846-001
Ligation EnhancerItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrateMP Biomedicals215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibodyTakara632592User-dependent
MACS2https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubesEpicypher10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubesFisher ScientificMR02
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometerBioTekEPOCH2TCReferred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiViewhttp://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPSSigma-AldrichM3183
NaClVWR470302-522
NaOHFisher ScientificS318-500
NCBI GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kitNew England BiolabsE7645SReferred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)GoldbioN-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 wellFisher ScientificEC62755BOX
Nutating mixerVWR82007-202
Nutrient brothCriterionC6471
pADH110Addgene90982Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119Addgene90985Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137Addgene90986Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139Addgene90987Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140Addgene90988Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNaseEpicypher15-1016 or 15-111650 rxn or 250 rxn
pCE1Addgene174434Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lidFisher ScientificFB0875712
Phusion high fidelity DNA polymeraseFisher ScientificF530SReferred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350VWR10791-816
Potassium phosphate monobasicFisher ScientificP285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kitInvitrogenQ33230
Qubit fluorometerLife TechnologiesQ33216Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibodyEpicypher13-0042
RNase ASigma-Aldrich10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tabletsSigma-Aldrich5056489001
RPMI-1640Sigma-AldrichR6504
Shaking incubatorEppendorfM12820004User-dependent
SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
Spin-X centrifuge tube filtersFisher Scientific07-200-385
Sterile inoculating loopsVWR30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stainFisher ScientificS11494
SYTO 13 nucleic acid stainFisher ScientificS7575Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
ThermocyclerUser-dependent
ThermoMixer CEppendorf5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethaneSigma-Aldrich252859-100G
Ultra II Ligation Master MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solutionInvitrogen15632011
USER EnzymeItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixerVWR10153-834
wget toolhttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Yeast extractCriterionC7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)Fisher ScientificNC0439194

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
  3. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
  4. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
  5. Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
  6. Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
  7. Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
  8. Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
  9. Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
  10. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
  11. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
  12. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  13. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
  14. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  15. Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
  16. Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
  17. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
  18. Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  21. Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
  22. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  23. Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
  24. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  25. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  26. Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
  27. Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
  28. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182CUT RUN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved