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摘要

该协议描述了一种实验方法和数据分析工作流程，用于在靶标下切割并使用核酸酶（CUT&RUN）在人类真菌病原体 白色念珠菌中释放。

摘要

调节转录因子控制许多重要的生物过程，包括细胞分化，对环境扰动和压力的反应以及宿主 - 病原体相互作用。确定调节转录因子与DNA的全基因组结合对于了解转录因子在这些通常复杂的生物过程中的功能至关重要。使用核酸酶（CUT&RUN）在靶标下切割和释放是一种用于 体内 蛋白质 - DNA结合相互作用的全基因组图谱的现代方法，是传统和广泛使用的染色质免疫沉淀随后测序（ChIP-seq）方法的有吸引力的替代方案。CUT&RUN适用于更高通量的实验设置，并且具有比ChIP-seq更高的动态范围和更低的每样本测序成本。在这里，描述了一个全面的CUT&RUN方案和随附的数据分析工作流程，这些工作流程是为全基因组分析人类真菌病原体 白色念珠菌 中的转录因子 - DNA结合相互作用而量身定制的。这个详细的方案包括所有必要的实验程序，从转录因子编码基因的表位标记到测序的文库准备;此外，它还包括用于CUT&RUN数据分析的定制计算工作流程。

引言

白色念珠菌 是一种临床相关的多态性人类真菌病原体，以各种不同的生长模式存在，例如浮游（自由浮动）生长模式和作为由细胞外基质保护的紧密粘附的细胞群落，称为生物膜生长模式1，2，3。与其他发育和细胞过程类似，生物膜发育是白色 念珠菌 的一种重要的毒力性状，已知其在转录水平上由以序列特异性方式与DNA结合的调节转录因子（TFs）控制4。最近，染色质调节剂和组蛋白修饰剂也成为通过介导DNA可及性成为 白色念珠菌 生物膜形成5 和形态发生6 的重要调节剂。为了了解这种重要真菌病原体的复杂生物学，在不同的发育和细胞过程中确定特定TF的全基因组定位的有效方法是有价值的。

染色质免疫沉淀后测序（ChIP-seq）是研究白色念珠菌5，6中蛋白质 - DNA相互作用的广泛方法，并且在很大程度上取代了更经典的染色质免疫沉淀，然后是微阵列（ChIP-chip）9方法。然而，ChIP-seq和ChIP芯片方法都需要大量的输入细胞10，这在特定样品和生长模式的背景下研究TF时可能是一个复杂的因素，例如从患者收集的生物膜或感染的动物模型。此外，染色质免疫沉淀（ChIP）测定通常在整个基因组中产生大量的背景信号，需要高水平的富集以使目标靶标充分分离信号与噪声。虽然ChIP芯片测定在今天基本上已经过时了，但ChIP-seq所需的测序深度使得这种测定对于许多研究人员来说过于昂贵，特别是那些研究多种TF和/或染色质相关蛋白的研究人员。

使用核酸酶（CUT&RUN）在靶标下切割和释放是ChIP-seq的有吸引力的替代品。它由Henikof实验室于2017年开发，以规避ChIP-seq和染色质内源性裂解的局限性，然后对ChEC-seq11，12进行测序，这是另一种在全基因组水平上鉴定蛋白质 - DNA相互作用的方法，同时提供TF和染色质相关蛋白质的高分辨率，全基因组图谱13.CUT&RUN依赖于使用系留微球菌核酸酶在透化核内靶向消化染色质，然后对消化的DNA片段9，10进行测序。由于DNA片段是在由目标蛋白质结合的位点特异性生成的，而不是像ChIP测定那样通过随机片段化在整个基因组中产生，因此CUT&RUN方法导致背景信号大大减少，因此，与ChIP-seq 11，13相比，需要测序深度的1/10，14.这些改进最终导致测序成本的显着降低，并减少了每个样品作为起始材料所需的输入细胞总数。

在这里，描述了一个强大的CUT&RUN方案，该方案已经过调整和优化，用于确定从生物膜和浮游培养物中分离的 白色念珠菌 细胞中TF的全基因组定位。还提供了一个全面的数据分析管道，该管道可以处理和分析生成的序列数据，并要求用户在编码或生物信息学方面具有最少的专业知识。简而言之，该协议描述了TF编码基因的表位标记，生物膜和浮游细胞的收获，完整透化核的分离，针对特定蛋白质或表位标记的蛋白质的一抗孵育，嵌合A / G-微球菌核酸酶（pAG-MNase）融合蛋白与一抗的系留，染色质消化后的基因组DNA恢复以及用于测序的基因组DNA文库的制备。

实验性的CUT&RUN协议之后是一个专门构建的数据分析管道，该管道以FASTQ格式进行原始DNA测序读取，并实施所有必需的处理步骤，以提供由感兴趣的TF（由一抗靶向）结合的显着富集位点的完整列表。请注意，所描述的文库制备方案的多个步骤已针对TF（而不是核小体）的CUT&RUN分析进行了专门调整和优化。虽然本手稿中提供的数据是使用商业CUT&RUN试剂盒的TF特异性改编生成的，但这些方案也已使用单独来源的组分（即pAG-MNase酶和磁性DNA纯化珠）和内部制备的缓冲液进行了验证，这可以显着降低实验成本。下面以分步形式详细介绍了全面的实验和数据分析协议。所有试剂和关键设备以及缓冲液和培养基配方分别列在 材料表 和 补充文件1中。

研究方案

1. 白色 念珠菌菌株的表位标记

  1. 将目的基因及其1 kb上游和下游侧翼序列从 念珠菌 基因组数据库上传到引物设计工具（参见 材料表）。通过突出显示终止密码子的上游和下游50 bp来设计指导RNA（gRNA），然后单击右侧的 gRNA选择 工具。选择" 设计和分析参考线"。使用 Ca22（白色念珠菌 SC5314 组装 22（二倍体））基因组和 NGG（SpCas9，3' 侧）原间隔相邻基序 （PAM） 作为指导参数，然后单击 完成。图1 描述了用增强的绿色荧光蛋白（eGFP）标记感兴趣的 白色念珠菌 基因的表位的工作流程。
    1. 在随后的页面上，确认gRNA设计的靶区，然后按绿色按钮。按 目标分数对 gRNA 进行排序。
      注意:引物设计工具计算靶向和脱靶评分，以量化gRNA的特异性。理想的指南的靶向得分为>60，脱靶得分约为33，并且与终止密码子重叠。这可实现高gRNA特异性，同时在GFP整合后消融gRNA靶向。脱靶评分约为50的gRNA表明等位基因变异;因此，只有一个等位基因将被gRNA识别。
    2. 将序列（5'-CGTAAACTATTTTAATTTG-3'）和（5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'）分别添加到20 bp gRNA靶序列的5'和3'末端，产生60 bp引物/寡核苷酸。或者，将20 bp序列复制到Nguyen等人提供的gRNA计算器中。订购60 bp定制gRNA寡核苷酸。
    3. 用100 mM AHO1096（5'-GACGGCACGGCCGCGTTTAAACCGCC-3'）和100 mM AHO1098（5'-CAAATAAAAATAGTTTACCAAG-3'）扩增"通用A片段"，并使用步骤1.1.2中的自定义60 bp gRNA寡核苷酸（100 mM）扩增"独特B片段"。和100 mM AHO1097（5'-CCCGCCAGGCGCTGGTTTAAACACCG-3'）分别使用pADH110（质粒储存库ID# 90982）和pADH139（质粒储存库ID# 90987）作为模板DNA。使用 表1中提供的PCR反应和循环条件。
      注意:pADH139对携带异源 麦芽糖念珠菌LEU2 标志物的菌株具有特异性。如果使用具有白色 念珠菌LEU2 基因单个拷贝的菌株，则用pADH119（质粒储存库ID#90985）代替pADH139。
    4. 通过在1%琼脂糖凝胶上检查5μLPCR来确认成功扩增。寻找 ~1 kb A 和 B 片段扩增子。
    5. 混合1μLA和B片段，并使用 表2 中提供的PCR反应和循环条件将它们拼接在一起，以产生全长C片段。
    6. 向每个PCR反应中加入0.5μL的100mM AHO1237（5'-AGGTGATGCTGACTATTGAAG-3'）和0.5μL的100mM AHO1453（5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3'），通过移液充分混合，并完成 表3中列出的循环条件。
      注意:如果使用 pADH119 代替 pADH139，请用 AHO1238 （5'-TGTATTTTTTTTTTAAAATTGTGTGACTGTTTC-3'） 代替 AHO1453。
    7. 通过在1%琼脂糖凝胶上检查5μLPCR来确认C片段的正确拼接和扩增。寻找一个 ~2 kb 的扩增子。将C片段储存在-20°C直至准备使用。
      注意:如果拼接和扩增导致多个非特异性条带或涂片，请对A和B片段进行PCR清除，并从步骤1.1.5开始重复。
  2. 使用引物设计工具，将整个CTG优化的单体eGFP与连接子序列（RIPLING）16 （pCE1，质粒存储库ID# 174434）添加到目标基因的终止密码子的上游，创建C端翻译融合。使用这种构建体来设计寡核苷酸，用于从pCE1扩增供体DNA（dDNA）。
    1. 设计一种与连接子序列具有18-22 bp同源性，并且与开放阅读框（ORF）的3'末端>50 bp同源性的前向寡核苷酸。
      注意:18-22 bp 同源性在 55 °C 和 58 °C 之间产生用于放大的退火温度。 如果全长寡核苷酸形成引物二聚体，则相应地调整与连接子序列/ GFP或基因组的同源性。
    2. 创建一个反向寡核苷酸，与GFP的3'末端具有18-22 bp同源性，与要标记的ORF的下游非编码序列具有>50 bp同源性。
    3. 对这些寡核苷酸进行排序，并使用 表4中提供的触地PCR循环条件扩增dDNA。
  3. 设计两组集落PCR（cPCR）寡核苷酸，通过跨侧翼整合位点扩增来确认GFP的整合。首先，使用引物设计工具选择正向dDNA寡核苷酸，然后单击右侧的 引物 按钮。
    1. 点击 创建引物|向导|Tm 参数 并确认算法设置为 SantaLucia 1998。单击" 使用选择" 以输入在1.2.1中设计的正向寡核苷酸作为靶序列的坐标。
    2. 将最佳引物温度设置为 55 °C，将最大扩增子尺寸设置为 900 bp，然后单击右上角的 生成引物 按钮。
    3. 选择惩罚得分最低的寡核苷酸对，并确认引物在5'整合位点上扩增。确保正向 cPCR 引物位于正向 dDNA 引物序列的上游，反向 cPCR 引物完全位于 eGFP 标记或连接子序列内。
    4. 重复步骤 1.3-1.3.3。用反向dDNA寡核苷酸产生第二组cPCR寡核苷酸，其在3'整合位点上扩增。确保正向 cPCR 引物完全位于 eGFP 标记或连接子序列内，以及反向 dDNA 引物序列下游的反向 cPCR 引物内。
    5. 订购这些寡核苷酸。
  4. 消化2，500ng的pADH140，其中含有Cas9（质粒储存库ID#90988），每个基因都有GFP标记的限制性内切酶。将每次消化的总体积设置为15μL;根据pADH140质粒浓度相应地调节水的体积。使用 表 5 中指定的消解条件。将消化的质粒储存在-20°C直至准备使用。
    注意:如果用白色 念珠菌LEU2 基因的单个拷贝转化菌株，而不是异源 的C. maltosa LEU2 标记，用pADH137（质粒储存库ID#90986）代替pADH140。
  5. 每个基因的12μL 10mg / mL鲑鱼精子DNA变性，该基因将在99°C下GFP标记10分钟，并迅速冷却至≤4°C。 储存在-20°C直至准备使用。
  6. 将 白色念珠菌 LEU2 半合子神经激素敏感菌株划线到酵母蛋白胨葡萄糖 （YPD） 平板上，并在 30 °C 下孵育两天。
  7. 选择单个菌落并将其转移到4 mL液体YPD中。在30°C下孵育12-16小时，以250rpm振荡。
  8. 使用一次性比色皿（1mL，1cm路径长度）在分光光度计中测量过夜（12-16小时）培养物的600nm（OD 600）处的光密度。
  9. 将过夜培养物稀释到锥形瓶中，使其OD600 为0.1 in YPD。每个反应占 5 mL，并额外增加 5 mL，用于稍后检查 OD600 。
    注意:培养物的体积取决于转化反应的数量。
  10. 将稀释的过夜培养物在30°C振荡培养箱中孵育，以250rpm振荡，直到其OD600 达到0.5-0.8。
  11. 在室温下以4，000× g 离心5分钟;除去并丢弃上清液。
  12. 通过与过滤尖端的轻柔移液管混合，将细胞沉淀重悬于1 mL无菌水中，并转移到无菌1.5 mL微量离心管中。
  13. 通过在室温下以4，000× g 离心1分钟来沉淀细胞;除去并丢弃上清液。重悬于1 mL无菌水中，重复洗涤共两次。
  14. 将沉淀重悬于步骤1.10中 所用体积的1/100。例如，如果使用15mL，则将沉淀重悬于150μL无菌水中。
  15. 在用于每个转化反应的单独试管中，混合50μLC片段，50μLdDNA，2，500ng限制性内切酶消化的pADH140和10μL变性鲑鱼精子DNA。
  16. 从步骤1.14中加入50μL细胞浆料并通过移液混合。
  17. 制作板混合物的储备（补充文件1）以进行n + 1转换。
  18. 将1 mL平板混合物加入细胞/ DNA混合物中，并通过倒置5次混合。
    注:在倒置时点击管子的底部以除去任何剩余的液体。
  19. 将混合物置于30°C的培养箱中过夜（12-16小时）而不摇动。
  20. 在水浴中在44°C下对细胞进行热电泳15分钟。
  21. 在室温下以5，000× g 离心1.5mL微量离心管2分钟。
  22. 使用无菌移液器吸头通过真空抽吸除MAPE混合物，小心避免干扰细胞沉淀。
  23. 将细胞沉淀重悬于1mL YPD中，在室温下以4，000× g 离心1分钟沉淀，并除去并丢弃上清液。重复第二次洗涤，将细胞沉淀重悬于1 mL YPD中，并将悬浮液转移到含有额外1 mL YPD（2 mL最终体积）的10mL圆底一次性培养管中。在30°C下以250rpm振荡5小时回收细胞。
  24. 将管在室温下以4，000× g 离心5分钟;除去并丢弃上清液。
  25. 将细胞沉淀重悬于100μL无菌水和板上，并加200μg/ mL牛皮酸甘油素（NAT200）的YPD上。在30°C孵育2-3天。
  26. 将100μL的20mM NaOH等分到96孔PCR板的孔中，每个孔对应于在NAT200板上生长的单个集落。使用无菌牙签或移液器吸头，选择单个转化的菌落，将它们贴片到新的NAT200板上，并将剩余的细胞旋转到具有20mM NaOH的孔中。对剩余的菌落重复上述步骤，以产生用作cPCR反应DNA模板的细胞裂解物。
  27. 密封PCR板并在99°C下在带有加热盖的热循环仪中孵育10分钟。
  28. 使用步骤1.3-1.3.5中设计的寡核苷酸建立两个cPCR反应。根据需要增加反应次数。按照循环条件与步骤1.26中制备的细胞裂解物和 表6中的PCR反应混合物进行PCR反应。在1%琼脂糖凝胶上从每个孔中电泳10-20μL。寻找两个cPCR引物组扩增的菌落，表明GFP dDNA正确掺入。
  29. 在缺乏亮氨酸的合成完全 （SC） 培养基上掺入 GFP 的 Restreak 菌落。在30°C培养箱中孵育2-3天。选择单个菌落并贴片到YPD和YPD上，并补充400μg/ mL牛血清（NAT400）板。将24小时后未能在NAT400板上生长的菌落识别为成功失去CRISPR成分的菌落。
  30. 通过使用YPD贴片板中的细胞重复步骤1.25-1.28来确认GFP标签被保留。如果存在正确的条带，接种4 mL YPD并生长过夜（12-16小时），如步骤1.7中所述。
  31. 将新的GFP标记菌株的过夜培养物与过滤器灭菌的50%甘油在无菌冷冻管中以1:1的比例混合。储存在-80°C，并根据需要在YPD板上重新反应。
    注意:建议通过荧光显微镜确认标记TF的核定位并在适当的表型测定中确认野生型表型，从而验证GFP标记的菌株。

2. 生物膜培养物的样品制备

  1. 条纹 白色念珠菌 GFP标记的菌株在YPD琼脂平板上，并在30°C下孵育2-3天。使用从琼脂平板中分离的单个菌落，接种到4mL的YPD液体培养基中。在30°C下振荡孵育过夜（12-16小时）。确定过夜培养物的OD600 。
    注意:建议每个样品使用三个生物重复进行CUT&RUN实验。
  2. 将无菌的12孔未经处理的细胞培养板与过夜培养物一起在罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）-1640 培养基中接种至最终OD 600 0.5（相当于2×107 细胞/ mL）至最终体积为2mL。在37°C下在微孔板培养箱中孵育90分钟，以250rpm振荡。
    注意:建议每个菌株使用一个12孔细胞培养板，其中一个孔未接种作为单独的培养基污染控制。该方案已成功应用，仅使用12孔细胞培养板孔（或少至500万个细胞）的1/10th 。使用更多数量的细胞会增加总DNA产量，这通常会导致高质量的测序文库。
  3. 使用通过柔性塑料管连接到真空捕集器装置上的无菌移液器吸头，通过抽吸去除未粘附的细胞。用2mL无菌的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤粘附的细胞一次。向孔中加入2mL新鲜RPMI-1640培养基，并在37°C下孵育24小时，以250rpm振荡。
    注意:在不同菌株和/或条件下的孔之间更换移液器吸头。吸气时不要用尖端刮掉井底。
  4. 在24小时孵育结束时，收集并从11个接种孔中的每一个中收集并池化液体和生物膜材料到单个无菌的50mL锥形管中。如果同时处理多个菌株或生长条件，则根据需要使用独立池重复上述步骤。
    注意:用移液器过滤器尖端刮擦每个孔的底部和边缘，以去除仍然粘附在表面上的细胞。使用移液器使生物膜均质化。
  5. 通过在室温下以4，000× g 离心5分钟来沉淀样品。尽可能多地倾析上清液，注意尽量减少颗粒的破坏。将沉淀在液氮中速冻，并在收集后立即储存在-80°C或直接继续至步骤4（分离细胞核）。

3. 浮游培养物的样品制备

  1. 条纹 白色念珠菌 GFP标记的菌株在YPD琼脂平板上，并在30°C下孵育2-3天。使用从琼脂平板中分离的单个菌落，接种到4mL的YPD液体培养基中。在30°C下振荡孵育过夜（12-16小时）。确定过夜培养物的OD600 。
  2. 在50 mL RPMI-1640液体培养基中将阴极600的0.1的OD 600反向稀释过夜培养物，并在30°C下以225rpm振荡2-5小时，直到OD600 在0.5和0.8之间。
    注意:细胞在收获前应经历至少两次倍增。用于浮游培养的条件可以根据需要进行调整。
  3. 通过在室温下以4，000× g 离心5分钟来沉淀样品。尽可能多地倾析上清液，注意尽量减少颗粒的破坏。将沉淀在液氮中速冻，并在收集后立即储存在-80°C或直接继续至步骤4（分离细胞核）。

4. 细胞核分离

注意:在实验当天，制备新鲜的Ficoll缓冲液，将2-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂加入到复苏缓冲液的等分试样中，并将蛋白酶抑制剂加入SPC缓冲液的等分试样中（见 补充文件1）。要重悬沉淀，请使用200μL或1mL移液器吸头轻轻移液，以避免损坏细胞或细胞核。在开始原子核隔离之前，打开加热块将其预热至30°C。 该方案其余部分的所有移液器吸头和移液管均应经过 DNA/RNA 和不含 DNA/RNA 酶/RNase 的认证，并且建议在所有后续移液步骤中使用滤嘴吸头。

  1. 将沉淀重悬于1 mL室温重悬缓冲液中，并转移到无菌的1.5 mL微量离心管中。在室温下以2，000× g 沉淀2分钟，在桌面离心机中除去上清液。
    注意:使用200μL或1mL移液器吸头除去上清液，注意尽量减少沉淀的破坏。
  2. 将沉淀重悬于200μL室温重悬缓冲液中。从重悬的沉淀中，将5μL等分试样转移到新的PCR管中并将其储存在4°C以备以后使用。
    注意:该等分试样将在随后的质量控制步骤中用作对照，以评估分离的细胞核的质量。
  3. 以2，000× g 沉淀2分钟，并使用移液管除去并丢弃上清液。使用200μL重悬缓冲液重复洗涤步骤两次。
  4. 在室温下以2，000× g 离心2分钟并除去上清液。加入300μL重悬缓冲液和10μL裂解酶溶液（50mg / mL，见 材料表）。在30°C下在加热块中孵育30分钟。
    注意:或者，也可以使用加热到30°C的水浴代替加热块。这里使用的球化条件已经过优化，对 白色念珠菌的酵母和菌丝细胞都有效。当将此方案应用于具有影响细胞壁完整性或其他细胞形态的突变的 白色念珠菌 细胞时，建议优化球形形成条件。在这个30分钟的孵育步骤中，用户可以选择提前完成步骤5（Concanavalin A珠子活化）以节省时间。
    1. 关键步骤:在30分钟的孵育步骤之后，将5μL等分试样转移到新的PCR管中。对于步骤4.2中储存在4°C下的5μL分离的细胞核和5μL完整细胞的等分试样，加入1μL钙荧光白（荧光细胞壁染料）和1μLSYTO 13（核酸染色剂）。在30°C的黑暗中孵育30分钟。
    2. 使用荧光显微镜目视检查分离细胞核的完整性和纯度。寻找显示明显染色的完整细胞核（使用488-509nm激发滤光片）的分离细胞核，并确保钙荧光白色染料（使用390-420nm激发滤光片）没有细胞壁染色。在完整的对照细胞中，通过钙荧光白色染料（使用390-420nm激发滤光片）和染色的完整细胞核（使用488-509nm激发滤光片）寻找突出的细胞壁染色。
  5. 在4°C下以2，000× g 离心5分钟并除去上清液。使用1 mL滤嘴将沉淀重悬于500μL冰冷的重悬缓冲液中，轻轻上下移液5次。在4°C下以2，000× g 离心5分钟，并使用1mL移液器除去上清液。用1 mL新鲜制作的冰冷Ficoll缓冲液重悬沉淀。
    注意:从此时起将样品和缓冲液保存在冰上。
  6. 将样品在4°C下以5，000× g 离心10分钟并除去上清液。将沉淀重悬于500μL冰冷的SPC缓冲液中。
    注意:从此时开始，非常轻柔地处理原子核以避免损坏它们。
  7. 将样品在4°C下以5，000× g 离心10分钟，并除去尽可能多的上清液而不破坏沉淀。将含有颗粒核的试管放在冰上，然后继续步骤5。如果在步骤4.4中提前完成了步骤5，请继续执行步骤6或将颗粒在液氮中快速冷冻，并在收集后立即将其储存在-80°C。

5. 康卡那瓦林 A 珠子活化

注意:这是一个关键步骤。从现在开始，用户可以选择使用市售的CUT&RUN套件继续使用协议，或者单独采购关键组件并在内部准备缓冲液。如果使用商业试剂盒，除非另有说明，否则下面使用的所有缓冲液和试剂都包含在试剂盒中。 材料表中还提供了单独采购试剂的单独目录号。使用前将所有缓冲液放在冰上冷却。步骤 5 完成后，建议立即执行步骤 6。避免分离细胞核的多次冻融，因为已知它会增加DNA损伤，并可能导致质量差的结果。

  1. 使用移液器轻轻地重悬于锥形金刚烷A（ConA）珠子上。转移每个样品22μLConA珠悬浮液，在单个1.5 mL微量离心管中处理。将管子放在磁性架上，直到珠浆清除;使用移液器除去并丢弃上清液。
    注意:例如，当对总共10个样品进行CUT&RUN时，将220μLConA珠悬浮液转移到1.5 mL微量离心管中。
  2. 从磁性架上取出含有ConA珠的管子，并立即加入200μL冰冷的微球活化缓冲液，并使用移液管轻轻混合。将管子放在磁架上，直到珠浆清除;使用移液器除去并丢弃上清液。重复此步骤，总共进行两次洗涤。
  3. 将磁珠重悬于每个待处理的细胞核样品的22μL冰冷磁珠活化缓冲液中。将珠子放在冰上，直到需要为止。
    注意:后续步骤的吞吐量取决于可用磁管架的数量和容量。对于该方案的大多数用户来说，在两个16孔试管架中处理32个样品是一个可管理的数字。但是，对于更有经验的用户，或者如果有机器人液体处理系统，则可以获得更高的吞吐量。

6. 将细胞核与活化磁珠结合

注意:使用前将所有缓冲液放在冰上冷却。所有补充蛋白酶抑制剂的缓冲液应在实验当天新鲜制备。建议在后续步骤中使用0.2 mL带状管。

  1. 将步骤4中的颗粒状细胞核重悬于100μL冰冷的SPC缓冲液中，并转移到新的8管0.2mL条带中。向每个样品中加入20μL活化珠，然后轻轻移液以混合。在室温下孵育10分钟，不搅拌。
  2. 将管子放在磁架上，直到浆料清澈为止;使用移液器除去并丢弃上清液。从磁性架上取出试管，并向每个样品中加入200μL冰冷的洗涤缓冲液。通过轻轻上下移液5次来重悬珠子。将每个样品中的100μL等分试样转移到新的8管0.2mL条中。
    1. 关键步骤:将每个CUT&RUN样品分成两个单独的等分试样。将一种等分试样用于阴性对照抗体（例如，IgG阴性对照抗体），另一种用于针对目标蛋白质的靶抗体（例如，抗GFP抗体）。
      注意:计算流水线需要这两个样本来准确识别特定于目标TF的富集信号。也可以使用抗GFP抗体和未标记的菌株进行额外的控制。该对照显示的结果与在GFP标记的菌株中使用IgG抗体相当。因此，为简单起见，建议对所有实验使用标准IgG对照。

7. 一抗结合

注意:pAG-MNase融合蛋白与兔子，山羊，驴，豚鼠和小鼠IgG抗体17结合良好。通常，大多数商业ChIP-seq认证的商业抗体都与CUT&RUN程序兼容。使用的一抗量取决于抗体的效率，如果目标抗体以前未在 ChIP 或 CUT&RUN 实验中测试过，则可能需要对抗体进行滴定（例如，1:50、1:100、1:200 和 1:400 最终稀释）。使用前将所有缓冲液在冰上冷却。用于抗体结合步骤的所有缓冲液应在实验当天新鲜制备。

  1. 将管子放在磁性架上，等待浆料完全清除;使用移液器除去并丢弃上清液。加入50μL抗体缓冲液，并通过移液轻轻混合。
  2. 加入3μL抗GFP多克隆抗体（如果使用未经测试的抗体，则为0.5μg）。将管在4°C的螺母混合器上孵育2小时。
    注意:一些CUT&RUN方案报告通过在添加pAG-MNase之前添加二抗来提高产量14;然而，使用这个添加的步骤没有观察到显着的改进，因此，它不包括在该协议中。
  3. 在室温下以100× g 短暂离心管5秒，将管放在磁性架上，一旦浆料清除，使用移液管除去并丢弃上清液。当含有磁珠的管子仍在磁架上时，直接在磁珠上加入200μL冰冷的细胞透化缓冲液。使用移液器除去并丢弃上清液。重复两次，用冰冷的细胞渗透缓冲液洗涤。
  4. 向每个试管中加入50μL冰冷的细胞透化缓冲液，并通过移液轻轻混合。
    注意:此时通常聚集微球，但可以使用200μL移液器轻轻混合，从而轻松分散。

8. pAG-MNase与抗体的结合

  1. 向每个样品中加入2.5μLpAG-Mnase（20x储备液），并通过移液轻轻混合。将样品（以~45°角略微升高）置于4°C的螺母上。 打开螺母器并将样品孵育1小时。
  2. 在室温下以100× g 短暂离心带状管5秒，将管放在磁性架上，一旦浆料清除，使用移液器除去并丢弃上清液。
    注意:此步骤至关重要。在此步骤之后，残留在管帽或侧面的携带抗体将显着增加背景信号的量。
  3. 当含有磁珠的管子仍在磁架上时，加入200μL冰冷的细胞渗透缓冲液，使浆液清除，并使用移液管除去并丢弃上清液。重复此步骤，总共用细胞透化缓冲液洗涤两次。
  4. 向样品中加入100μL冰冷的细胞渗透缓冲液，并轻轻上下移液5次。

9. 靶向染色质消化和释放

  1. 将含有样品的试管在湿冰浴中孵育5分钟。使用多通道移液器向每个样品中加入3μL 100mM CaCl2 。轻轻上下移液5次，立即将试管放回湿冰浴中，孵育30分钟。
  2. 向每个样品中加入66μL停止缓冲液，并轻轻涡旋混合。将样品在37°C的干燥浴中孵育10分钟。
    注意:建议在停止缓冲液中每个样品中加入1.5 pg异源 大肠杆菌 刺入DNA。添加1.5 pg 的大肠杆菌 刺入DNA导致1，000-10，000次映射的刺入读取，用于1-1000万次映射实验读取14。刺入DNA用于校准测序深度，对于比较序列中的样品尤为重要。强烈建议添加尖峰型 大肠杆菌 ，但不是必需的。商业CUT&RUN试剂盒包括 大肠杆菌 刺入DNA，但它也可以单独购买。
  3. 将管放在磁性架上，并将160μL上清液转移到1.5mL微量离心管中。将80μL样品转移到新的2 mL微量离心管中，并在需要备用样品时储存在-20°C。使用80μL样品继续执行步骤10。

10. 收集的DNA样本的清理

注意:使用前在室温下孵育DNA纯化珠30分钟。在冰上预冷100%异丙醇。混合样品时，上下移液10次。

  1. 涡旋DNA纯化珠以匀浆悬浮液。向每个样品中加入50μL（〜0.6x样品体积）的重悬微球。移液器混合并将样品在室温下在nutator上孵育5分钟。
    注意:DNA纯化微球与所用样品的比例至关重要。相对于样品使用0.6倍体积的DNA纯化珠溶液，允许磁珠与受损细胞核释放的大DNA片段结合。CUT&RUN富集DNA片段比这些大DNA片段小得多，因此在此步骤中保留在上清液中。
  2. 将试管放在磁性架上，并将含有DNA的130μL上清液转移到0.2mL 8管条上。向样品中再加入30μLDNA纯化珠（总体积为160μL）。
  3. 加入170μL（约1x样品体积）冰冷的100%异丙醇，通过上下移液10次充分混合，并在冰上孵育10分钟。
    注意:至关重要的是，这一步使用100%冰冷的异丙醇，以便DNA纯化珠有效地捕获富含CUT&RUN的小片段。
  4. 将试管放在磁架上，一旦浆料清除，使用移液管小心地除去并丢弃上清液。
  5. 当试管在磁性架上时，向试管中加入200μL新鲜制备的室温80%乙醇，并在室温下孵育30秒。小心地除去并使用移液器丢弃上清液。重复此步骤，总共用80%乙醇洗涤两次。
  6. 以100× g快速旋转试管，将试管放回磁性架上，并在浆料清除后使用移液管除去任何残留的乙醇。将磁珠风干5分钟，同时管子保持在磁性架上，盖子打开。
    注意:干燥时间不要超过5分钟，因为这会显着降低最终DNA产量。
  7. 从磁性架上取出试管，并在pH 8下加入17μL0.1x Tris-EDTA（TE）从磁珠中洗脱DNA。充分混合并在室温下孵育试管5分钟。
  8. 将管子放在磁架上，直到浆料变清。一旦浆料清除，小心地将15μL上清液转移到无菌的0.2mL PCR管中。
  9. 按照制造商的协议使用荧光计测量收集的DNA的浓度。
    注意:通常，收集的DNA的浓度约为1ng / μL。有时，收集的DNA的浓度太低，无法使用荧光计进行量化。这不是实验失败的指标。继续进行文库制备，而不管收集的DNA的浓度如何。
  10. 继续执行步骤11或将样品储存在-20°C直至准备就绪。

11. 用于测序的文库制备

注:以下步骤使用市售的文库制备工具包。使用连接预混液执行步骤时，请尽量减少接触试管，并始终将其保持在冰上。

  1. 在pH 8下使用0.1x TE，将CUT&RUN DNA的总体积提高到50μL，每个样品制作3μL末端制备酶混合物和7μL末端制备反应缓冲液的主混合物。向CUT&RUN DNA中加入10μL预混液，并通过上下移液5次彻底混合。
  2. 以100×g的速度进行快速旋转，以收集管子侧面的所有液体。将管置于热循环器中，加热的盖子设置为≥75°C，并运行 表7中的循环条件。
    注意:根据从步骤10收集的起始输入DNA浓度，遵循 表8中所需的适配器稀释。
  3. 每个样品加入2.5μL适配器，并通过上下移液10次彻底混合。
    注意:在加入连接预混液之前，将适配器添加到样品中并彻底混合至关重要。
  4. 制作30μL连接预混液和1μL连接增强剂的预混液。向样品中加入31μL预混液。通过上下移液10次彻底混合。
  5. 在20°C下在加热的盖子下在热循环仪中孵育15分钟。
    注意:至关重要的是，样品必须保持在冰上，只有在热循环仪达到20°C后才能转移到热循环仪上。
  6. 在100×g下进行快速旋转以从管的侧面收集所有液体，加入3μL尿嘧啶切除酶，并将管在37°C的热循环器中孵育15分钟，加热的盖子设置为≥47°C。
    注意:这是一个安全的停止点;将样品储存在-20°C或直接继续至步骤11.7。如果继续直接步骤11.7，则在使用前在室温下孵育DNA纯化珠30分钟。
  7. 从步骤11.6向适配器连接反应中加入154.4μL（约1.6倍样品体积）DNA纯化珠。移液器混合并在室温下孵育样品5分钟。
  8. 将试管放在磁性架上，一旦浆料清除，使用移液器小心地除去并丢弃上清液。
  9. 向试管中加入200μL新鲜制备的室温80%乙醇，并在室温下孵育30秒。使用移液管小心地除去并丢弃上清液，并重复此步骤，总共用80%乙醇洗涤两次。
  10. 以100× g短暂旋转管子。将管子放回磁性架上，并使用移液器除去任何残留的乙醇。风干珠子5分钟，同时管子保持在打开盖子的磁性架上。
    注意:干燥时间不要超过5分钟，因为这会显着降低最终DNA产量。
  11. 从磁性架上取出试管，并在pH 8下加入17μL的0.1x TE，从磁珠中洗脱DNA。充分混合并在室温下孵育5分钟。
  12. 将管子放在磁架上，直到浆料变清。一旦浆料清除，小心地将15μL上清液转移到无菌的0.2mL PCR管中。
  13. 制作每个样品25μLDNA聚合酶预混液和5μL通用前向文库扩增引物（10μM）的预混液。
    注意:准备一个额外的预混液样品，以考虑移液损失。
  14. 将30μL预混液加入15μL适配器连接的DNA样品中。向每个样品中加入5μL反向唯一索引的文库扩增引物（10μM），使最终体积达到50μL，通过上下移液10次彻底混合。执行 表9中的PCR循环条件。
    注意:使用前在室温下孵育DNA纯化珠30分钟。
  15. 涡旋DNA纯化珠子重悬。向PCR扩增的DNA样品中加入35μL（约0.7倍样品体积）的重悬微球。在室温下将样品在螺母上混合并孵育5分钟。
  16. 将试管放在磁架上，一旦浆料清除，将含有DNA的上清液转移到新的0.2mL 8孔PCR试管中。
  17. 向样品中加入119μL（约1.4倍样品体积）的微球，并通过上下移液5次混合。将样品在室温下在nutator上孵育5分钟。
  18. 将试管放在磁性架上，一旦浆料清除，使用移液器小心地除去并丢弃上清液。
  19. 向试管中加入200μL新鲜制备的室温80%乙醇，并在室温下孵育30秒。小心地除去并使用移液器丢弃上清液;重复该步骤，总共用80%乙醇洗涤两次。
  20. 以100× g短暂旋转管子。将管子放回磁性架上，并使用移液器除去任何残留的乙醇。将磁珠风干5分钟，同时管子保持在磁性架上，盖子打开。
    注意:干燥时间不要超过5分钟，因为这会显着降低最终DNA产量。
  21. 从磁性架上取出试管，并在pH 8下加入14μL 0.1x TE，从磁珠中洗脱DNA。充分混合并在室温下孵育5分钟。
  22. 将管子放在磁架上，直到浆料变清。浆料清除后，小心地将13μL上清液转移到无菌的0.2mL PCR管中。
  23. 准备新鲜的1x三硼酸盐EDTA（TBE），并将预制的商用10%丙烯酰胺TBE凝胶插入装有1x TBE的凝胶电泳设备中。
  24. 在第一个孔中，加入2μL低范围DNA分子量标准品。将3μL6x上样染料与先前从步骤11.22收集的13μL样品混合。小心地向凝胶的每个孔中加入15μL。在70 V下运行凝胶90分钟。
    注意:建议在每个样品之间的凝胶中留一个空孔，因为这可以降低样品交叉污染的可能性。有经验的用户可能会发现使用所有孔，同时小心避免交叉污染，特别是在处理大量样品时。
  25. 从凝胶盒中取出凝胶铸件。按照制造商的说明打开凝胶铸件，轻轻地从凝胶铸件中取出凝胶，然后将其放入含有100 mL 1x TBE的凝胶保持托盘中。
    注意:确保轻轻地从凝胶铸件中取出凝胶，以避免撕裂凝胶，因为它又薄又脆。每当处理凝胶时，用1x TBE预湿手套和凝胶至关重要。凝胶保持托盘应略大于凝胶的大小（每侧约0.5"）。配有 96 孔 PCR 管存储盒的塑料盖是标准迷你凝胶尺寸的方便夹持托盘。
  26. 将10μL核酸凝胶染色剂加入托盘中并轻轻旋转。用铝箔盖住，避光，并在室温下静态孵育10分钟。
  27. 用100 mL去离子自来水冲洗凝胶两次。使用琥珀色滤光片盖在蓝光照明下对凝胶进行成像（图2）。
    注意:成功的文库显示涂片在 100 和 500 bp 之间。还将有一个突出的~125适配器二聚体带。适配器二聚体的存在并不表示库质量差。对于在低丰度TF上进行的CUT&RUN实验来说，这种适配二聚体的量是不可避免的，并且是用于制备这些库的输入材料量低的结果。不要使用紫外线，紫外线会损害DNA。
  28. 如图 2所示，对于每个文库，将凝胶切至略高于~125 bp突出适配器二聚体带（确保避免接触适配器二聚体带）且低于400 bp梯形标记。
    注:避免使用~125适配器二聚体带至关重要。即使是微量的适配器二聚体也会显著降低库的质量。
  29. 使用22 G针头刺穿0.65 mL管的底部，并将穿刺的管置于无菌的2 mL微量离心管内。将凝胶切片转移到2 mL微量离心管内的穿刺管中。
  30. 将含有0.65mL穿刺管的2mL微量离心管和样品在室温下以10，000× g 离心2分钟，以收集2 mL微量离心管内的凝胶浆液。
    注意:穿刺的管子现在应该是空的，可以丢弃。如果穿刺的管内仍有任何凝胶残留，则将穿刺的管放回2mL微量离心管内，并在室温下以10，000× g 再次离心2分钟。
  31. 向2 mL微量离心管内的凝胶浆料中，加入300μL冰冷凝胶洗脱缓冲液，并在室温下在nutator上混合至少3小时或过夜（12-16小时）。
  32. 将所有液体和凝胶浆液转移到0.22μm过滤柱中。在室温下以10，000× g 离心1分钟;收集的体积应为~300μL。
  33. 加入450μL（约1.5倍样品体积）DNA纯化珠，在室温下在螺母架上孵育5分钟，然后将样品放在磁架上直至浆料透明。
    注意:使用前在室温下孵育DNA纯化珠30分钟。
  34. 除去并丢弃500μL上清液，确保不破坏珠子。
  35. 从磁性架上取出样品，并通过上下移液5次混合磁珠。将200μL样品转移到新的PCR条管中。
  36. 将带状管放在磁性架上，一旦浆料清除，小心地除去并使用移液器丢弃上清液。
  37. 向试管中加入200μL新鲜制备的室温80%乙醇，并在室温下孵育30秒。小心地除去并使用移液器丢弃上清液;重复此步骤，总共用80%乙醇洗涤两次。
  38. 以100× g短暂旋转管子。将管子放回磁性架上，并使用移液器除去任何残留的乙醇。将磁珠风干长达5分钟，同时管子保持在磁性架上，盖子打开。
    注意:干燥时间不要超过5分钟，因为这会显着降低最终DNA产量。
  39. 从磁性架上取出试管，并在pH 8下加入17μL的0.1x TE，从磁珠中洗脱DNA。充分混合并在室温下孵育试管5分钟。
  40. 将管子放在磁架上，直到浆料变清。一旦浆料清除，小心地将15μL上清液转移到无菌的0.2mL PCR管中。
  41. 使用荧光计测量最终的文库数量;使用此最终文库进行测序。
    注意:使用测序平台，可以在单个泳道中池化和测序多达48个文库，该平台提供至少3亿个40 bp或更长的配对端读取。

12. CUT&RUN 序列分析

注意:本节介绍用于分析CUT&RUN序列数据的计算协议。该协议从设置计算虚拟环境开始，并引导用户在其本地计算机上执行命令。该协议适用于所有计算资源，例如本地计算机，虚拟云服务器和高性能计算集群。本文中提供的所有CUT&RUN数据都可以在NCBI GEO的加入号GSE193803下访问。

  1. 从 https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis 下载CUT&RUN分析的源代码。
    注意:该工作流程在 MacOS 或 Linux 操作系统系统上效果最佳。Windows 用户可以使用 GitBash 运行工作流（请参阅 材质表）。
    1. 通过单击绿色的代码按钮直接从GitHub页面下载 代码 | 下载压缩 选项。将文件夹解压缩到本地计算机上的相关位置。
  2. 安装 Conda 环境（请参阅 材料表）并且仅运行一次。
    注意:此工作流使用 Conda 命令行工具环境来安装所有必需的软件和工具。
  3. 安装 Conda（仅运行一次）后，使用以下命令提供 的补充文件 2 创建虚拟环境:
    conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
  4. 每次执行此工作流时，请使用以下命令激活虚拟环境:
    conda activate
  5. 将输入的原始FASTQ文件组织到一个文件夹中，理想情况下每个CUT&RUN实验一个文件夹。

13. 生成用于比对的基因组文件

  1. 生成基因组文件进行比对（每个基因组文件仅运行一次）。创建一个文件夹以保存所有 白色念珠菌 基因组文件，例如:
    mkdir ca_genome_files

14. 下载 白色念珠菌 基因组组装 21

  1. 使用wget或curl工具从念珠菌基因组数据库下载白色念珠菌基因组组装21（参见材料表）18。
    注意:这里使用 C. albicans 组装21将CUT&RUN结果与先前发布的ChIP芯片结果进行比较，这些结果与组装21一致。用户可以下载其他汇编版本并运行类似的命令，以生成相关的基因组文件以满足其比对需求。

15. 生成 Bowtie 2 索引数据库（数据库名称:ca21）

  1. 使用以下命令:
    领结2-构建 C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
    领结2-检查-s ca21

16. 运行 CUT&RUN 分析管道

  1. 阅读帮助部分以熟悉管道的参数。
    bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. 使用相关参数执行cut_n_run_pipeline.sh文件

  1. 执行脚本:
    bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
    注意:GitHub 页面 https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh 描述了代码第 19-36 行中带有详细说明的相关参数。

18. 组织输出文件

  1. 使用 BedTools 合并函数19 合并位于 /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 中的所有重复项中的显著峰值。
    cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sort -k1，1 -k2，2n |mergeBed -c 4，5，6，7，8，9 -o last，mean，first，mean，mean，mean > /path/to/merged_output.bed
    注:有关评估重复样品中重叠峰的更多信息和最佳实践，请参阅Landt等人.20和Boyd等人21。

19. 使用 BedTools 减法功能删除与列入黑名单的基因组区域的匹配项

  1. 使用以下命令: 减去 -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
    注意: 白色念珠菌 基因组中列入黑名单的区域在 补充文件 3 中以 .bed 文件的形式提供。该列表主要由高度重复的序列元素和区域组成，例如端粒重复序列和着丝粒，通常在 C. albicans CUT&RUN，ChIP-seq和ChIP-chip数据集中产生假阳性结果。因此，建议删除列入黑名单的区域。然而，对于某些蛋白质靶标，排除这些位点可能是不适当或不可取的。用户可以跳过此步骤以保留这些黑名单区域中包含的信号，或创建自己的黑名单区域。

20. 使用 UCSC bigWigMerge 函数合并复制中的 BigWig 文件22

  1. 使用以下方法: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
  2. 使用 UCSC bedGraphToBigWig 函数将 BedGraph 输出从 bigWigMerge 转换为 BigWig。
    bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

结果

这种强大的CUT&RUN方案经过调整和优化，用于研究 白色念珠菌 生物膜和浮游培养物中特定TF的全基因组定位（有关实验方法的概述，请参见 图2 ）。还包括一个全面的数据分析管道，以促进对生成的CUT&RUN测序数据的分析，并要求用户在编码或生物信息学方面具有最少的专业知识（有关分析管道的概述，请参见 图3 ）。与ChIP芯片和ChIP-seq方法相反?...

讨论

该协议为白色念珠 菌中调节性TF的全基因组定位提供了全面的实验和计算管道。它被设计为任何接受过标准微生物学和分子生物学培训的人都可以轻松访问。通过利用CUT&RUN测定的高动态范围和低样品输入要求，并包括对 白色念珠菌 生物膜和浮游培养物中TF-DNA结合相互作用的定位的优化，该协议为传统的ChIP-seq方法提供了一种强大且低成本的替代方案。与ChIP-seq相比，CUT&RUN的灵敏度?...

披露声明

Clarissa J. Nobile是BioSynesis， Inc.的联合创始人，该公司开发生物膜感染的诊断和治疗方法。

致谢

我们感谢Nobile和Hernday实验室的所有过去和现在的成员对手稿的反馈。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家普通医学科学研究所（NIGMS）奖项R35GM124594的支持，并由Kamangar家族以C.J.N.捐赠的椅子的形式提供支持。这项工作还得到了NIH国家过敏和传染病研究所（NIAID）的支持，奖项编号为R15AI137975，以A.D.H.C.L.E.得到了NIH国家牙科和颅面研究所（NIDCR）奖学金F31DE028488的支持。内容由作者自行负责，不代表资助者的观点。资助者在研究的设计中没有发挥作用;收集、分析或解释数据;在手稿的写作中;或在决定公布结果。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm filterMillipore SigmaSLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubesVWR490003-190
1 M CaCl2Fisher Scientific50-152-341
1 M PIPESFisher ScientificAAJ61224AK
12-well untreated cell culture platesCorning351143
2-mercaptoethanolSigma-Aldrich60-24-2
2% DigitoninFisher ScientificCHR103MI
50 mL conical tubesVWR89039-658
5x phusion HF bufferFisher ScientificF530SItem part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
AgarCriterionC5001
Agencourt AMPure XP magnetic beadsBeckman CoulterA63880
Agilent BioanalyzerAgilentG2939BAReferred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport ScientificVWR89133-910
Bacto peptoneBD Biosciences211677
Benchling primer design toolBenchlinghttps://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
BetaineFisher ScientificAAJ77507AB
Calcofluor white stainSigma-Aldrich18909-100ML-F
Candida Genome Databasehttp://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beadsPolysciences 86057-3
Conda softwarehttps://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl toolhttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kitEpicypher14-1048Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)New England BiolabsN0447S
Dextrose (D-glucose)Fisher ScientificD163
Difco D-mannitol BD Biosciences217020
Disposable cuvettesFisher Scientific14-955-127
Disposable transfer pipetsFisher Scientific13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)Fisher ScientificR0611
DreamTaq green DNA polymeraseFisher ScientificEP0713Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase bufferFisher ScientificEP0713Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNAEpicypher18-1401
ELMI Microplate incubatorELMITRMS-04Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction BufferItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proofVWR89125-170
FastDigest MssIFisher ScientificFD1344Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI BufferFisher ScientificFD1344Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400Fisher BioReagentsBP525-25
Fluorescence microscopeUser-dependent
Gel electrophoresis apparatusUser-dependent
GeneRuler low range DNA ladderFisher ScientificFERSM1192
GitBash workflowhttps://gitforwindows.org/
GitHub source codehttps://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5Boston BioProductsBBH-75-K
High-speed centrifugeUser-dependent
IsopropanolSigma-AldrichPX1830-4
Lens paperVWR52846-001
Ligation EnhancerItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrateMP Biomedicals215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibodyTakara632592User-dependent
MACS2https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubesEpicypher10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubesFisher ScientificMR02
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometerBioTekEPOCH2TCReferred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiViewhttp://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPSSigma-AldrichM3183
NaClVWR470302-522
NaOHFisher ScientificS318-500
NCBI GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kitNew England BiolabsE7645SReferred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for IlluminaItem part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)GoldbioN-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 wellFisher ScientificEC62755BOX
Nutating mixerVWR82007-202
Nutrient brothCriterionC6471
pADH110Addgene90982Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119Addgene90985Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137Addgene90986Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139Addgene90987Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140Addgene90988Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNaseEpicypher15-1016 or 15-111650 rxn or 250 rxn
pCE1Addgene174434Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lidFisher ScientificFB0875712
Phusion high fidelity DNA polymeraseFisher ScientificF530SReferred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350VWR10791-816
Potassium phosphate monobasicFisher ScientificP285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kitInvitrogenQ33230
Qubit fluorometerLife TechnologiesQ33216Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibodyEpicypher13-0042
RNase ASigma-Aldrich10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tabletsSigma-Aldrich5056489001
RPMI-1640Sigma-AldrichR6504
Shaking incubatorEppendorfM12820004User-dependent
SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
Spin-X centrifuge tube filtersFisher Scientific07-200-385
Sterile inoculating loopsVWR30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stainFisher ScientificS11494
SYTO 13 nucleic acid stainFisher ScientificS7575Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
ThermocyclerUser-dependent
ThermoMixer CEppendorf5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethaneSigma-Aldrich252859-100G
Ultra II Ligation Master MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master MixItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solutionInvitrogen15632011
USER EnzymeItem part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixerVWR10153-834
wget toolhttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Yeast extractCriterionC7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)Fisher ScientificNC0439194

参考文献

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