Profilage à l’échelle du génome des interactions de liaison facteur de transcription-ADN chez Candida albicans: une méthode CUT&RUN complète et un flux de travail d’analyse des données

Résumé

Ce protocole décrit une méthode expérimentale et un flux de travail d’analyse des données pour le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de nucléase (CUT&RUN) dans l’agent pathogène fongique humain Candida albicans.

Résumé

Les facteurs de transcription régulateurs contrôlent de nombreux processus biologiques importants, y compris la différenciation cellulaire, les réponses aux perturbations et aux stress environnementaux et les interactions hôte-pathogène. Déterminer la liaison à l’échelle du génome des facteurs de transcription régulateurs à l’ADN est essentiel pour comprendre la fonction des facteurs de transcription dans ces processus biologiques souvent complexes. Le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de la nucléase (CUT&RUN) est une méthode moderne de cartographie à l’échelle du génome des interactions in vivo de liaison protéine-ADN qui constitue une alternative attrayante à la méthode traditionnelle et largement utilisée d’immunoprécipitation de la chromatine suivie du séquençage (ChIP-seq). CUT&RUN se prête à une configuration expérimentale à haut débit et a une plage dynamique nettement plus élevée avec des coûts de séquençage par échantillon inférieurs à ceux de ChIP-seq. Ici, un protocole CUT&RUN complet et un flux de travail d’analyse de données d’accompagnement adapté à l’analyse à l’échelle du génome des interactions de liaison facteur de transcription-ADN chez l’agent pathogène fongique humain Candida albicans sont décrits . Ce protocole détaillé comprend toutes les procédures expérimentales nécessaires, du marquage épitope des gènes codant pour le facteur de transcription à la préparation de la bibliothèque pour le séquençage; en outre, il comprend un flux de travail de calcul personnalisé pour l’analyse des données CUT&RUN.

Introduction

Candida albicans est un agent pathogène fongique humain polymorphe cliniquement pertinent qui existe dans une variété de modes de croissance différents, tels que le mode de croissance planctonique (flottant librement) et sous forme de communautés de cellules étroitement adhérentes protégées par une matrice extracellulaire, connue sous le nom de mode de croissance du biofilm ^1,2,3. Semblable à d’autres processus développementaux et cellulaires, le développement du biofilm est un trait de virulence important de C. albicans qui est connu pour être contrôlé au niveau transcriptionnel par des facteurs de transcription régulateurs (TF) qui se lient à l’ADN d’une manière spécifique à la séquence⁴. Récemment, les régulateurs de chromatine et les modificateurs d’histones sont également apparus comme des régulateurs importants de la formation de biofilm⁵ de C. albicans et de la morphogenèse⁶ en médiant l’accessibilité de l’ADN. Pour comprendre la biologie complexe de cet important agent pathogène fongique, des méthodes efficaces pour déterminer la localisation à l’échelle du génome de TF spécifiques au cours de processus développementaux et cellulaires distincts sont précieuses.

L’immunoprécipitation de la chromatine suivie d’un séquençage (ChIP-seq) est une méthode largement utilisée pour étudier les interactions protéine-ADN chez C. albicans ^5,6 et a largement remplacé l’immunoprécipitation plus classique de la chromatine suivie de la méthode du microréseau (puce ChIP)⁹. Cependant, les méthodes ChIP-seq et ChIP-chip nécessitent un grand nombre de cellules d’entrée¹⁰, ce qui peut être un facteur de complication lors de l’étude des TF dans le contexte d’échantillons et de modes de croissance spécifiques, tels que des biofilms prélevés sur des patients ou des modèles animaux d’infection. En outre, le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) produit souvent une quantité importante de signal de fond dans tout le génome, nécessitant un niveau élevé d’enrichissement pour que la cible d’intérêt sépare suffisamment le signal du bruit. Bien que le test de la puce ChIP soit largement obsolète aujourd’hui, les profondeurs de séquençage nécessaires pour ChIP-seq rendent ce test prohibitif pour de nombreux chercheurs, en particulier ceux qui étudient plusieurs TF et / ou protéines associées à la chromatine.

Le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de nucléases (CUT&RUN) est une alternative attrayante au ChIP-seq. Il a été développé par le laboratoire Henikoff en 2017 pour contourner les limites du clivage endogène ChIP-seq et chromatine suivi du séquençage ChEC-seq^11,12, une autre méthode permettant ^{d’identifier} les interactions protéine-ADN à l’échelle du génome, tout en fournissant une cartographie à haute résolution et à l’échelle du génome des TF et des protéines associées à la chromatine¹³ . CUT&RUN s’appuie sur la digestion ciblée de la chromatine dans les noyaux perméabilisés à l’aide de nucléases micrococciques attachées, suivie du séquençage des fragments d’ADN digérés ^9,10. Comme les fragments d’ADN sont spécifiquement générés aux loci qui sont liés par une protéine d’intérêt, plutôt que d’être générés dans tout le génome par fragmentation aléatoire comme dans les tests ChIP, l’approche CUT&RUN entraîne une réduction considérable des signaux de fond et, par conséquent, nécessite 1/10^ème de la profondeur de séquençage par rapport à ChIP-seq^{11,13, 14}. Ces améliorations conduisent finalement à des réductions significatives des coûts de séquençage et à des réductions du nombre total de cellules d’entrée nécessaires comme matériau de départ pour chaque échantillon.

Ici, un protocole CUT&RUN robuste est décrit qui a été adapté et optimisé pour déterminer la localisation à l’échelle du génome des TF dans les cellules de C. albicans isolées à partir de biofilms et de cultures planctoniques. Un pipeline d’analyse de données approfondi est également présenté, ce qui permet le traitement et l’analyse des données de séquence résultantes et nécessite que les utilisateurs aient une expertise minimale en codage ou en bioinformatique. En bref, ce protocole décrit le marquage épitope des gènes codant pour TF, la récolte de biofilms et de cellules planctoniques, l’isolement de noyaux perméabilisés intacts, l’incubation avec des anticorps primaires contre la protéine spécifique ou la protéine marquée par épitope d’intérêt, l’attache des protéines de fusion chimériques A/G-micrococciques (pAG-MNase) aux anticorps primaires, la récupération de l’ADN génomique après la digestion de la chromatine et la préparation de bibliothèques d’ADN génomique pour le séquençage.

Le protocole expérimental CUT&RUN est suivi d’un pipeline d’analyse de données spécialement conçu, qui prend des lectures de séquençage de l’ADN brut au format FASTQ et met en œuvre toutes les étapes de traitement requises pour fournir une liste complète des loci significativement enrichis liés par le TF d’intérêt (ciblé par l’anticorps primaire). Notez que plusieurs étapes du protocole de préparation de bibliothèque décrit ont été spécifiquement adaptées et optimisées pour l’analyse CUT&RUN des TF (par opposition aux nucléosomes). Bien que les données présentées dans ce manuscrit aient été générées à l’aide d’adaptations spécifiques à TF d’un kit CUT&RUN commercial, ces protocoles ont également été validés à l’aide de composants provenant de sources individuelles (c.-à-d. l’enzyme pAG-MNase et les billes de purification magnétique de l’ADN) et de tampons préparés en interne, ce qui peut réduire considérablement les coûts expérimentaux. Les protocoles expérimentaux et d’analyse de données complets sont décrits en détail ci-dessous dans un format étape par étape. Tous les réactifs et l’équipement essentiel, ainsi que les recettes de tampons et de supports, sont énumérés dans le tableau des matériaux et le dossier supplémentaire 1, respectivement.

Protocole

1. Marquage épitopique des souches de C. albicans

1. Téléchargez le gène d’intérêt, ainsi que ses séquences d’accompagnement de 1 kb en amont et en aval, de la base de données du génome de Candida à l’outil de conception de l’amorce (voir le tableau des matériaux). Concevez un ARN guide (ARNg) en mettant en évidence 50 pb en amont et en aval du codon d’arrêt, puis cliquez sur l’outil de sélection de l’ARNg à droite. Sélectionnez Guides de conception et d’analyse. Utilisez le génome Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploïde)) et un motif adjacent (PAM) protospacer NGG (SpCas9, 3' side) pour les paramètres de guidage, puis cliquez sur Terminer. La figure 1 décrit le flux de travail pour le marquage épitopique d’un gène d’intérêt de C. albicans avec une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP).
   1. Sur la page suivante, confirmez la région cible pour la conception de l’ARNg et appuyez sur le bouton vert. Triez les ARNg en fonction du score sur la cible.
      REMARQUE: L’outil de conception d’amorce calcule les scores sur cible et hors cible pour quantifier la spécificité des ARNg. Un guide idéal a un score sur cible de >60, un score hors cible d’environ 33 et chevauche le codon d’arrêt. Cela permet une spécificité élevée de l’ARNg tout en ablant le ciblage de l’ARNg après l’intégration de la GFP. Un ARNg avec un score hors cible d’environ 50 indique une variation allélique; ainsi, un seul allèle sera reconnu par l’ARNg.
   2. Ajouter les séquences (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') et (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') aux extrémités 5' et 3', respectivement, de la séquence cible d’ARNg de 20 pb, créant ainsi un amorce/oligonucléotide de 60 pb. Vous pouvez également copier la séquence de 20 pb dans le calculateur d’ARNg fourni par Nguyen et ^al.15. Commandez l’oligonucléotide d’ARNg personnalisé de 60 pb.
   3. Amplifier le « fragment A universel » avec 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGCGTTTAAACCGCC-3') et 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') et le « fragment B unique » avec l’oligonucléotide d’ARNg personnalisé de 60 bp (100 mM) de l’étape 1.1.2. et 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3') en utilisant pADH110 (ID de référentiel de plasmides # 90982) et pADH139 (ID de référentiel de plasmides # 90987), respectivement, comme modèle d’ADN. Utilisez les conditions de réaction et de cycle de la PCR fournies dans le tableau 1.
      REMARQUE: pADH139 est spécifique aux souches qui portent le marqueur hétérologue Candida maltosa LEU2 . Si vous utilisez une souche avec une seule copie du gène C. albicans LEU2 , remplacez pADH119 (ID de dépôt de plasmides # 90985) par pADH139.
   4. Confirmez l’amplification réussie en vérifiant 5 μL de la PCR sur un gel d’agarose à 1%. Recherchez ~1 kb A et B fragment amplicons.
   5. Mélanger 1 μL chacun des fragments A et B et les assembler en utilisant les conditions de réaction et de cycle pcriennes fournies dans le tableau 2 pour créer un fragment C pleine longueur.
   6. Ajouter 0,5 μL de 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') et 0,5 μL de 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') à chaque réaction de PCR, bien mélanger par pipetage et compléter les conditions de cycle énumérées dans le tableau 3.
      REMARQUE: Si vous utilisez pADH119 à la place de pADH139, remplacez AHO1238 (5'-TGTATTTTGTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') par AHO1453.
   7. Confirmez la bonne couture et l’amplification du fragment C en vérifiant 5 μL de la PCR sur un gel d’agarose à 1%. Recherchez un amplicon ~ 2 kb. Conservez le fragment C à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
      REMARQUE: Si l’assemblage et l’amplification entraînent plusieurs bandes non spécifiques ou des taches, effectuez un nettoyage PAR PCR des fragments A et B et répétez à partir de l’étape 1.1.5.
2. Ajoutez l’ensemble de l’eGFP monomère optimisé pour CTG avec la séquence de liaison (RIPLING)¹⁶ (pCE1, plasmid repository ID# 174434) immédiatement en amont du codon stop du gène d’intérêt à l’aide de l’outil de conception d’amorce, créant ainsi une fusion translationnelle C-terminale. Utilisez cette construction pour concevoir des oligonucléotides pour amplifier l’ADN du donneur (ADNd) à partir de pCE1.
   1. Concevoir un oligonucléotide avancé avec une homologie de 18-22 bp à la séquence de liaison et une homologie >50 bp à l’extrémité 3' du cadre de lecture ouvert (ORF).
      REMARQUE: L’homologie 18-22 bp crée une température de recuit pour l’amplification entre 55 ° C et 58 ° C. Si l’oligonucléotide sur toute la longueur forme des dimères d’amorce, ajuster l’homologie à la séquence de liaison/GFP ou au génome en conséquence.
   2. Créer un oligonucléotide inverse avec une homologie de 18-22 bp à l’extrémité 3' de la GFP et une homologie >50 bp à la séquence non codante en aval de l’ORF à marquer.
   3. Ordonner ces oligonucléotides et amplifier l’ADNd à l’aide des conditions de cycle PCR d’atterrissage fournies dans le tableau 4.
3. Concevoir deux ensembles d’oligonucléotides de PCR de colonie (cPCR) pour confirmer l’intégration de la GFP en l’amplifiant sur les sites d’intégration de flanquement. Tout d’abord, sélectionnez l’oligonucléotide d’ADNd avant à l’aide de l’outil de conception d’amorce et cliquez sur le bouton Amorce à droite.
   1. Cliquez sur Créer des | d’amorces | de l’Assistant Tm Param et confirmer que l’algorithme est réglé sur SantaLucia 1998. Cliquez sur Utiliser la sélection pour saisir les coordonnées de l’oligonucléotide avant conçu dans la section 1.2.1 comme séquence cible.
   2. Réglez la température optimale de l’apprêt à 55 °C et la taille maximale de l’amplicon à 900 bp, puis cliquez sur le bouton Générer des amorces en haut à droite.
   3. Sélectionnez la paire d’oligonucléotides avec le score de pénalité le plus bas et confirmez que les amorces s’amplifient sur le site d’intégration 5'. Assurez-vous que l’amorce cPCR avant se trouve en amont de la séquence d’amorce d’ADN avant et que l’amorce cPCR inverse se trouve entièrement dans la balise eGFP ou la séquence de liaison.
   4. Répétez les étapes 1.3 à 1.3.3. avec l’oligonucléotide d’ADNd inversé pour créer le deuxième ensemble d’oligonucléotides cPCR qui s’amplifient sur le site d’intégration 3'. Assurez-vous que l’amorce cPCR directe se trouve entièrement dans la balise eGFP ou la séquence de liaison et l’amorce cPCR inverse en aval de la séquence d’amorce d’ADN d’ADN inverse.
   5. Commandez ces oligonucléotides.
4. Digérer 2 500 ng de pADH140, qui contient Du Cas9 (plasmide repository ID# 90988), avec une enzyme de restriction pour chaque gène à marquer GFP. Régler le volume total de chaque digestion à 15 μL; ajuster le volume d’eau en conséquence en fonction de la concentration en plasmide pADH140. Utilisez les conditions de digestion spécifiées dans le tableau 5. Conserver le plasmide digéré à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
   REMARQUE: Si vous transformez une souche avec une seule copie du gène C. albicans LEU2 , au lieu du marqueur hétérologue C. maltosa LEU2 , remplacez pADH137 (plasmidique ID# 90986) par pADH140.
5. Dénaturer 12 μL d’ADN de sperme de saumon de 10 mg/mL pour chaque gène qui sera marqué GFP à 99 °C pendant 10 min et refroidir rapidement à ≤4 °C. Conserver à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
6. Strier une souche sensible à la nourséothricine hémizygote LEU2 sur des plaques de levure peptone dextrose (YPD) et incuber à 30 °C pendant deux jours.
7. Sélectionnez une seule colonie et transférez-la à 4 mL de YPD liquide. Incuber pendant 12-16 h à 30 °C en agitant à 250 tr/min.
8. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) de la culture de nuit (12-16 h) dans un spectrophotomètre à l’aide d’une cuvette jetable (1 mL, 1 cm de longueur de trajet).
9. Diluer la culture pendant la nuit dans une fiole d’Erlenmeyer à un OD₆₀₀ de 0,1 dans YPD. Tenez compte de 5 mL par réaction et incluez 5 mL supplémentaires pour vérifier l’OD₆₀₀ plus tard.
   REMARQUE: Le volume de la culture dépend du nombre de réactions de transformation.
10. Incuber la culture diluée pendant la nuit dans un incubateur à agitation à 30 °C avec agitation à 250 tr/min jusqu’à ce qu’elle atteigne une DO₆₀₀ de 0,5-0,8.
11. Centrifuger à 4 000 × g à température ambiante pendant 5 min; retirer et jeter le surnageant.
12. Remettre en suspension la pastille de la cellule dans 1 mL d’eau stérile par mélange doux de pipette avec des embouts de filtre et transférer dans un tube de microfuge stérile de 1,5 mL.
13. Abreuver les cellules par centrifugation à 4 000 × g à température ambiante pendant 1 min; retirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension dans 1 mL d’eau stérile et répéter pour un total de deux lavages.
14. Remettre en suspension la pastille à 1/100e du volume utilisé à l’étape 1.10. Par exemple, si 15 mL ont été utilisés, remettre le granulé en suspension dans 150 μL d’eau stérile.
15. Dans un tube séparé pour chaque réaction de transformation, mélanger 50 μL de fragment de C, 50 μL d’ADNd, 2 500 ng de pADH140 digéré par enzyme de restriction et 10 μL d’ADN de spermatozoïde de saumon dénaturé.
16. Ajouter 50 μL de la boue cellulaire de l’étape 1.14 et mélanger par pipetage.
17. Faire un stock du mélange de plaques (fichier supplémentaire 1) pour n + 1 transformations.
18. Ajouter 1 mL du mélange de plaque au mélange cellule/ADN et mélanger en inversant 5 fois.
    REMARQUE: Tapotez le fond des tubes tout en inversant pour déloger tout liquide restant.
19. Placer le mélange dans un incubateur à 30 °C pendant la nuit (12-16 h) sans agitation.
20. Choc thermique des cellules pendant 15 min à 44 °C au bain-marie.
21. Centrifuger les tubes de microfuge de 1,5 mL à 5 000 × g à température ambiante pendant 2 min.
22. Retirez le mélange PLATE par aspiration sous vide à l’aide d’embouts de pipette stériles, en prenant soin d’éviter de perturber la pastille de cellule.
23. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de YPD, la pastille par centrifugation à 4 000 × g à température ambiante pendant 1 min, puis retirer et jeter le surnageant. Répéter pour un deuxième lavage, remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de YPD et transférer la suspension dans un tube de culture jetable à fond rond de 10 mL contenant 1 mL supplémentaire de YPD (volume final de 2 mL). Récupérer les cellules à 30 °C en agitant à 250 tr/min pendant 5 h.
24. Centrifuger les tubes à 4 000 × g à température ambiante pendant 5 min; retirer et jeter le surnageant.
25. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL d’eau stérile et la plaque sur YPD complétée par 200 μg/mL de nourséothricine (NAT200). Incuber à 30 °C pendant 2-3 jours.
26. Aliquote 100 μL de 20 mM de NaOH dans les puits d’une plaque de PCR de 96 puits, chaque puits correspondant à une colonie individuelle qui a grandi sur les plaques NAT200. À l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de pipette, choisissez des colonies transformées individuelles, fixez-les sur une nouvelle plaque NAT200 et faites tourbillonner les cellules restantes dans un puits avec 20 mM de NaOH. Répétez l’opération pour les colonies restantes afin de créer le lysat cellulaire utilisé comme modèle d’ADN pour la réaction cPCR.
27. Sceller la plaque PCR et incuber pendant 10 min à 99 °C dans un thermocycleur avec couvercle chauffé.
28. Mettre en place deux réactions de PCR avec les oligonucléotides conçus aux étapes 1.3-1.3.5. Augmentez le nombre de réactions au besoin. Effectuer la réaction pcr avec le lysat cellulaire préparé à l’étape 1.26 en suivant les conditions de cycle et les mélanges réactionnels PCR du tableau 6. Exécuter 10-20 μL de chaque puits sur un gel d’agarose à 1%. Recherchez des colonies avec amplification des deux ensembles d’amorces cPCR indiquant un ADN GFP correctement incorporé.
29. Colonies de restreak qui ont incorporé la GFP sur des milieux synthétiques complets (SC) dépourvus de leucine. Incuber dans un incubateur à 30 °C pendant 2-3 jours. Choisissez des colonies individuelles et fixez-les sur des plaques de YPD et de YPD complétées par des plaques de nourséothricine (NAT400) de 400 μg/mL. Identifiez les colonies qui ne se développent pas sur les plaques NAT400 après 24 h comme celles qui ont réussi à perdre les composants CRISPR.
30. Vérifiez que la balise GFP est conservée en répétant les étapes 1.25 à 1.28 à l’aide de cellules de la plaque de patch YPD. Si les bandes correctes sont présentes, inoculez dans 4 mL de YPD et grandissez pendant la nuit (12-16 h), comme décrit à l’étape 1.7.
31. Mélanger la culture de nuit de la nouvelle souche marquée GFP avec du glycérol à 50% stérilisé par filtre dans un rapport de 1: 1 dans un cryotube stérile. Conserver à -80 °C et reposer sur des plaques YPD au besoin.
    REMARQUE: Il est recommandé de valider les souches marquées GFP en confirmant la localisation nucléaire de la TF marquée par microscopie fluorescente et en confirmant un phénotype de type sauvage dans un test phénotypique approprié.

2. Préparation d’échantillons de cultures de biofilm

1. Strier C. albicans souche(s) marquée(s) GFP sur des plaques de gélose YPD et incuber à 30 °C pendant 2-3 jours. À l’aide d’une seule colonie isolée de la plaque de gélose, inoculer dans 4 mL de milieu liquide YPD. Incuber à 30 °C en agitant toute la nuit (12-16 h). Déterminez le DO₆₀₀ de la ou des cultures de nuit.
   REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser trois répliques biologiques par échantillon pour les expériences CUT&RUN.
2. Inoculer une plaque de culture cellulaire stérile non traitée à 12 puits avec la culture de nuit à un OD₆₀₀ final de 0,5 (équivalent à 2 × 10⁷ cellules / mL) dans le Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 milieu à un volume final de 2 mL. Incuber pendant 90 min à 37 °C dans un incubateur à microplaques en agitant à 250 tr/min.
   REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser une plaque de culture cellulaire de 12 puits par souche avec un puits non ininoculé comme témoin de contamination en milieu seul. Ce protocole a été appliqué avec succès en utilisant aussi peu que 1/10^ème d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits (ou aussi peu que 5 millions de cellules). L’utilisation d’un plus grand nombre de cellules augmente les rendements totaux en ADN, ce qui se traduit généralement par des bibliothèques de séquençage de haute qualité.
3. Retirez les cellules non adhérentes par aspiration à l’aide d’embouts de pipette stériles fixés via un tube en plastique flexible à un appareil de piège à vide. Lavez les cellules adhérentes une fois avec 2 mL de solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 2 mL de fluide RPMI-1640 frais aux puits et incuber pendant 24 h à 37 °C en agitant à 250 tr/min.
   REMARQUE : Changez les embouts de pipette entre les puits de différentes souches et/ou conditions. Ne grattez pas le fond du puits avec la pointe pendant l’aspiration.
4. À la fin de l’incubation de 24 heures, recueillir et regrouper le liquide et le biofilm de chacun des 11 puits inoculés dans un seul tube conique stérile de 50 mL. Répétez l’opération si nécessaire avec des pools indépendants si vous traitez simultanément plus d’une souche ou condition de croissance.
   REMARQUE: Grattez les fonds et les bords de chaque puits avec une pointe de filtre à pipette pour déloger les cellules qui restent collées à la surface. Utilisez la pipette pour homogénéiser les biofilms.
5. Échantillons de granulés par centrifugation à 4 000 × g à température ambiante pendant 5 min. Décantez autant que possible le surnageant, en prenant soin de minimiser la perturbation de la pastille. Congeler la pastille dans de l’azote liquide et la conserver à -80 °C immédiatement après la collecte ou passer directement à l’étape 4 (isolement des noyaux).

3. Préparation d’échantillons de cultures planctoniques

1. Strier C. albicans souche(s) marquée(s) GFP sur des plaques de gélose YPD et incuber à 30 °C pendant 2-3 jours. À l’aide d’une seule colonie isolée de la plaque de gélose, inoculer dans 4 mL de milieu liquide YPD. Incuber à 30 °C en agitant toute la nuit (12-16 h). Déterminez le DO₆₀₀ de la ou des cultures de nuit.
2. Diluer à nouveau les cultures pendant la nuit à_{OD 600} de 0,1 dans 50 mL de milieu liquide RPMI-1640 et incuber à 30 °C en agitant à 225 tr/min pendant 2-5 h jusqu’à ce que la DO₆₀₀ soit comprise entre 0,5 et 0,8.
   REMARQUE: Les cellules doivent subir au moins deux doublages avant d’être récoltées. Les conditions utilisées pour les cultures planctoniques peuvent être ajustées au besoin.
3. Granulés les échantillons par centrifugation à 4 000 × g à température ambiante pendant 5 min. Décantez autant que possible le surnageant, en prenant soin de minimiser la perturbation de la pastille. Congeler la pastille dans de l’azote liquide et la conserver à -80 °C immédiatement après la collecte ou passer directement à l’étape 4 (isolement des noyaux).

4. Isolement des noyaux

REMARQUE : Le jour de l’expérience, préparer un tampon Ficoll frais, ajouter du 2-mercaptoéthanol et un inhibiteur de protéase à la ou aux aliquotes du tampon de remise en suspension et ajouter un inhibiteur de protéase à la ou aux aliquotes du tampon SPC (voir le dossier supplémentaire 1). Pour remettre en suspension les granulés, pipettez doucement à l’aide d’embouts de pipette de 200 μL ou de 1 mL pour éviter d’endommager les cellules ou les noyaux. Avant de commencer l’isolement des noyaux, allumez le bloc thermique pour le préchauffer à 30 °C. Tous les embouts et tubes de pipette pour le reste de ce protocole doivent être certifiés sans ADN/ARN et sans DNase/RNase, et l’utilisation d’embouts filtrants est recommandée pour toutes les étapes de pipetage ultérieures.

1. Remettre en suspension la ou les pastilles dans 1 mL de tampon de remise en suspension à température ambiante et transférer dans un tube de microfuge stérile de 1,5 mL. Granulés à 2 000 × g à température ambiante pendant 2 min dans une centrifugeuse de table et retirer le surnageant.
   REMARQUE: Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL ou 1 mL, en prenant soin de minimiser les perturbations des granulés.
2. Remettre en suspension la ou les pastilles dans 200 μL de tampon de remise en suspension à température ambiante. À partir de la pastille remise en suspension, transférer une aliquote de 5 μL dans un nouveau tube PCR et la stocker à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
   REMARQUE: Cette aliquote sera utilisée comme contrôle lors d’une étape ultérieure de contrôle de la qualité pour évaluer la qualité des noyaux isolés.
3. Granulés à 2 000 × g pendant 2 min et retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez l’étape de lavage deux fois en utilisant 200 μL de tampon de remise en suspension.
4. Centrifuger à 2 000 × g à température ambiante pendant 2 min et retirer le surnageant. Ajouter 300 μL de tampon de remise en suspension et 10 μL de solution de lyticase (50 mg/mL, voir le tableau des matériaux). Incuber pendant 30 min à 30 °C dans un bloc chauffant.
   REMARQUE: Alternativement, un bain-marie chauffé à 30 ° C peut également être utilisé à la place d’un bloc chauffant. Les conditions de sphéroplasting utilisées ici ont été optimisées pour être efficaces à la fois pour les cellules de levure et d’hyphale de C. albicans. Il est recommandé d’optimiser les conditions de sphéroplastie lors de l’application de ce protocole aux cellules de C. albicans présentant des mutations ayant un impact sur l’intégrité de la paroi cellulaire ou d’autres morphologies cellulaires. Au cours de cette étape d’incubation de 30 minutes, l’utilisateur a la possibilité de compléter l’étape 5 (Activation de concanavaline A Bead) à l’avance pour gagner du temps.
   1. ÉTAPE CRITIQUE: Après l’étape d’incubation de 30 minutes, transférer une aliquote de 5 μL dans un nouveau tube PCR. Aux 5 μL de noyaux isolés et à l’aliquote de 5 μL de cellules intactes stockées à 4 °C à partir de l’étape 4.2, ajouter 1 μL de blanc calcofluor (un colorant fluorescent de la paroi cellulaire) et 1 μL de SYTO 13 (une coloration d’acide nucléique). Incuber à 30 °C dans l’obscurité pendant 30 min.
   2. Inspectez visuellement l’intégrité et la pureté des noyaux isolés à l’aide d’un microscope à fluorescence. Recherchez des noyaux isolés qui présentent des noyaux intacts colorés bien en évidence (à l’aide d’un filtre d’excitation de 488 à 509 nm) et assurez-vous qu’il n’y a pas de coloration de la paroi cellulaire par le colorant blanc calcofluor (à l’aide d’un filtre d’excitation de 390 à 420 nm). Dans les cellules témoins intactes, recherchez une coloration proéminente de la paroi cellulaire par le colorant blanc calcofluor (à l’aide d’un filtre d’excitation de 390 à 420 nm) et des noyaux intacts colorés (à l’aide d’un filtre d’excitation de 488 à 509 nm).
5. Centrifuger à 2 000 × g à 4 °C pendant 5 min et retirer le surnageant. Remettre en suspension la pastille dans 500 μL de tampon de remise en suspension glacé à l’aide d’embouts filtrants de 1 mL en pipetant doucement de haut en bas 5 fois. Centrifuger à 2 000 × g à 4 °C pendant 5 min et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL. Remettez en suspension le granulé avec 1 mL de tampon Ficoll glacé fraîchement préparé.
   REMARQUE: Conservez les échantillons et les tampons sur la glace à partir de ce moment.
6. Centrifuger les échantillons à 5 000 × g à 4 °C pendant 10 min et retirer le surnageant. Remettre en suspension la pastille dans 500 μL de tampon SPC glacé.
   REMARQUE: À partir de ce moment, manipulez les noyaux extrêmement doucement pour éviter de les endommager.
7. Centrifuger les échantillons à 5 000 × g à 4 °C pendant 10 min et prélever autant de surnageant que possible sans perturber la pastille. Placez les tubes contenant les noyaux granulés sur de la glace et passez à l’étape 5. Si l’étape 5 a déjà été complétée à l’avance à l’étape 4.4, passez à l’étape 6 ou congelez les granulés dans de l’azote liquide et stockez-les à -80 °C immédiatement après la collecte.

5. Activation de la perle Concanavalin A

REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique. À partir de ce moment, les utilisateurs ont la possibilité de poursuivre le protocole à l’aide d’un kit CUT&RUN disponible dans le commerce ou de s’approvisionner individuellement en composants clés et de préparer des tampons en interne. Si vous utilisez le kit commercial, tous les tampons et réactifs utilisés ci-dessous sont inclus dans le kit, sauf indication contraire. Les numéros de catalogue individuels pour l’approvisionnement indépendant en réactifs sont également fournis dans la table des matériaux. Refroidir tous les tampons sur la glace avant utilisation. Une fois l’étape 5 terminée, il est recommandé de passer immédiatement à l’étape 6. Évitez le gel-décongélation multiple des noyaux isolés, car il est connu pour augmenter les dommages à l’ADN et pourrait entraîner des résultats de mauvaise qualité.

1. Remettez doucement en suspension les billes de concanvaline A (ConA) à l’aide d’une pipette. Transférer 22 μL de suspension de billes de ConA par échantillon à traiter dans un seul tube de microfuge de 1,5 mL. Placez le tube sur une grille magnétique jusqu’à ce que la boue de perles soit claire; retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE: Lors de l’exécution de CUT&RUN pour un total de 10 échantillons, par exemple, transférez 220 μL de la suspension de billes ConA dans un tube de microfuge de 1,5 mL.
2. Retirez le tube contenant les billes ConA de la grille magnétique et ajoutez immédiatement 200 μL de tampon d’activation des billes glacées et mélangez doucement à l’aide d’une pipette. Placez le tube sur le support magnétique jusqu’à ce que la boue de perle soit claire; retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez cette étape pour un total de deux lavages.
3. Remettre en suspension les billes dans 22 μL de tampon d’activation des billes glacées par échantillon de noyaux à traiter. Gardez les perles sur la glace jusqu’à ce que nécessaire.
   REMARQUE: Le débit des étapes suivantes dépend du nombre et de la capacité des racks à tubes magnétiques disponibles. Le traitement de 32 échantillons dans deux racks de tubes de 16 puits est un nombre gérable pour la plupart des utilisateurs de ce protocole. Cependant, un débit plus élevé est possible pour les utilisateurs plus expérimentés, ou si des systèmes robotiques de manipulation de liquides sont disponibles.

6. Liaison des noyaux aux billes activées

REMARQUE: Refroidir tous les tampons sur la glace avant utilisation. Tous les tampons complétés par des inhibiteurs de la protéase doivent être préparés frais le jour de l’expérience. Il est recommandé d’utiliser des tubes à bande de 0,2 mL dans les étapes suivantes.

1. Remettre en suspension les noyaux granulés de l’étape 4 dans 100 μL de tampon SPC glacé et transférer dans une nouvelle bande de 8 tubes de 0,2 mL. Ajouter 20 μL des billes activées à chaque échantillon et pipeter doucement pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 10 min sans agitation.
2. Placez les tubes sur le rack magnétique jusqu’à ce que la boue soit dégagée; retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Retirez les tubes du rack magnétique et ajoutez 200 μL de tampon de lavage glacé à chaque échantillon. Remettez enseveli les perles en piquant doucement de haut en bas 5 fois. Transférer des aliquotes de 100 μL de chaque échantillon dans une nouvelle bande de 0,2 mL à 8 tubes.
   1. ÉTAPE CRITIQUE : Divisez chaque échantillon CUT&RUN en deux aliquotes distinctes. Utilisez l’une des aliquotes pour l’anticorps témoin négatif (p. ex., anticorps témoin négatif IgG) et l’autre pour l’anticorps cible contre la protéine d’intérêt (p. ex., anticorps anti-GFP).
      REMARQUE: Les deux échantillons sont nécessaires pour que le pipeline de calcul identifie avec précision les signaux d’enrichissement spécifiques au TF d’intérêt. Un contrôle supplémentaire à l’aide d’anticorps anti-GFP avec une souche non marquée peut également être effectué. Ce contrôle a montré des résultats comparables à l’utilisation d’anticorps IgG dans une souche marquée GFP. Par conséquent, pour plus de simplicité, il est recommandé d’utiliser le contrôle IgG standard pour toutes les expériences.

7. Liaison aux anticorps primaires

REMARQUE: La protéine de fusion pAG-MNase se lie bien aux anticorps IgG de lapin, de chèvre, d’âne, de cochon d’Inde et de souris¹⁷. En règle générale, la plupart des anticorps commerciaux certifiés ChIP-seq sont compatibles avec les procédures CUT&RUN. La quantité d’anticorps primaire utilisée dépend de l’efficacité de l’anticorps, et le titrage de l’anticorps (p. ex., dilution finale de 1:50, 1:100, 1:200 et 1:400) peut être nécessaire si l’anticorps d’intérêt n’a pas déjà été testé dans les expériences ChIP ou CUT&RUN. Refroidir tous les tampons sur la glace avant utilisation. Tous les tampons utilisés pour les étapes de liaison des anticorps doivent être préparés frais le jour de l’expérience.

1. Placez les tubes sur une grille magnétique et attendez que la boue soit complètement dégagée; retirer et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 50 μL du tampon d’anticorps et mélanger doucement par pipetage.
2. Ajouter 3 μL de l’anticorps polyclonal anti-GFP (ou 0,5 μg si vous utilisez un anticorps non testé). Incuber les tubes sur un mélangeur à nutation à 4 °C pendant 2 h.
   REMARQUE: Certains protocoles CUT&RUN signalent une augmentation du rendement en ajoutant un anticorps secondaire avant l’ajout de pAG-MNase¹⁴; cependant, aucune amélioration significative n’a été observée à l’aide de cette étape supplémentaire, et par conséquent, elle n’est pas incluse dans ce protocole.
3. Centrifugez brièvement les tubes à 100 × g à température ambiante pendant 5 s, placez les tubes sur un rack magnétique et, une fois la boue dégagée, retirez et jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Pendant que les tubes contenant les perles sont toujours sur le rack magnétique, ajoutez 200 μL de tampon de perméabilisation cellulaire glacé directement sur les perles. Retirez et jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez l’opération pour un total de deux lavages avec le tampon de perméabilisation cellulaire glacé.
4. Ajouter 50 μL de tampon de perméabilisation cellulaire glacé à chaque tube et mélanger doucement par pipetage.
   REMARQUE: Les billes sont souvent agrégées à ce stade, mais peuvent facilement être dispersées en mélangeant doucement à l’aide d’une pipette de 200 μL.

8. Liaison de la pAG-MNase à l’anticorps

1. Ajouter 2,5 μL de pAG-Mnase (20x bouillon) à chaque échantillon et mélanger doucement par pipetage. Placez les échantillons (légèrement surélevés à un angle d’environ 45 °) sur un nutateur à 4 °C. Allumez le nutateur et incubez les échantillons pendant 1 h.
2. Centrifugez brièvement les tubes à bande à 100 × g à température ambiante pendant 5 s, placez les tubes sur une grille magnétique et, une fois la boue dégagée, retirez et jetez le surnageant à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : Cette étape est essentielle. L’anticorps de transfert restant dans le capuchon ou les côtés des tubes après cette étape augmentera considérablement la quantité de signal de fond.
3. Pendant que les tubes contenant les billes sont encore sur le rack magnétique, ajoutez 200 μL de tampon de perméabilisation cellulaire glacé, laissez la boue se dégager et retirez et jetez le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez cette étape pour un total de deux lavages avec le tampon de perméabilisation cellulaire.
4. Ajouter 100 μL du tampon de perméabilisation cellulaire glacé aux échantillons et pipeter doucement de haut en bas 5 fois.

9. Digestion et libération ciblées de la chromatine

1. Incuber les tubes contenant le(s) échantillon(s) dans un bain de glace humide pendant 5 min. Ajouter 3 μL de 100 mM de CaCl₂ dans chaque échantillon à l’aide d’une pipette multicanal. Pipettez doucement de haut en bas 5 fois, remettez immédiatement les tubes au bain de glace humide et incubez pendant 30 min.
2. Ajouter 66 μL du tampon Stop à chaque échantillon et vaporiser doucement pour mélanger. Incuber les échantillons pendant 10 min à 37 °C dans un bain sec.
   REMARQUE: Il est recommandé d’ajouter 1,5 pg d’ADN hétérologue d’E. coli par échantillon dans le tampon Stop. L’ajout de 1,5 pg d’ADN de pointe d’E. coli donne lieu à 1 000 à 10 000 lectures de pointe cartographiées pour 1 à 10 millions de lectures expérimentales cartographiées¹⁴. L’ADN de pointe est utilisé pour calibrer la profondeur de séquençage et est particulièrement important pour comparer les échantillons d’une série. L’ajout d’E. coli est fortement recommandé mais pas essentiel. Le kit commercial CUT&RUN comprend de l’ADN épiloqué d’E. coli , mais il peut également être acheté séparément.
3. Placez les tubes sur le rack magnétique et transférez 160 μL du surnageant dans un tube microfuge de 1,5 mL. Transférer 80 μL de l’échantillon dans un nouveau tube de microfuge de 2 mL et conserver à -20 °C au cas où un échantillon de secours serait nécessaire. Passez à l’étape 10 avec l’échantillon de 80 μL.

10. Nettoyage des échantillons d’ADN prélevés

REMARQUE: Incuber des perles de purification de l’ADN à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Préchillage 100% isopropanol sur glace. Lors du mélange des échantillons, pipettez vers le haut et vers le bas 10 fois.

1. Perles de purification de l’ADN Vortex pour homogénéiser la suspension de perles. Ajouter 50 μL (~ 0,6 fois le volume de l’échantillon) des billes remises en suspension à chaque échantillon. Pipette-mélanger et incuber les échantillons sur un nutateur pendant 5 min à température ambiante.
   REMARQUE: Le rapport entre les billes de purification de l’ADN et l’échantillon utilisé est critique. L’utilisation d’un volume de 0,6 fois de solution de perle de purification de l’ADN par rapport à l’échantillon permet aux billes magnétiques de se lier à de grands fragments d’ADN libérés par les noyaux endommagés. Les fragments d’ADN enrichis en CUT&RUN sont beaucoup plus petits que ces gros fragments d’ADN et sont donc retenus dans le surnageant à cette étape.
2. Placez les tubes sur un rack magnétique et transférez 130 μL du surnageant contenant l’ADN sur une bande de 0,2 mL à 8 tubes. Ajoutez 30 μL supplémentaires de billes de purification de l’ADN à l’échantillon (le volume total est de 160 μL).
3. Ajouter 170 μL (~ 1x volume d’échantillon) d’isopropanol glacé à 100%, bien mélanger en pipetant de haut en bas 10 fois, et incuber sur de la glace pendant 10 min.
   REMARQUE: Il est essentiel que l’isopropanol 100% glacé soit utilisé pour cette étape pour les perles de purification de l’ADN afin de capturer efficacement les petits fragments enrichis en CUT & RUN.
4. Placez les tubes sur le rack magnétique et, une fois la boue dégagée, retirez et jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
5. Pendant que les tubes sont sur la grille magnétique, ajoutez 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à température ambiante aux tubes et incubez à température ambiante pendant 30 s. Retirez et jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez cette étape pour un total de deux lavages avec de l’éthanol à 80%.
6. Faites tourner rapidement les tubes à 100 × g, replacez les tubes sur le rack magnétique et retirez tout éthanol résiduel à l’aide d’une pipette une fois la boue éliminée. Séchez les perles à l’air libre pendant 5 min pendant que les tubes restent sur la grille magnétique avec le couvercle ouvert.
   REMARQUE: Ne dépassez pas 5 minutes de temps de séchage car cela peut réduire considérablement le rendement final en ADN.
7. Retirez les tubes du rack magnétique et éluez l’ADN des billes en ajoutant 17 μL de 0,1x Tris-EDTA (TE) à pH 8. Bien mélanger et incuber les tubes pendant 5 min à température ambiante.
8. Placez les tubes sur le rack magnétique jusqu’à ce que la boue devienne claire. Une fois la boue éliminée, transférer soigneusement 15 μL du surnageant dans un tube PCR stérile de 0,2 mL.
9. Mesurer la concentration de l’ADN collecté à l’aide d’un fluoromètre en suivant le protocole du fabricant.
   REMARQUE: En règle générale, la concentration de l’ADN collecté est d’environ 1 ng / μL. Parfois, la concentration de l’ADN collecté est trop faible pour être quantifiée à l’aide d’un fluoromètre. Ce n’est pas un indicateur d’une expérience ratée. Procéder à la préparation de la bibliothèque quelle que soit la concentration de l’ADN collecté.
10. Passez à l’étape 11 ou conservez les échantillons à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts.

11. Préparation de la bibliothèque pour le séquençage

REMARQUE : Les étapes suivantes utilisent un kit de préparation de bibliothèque disponible dans le commerce. Lorsque vous effectuez des étapes à l’aide du Ligation Master Mix, minimisez le toucher des tubes et gardez-les toujours sur la glace.

1. En utilisant 0,1x TE à pH 8, porter le volume total de l’ADN CUT&RUN à 50 μL. Faites un mélange principal de 3 μL de mélange d’enzymes End Prep et de 7 μL de tampon de réaction End Prep par échantillon. Ajoutez 10 μL de mélange maître à l’ADN CUT&RUN et mélangez soigneusement en pipetant 5 fois vers le haut et vers le bas.
2. Effectuez une rotation rapide à 100 × g pour recueillir tout le liquide des côtés du tube. Placez les tubes dans un thermocycleur avec le couvercle chauffant réglé sur ≥75 °C et exécutez les conditions de cycle dans le tableau 7.
   REMARQUE: Selon les concentrations d’ADN d’entrée de départ recueillies à l’étape 10, suivez la dilution requise de l’adaptateur du tableau 8.
3. Ajouter 2,5 μL d’adaptateur par échantillon et bien mélanger en pipetant 10 fois vers le haut et vers le bas.
   REMARQUE: Il est essentiel que l’adaptateur soit ajouté à l’échantillon et mélangé soigneusement avant l’ajout du mélange maître de ligature.
4. Faites un mélange principal de 30 μL de Ligation Master Mix et de 1 μL de Ligation Enhancer. Ajouter 31 μL du mélange principal à l’échantillon ou aux échantillons. Bien mélanger en pipetant de haut en bas 10 fois.
5. Incuber à 20 °C pendant 15 min dans un thermocycleur avec le couvercle chauffant enlevé.
   REMARQUE: Il est essentiel que les échantillons soient conservés sur de la glace et transférés au thermocycleur seulement après que le thermocycleur ait atteint 20 ° C.
6. Effectuez une rotation rapide à 100 × g pour recueillir tout le liquide des côtés du tube, ajoutez 3 μL d’enzyme d’excision d’uracile et incubez les tubes dans le thermocycleur à 37 °C pendant 15 min avec le couvercle chauffé réglé sur ≥47 °C.
   REMARQUE: Il s’agit d’un point d’arrêt sûr; conserver les échantillons à -20 °C ou continuer directement à l’étape 11.7. Si vous continuez directement à l’étape 11.7, incuber les perles de purification de l’ADN à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation.
7. Ajouter 154,4 μL (~ 1,6 fois le volume de l’échantillon) des billes de purification de l’ADN à la réaction de ligature de l’adaptateur de l’étape 11.6. Pipette-mélanger et incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante.
8. Placez les tubes sur le rack magnétique et une fois la boue dégagée, retirez et jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
9. Ajouter 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à température ambiante dans les tubes et incuber à température ambiante pendant 30 s. Retirez et jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et répétez cette étape pour un total de deux lavages avec de l’éthanol à 80%.
10. Faites tourner brièvement les tubes à 100 × g. Replacez les tubes sur le rack magnétique et retirez tout éthanol résiduel à l’aide d’une pipette. Sécher à l’air libre les billes pendant 5 min pendant que les tubes restent sur la grille magnétique avec le couvercle ouvert.
    REMARQUE: Ne dépassez pas 5 minutes de temps de séchage car cela peut réduire considérablement le rendement final en ADN.
11. Retirez les tubes du rack magnétique et éluez l’ADN des billes en ajoutant 17 μL de 0,1x TE à pH 8. Bien mélanger et incuber pendant 5 min à température ambiante.
12. Placez les tubes sur le rack magnétique jusqu’à ce que la boue devienne claire. Une fois la boue éliminée, transférer soigneusement 15 μL du surnageant dans un tube PCR stérile de 0,2 mL.
13. Faites un mélange principal de 25 μL d’ADN Polymerase Master Mix et de 5 μL d’Universal Forward Library Amplification Primer (10 μM) par échantillon.
    REMARQUE: Préparez un échantillon supplémentaire de mélange principal pour tenir compte des pertes de pipetage.
14. Ajouter 30 μL du mélange maître à l’échantillon d’ADN ligaturé par adaptateur de 15 μL. Ajoutez 5 μL d’amorce d’amplification de bibliothèque indexée de manière unique inversée (10 μM) à chaque échantillon pour porter le volume final à un total de 50 μL. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas 10 fois. Effectuer les conditions de cycle PCR dans le tableau 9.
    REMARQUE: Incuber les perles de purification de l’ADN à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation.
15. Vortex les perles de purification de l’ADN pour les remettre en suspension. Ajouter 35 μL (~ 0,7 fois le volume de l’échantillon) des billes remises en suspension aux échantillons d’ADN amplifiés par PCR. Mélanger et incuber les échantillons sur un nutateur pendant 5 min à température ambiante.
16. Placez les tubes sur le rack magnétique et une fois que la boue est dégagée, transférez le surnageant contenant l’ADN dans un nouveau tube à bande PCR de 0,2 mL à 8 puits.
17. Ajouter 119 μL (~ 1,4 fois le volume de l’échantillon) de perles à l’échantillon et mélanger en pipetant de haut en bas 5 fois. Incuber les échantillons sur un nutateur pendant 5 min à température ambiante.
18. Placez les tubes sur le rack magnétique et une fois la boue dégagée, retirez et jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
19. Ajouter 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à température ambiante dans les tubes et incuber à température ambiante pendant 30 s. Retirer et jeter soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette; répétez l’étape pour un total de deux lavages avec de l’éthanol à 80%.
20. Faites tourner brièvement les tubes à 100 × g. Replacez les tubes sur le rack magnétique et retirez tout éthanol résiduel à l’aide d’une pipette. Séchez les perles à l’air libre pendant 5 min pendant que les tubes restent sur la grille magnétique avec le couvercle ouvert.
    REMARQUE: Ne dépassez pas 5 minutes de temps de séchage car cela peut réduire considérablement le rendement final en ADN.
21. Retirez les tubes du rack magnétique et éluez l’ADN des billes en ajoutant 14 μL de 0,1x TE à pH 8. Bien mélanger et incuber pendant 5 min à température ambiante.
22. Placez les tubes sur le rack magnétique jusqu’à ce que la boue devienne claire. Une fois la boue éliminée, transférer soigneusement 13 μL du surnageant dans un tube PCR stérile de 0,2 mL.
23. Préparez 1x Tris-borate-EDTA (TBE) frais et insérez du gel TBE d’acrylamide 10% commercial préfabriqué dans l’appareil d’électrophorèse en gel rempli de 1x TBE.
24. Dans le premier puits, ajoutez 2 μL d’échelle d’ADN de basse portée. Mélanger 3 μL de colorant de chargement 6x avec 13 μL de l’échantillon précédemment prélevé à l’étape 11.22. Ajouter soigneusement 15 μL dans chaque puits du gel. Faites fonctionner le gel pendant 90 min à 70 V.
    REMARQUE: Il est recommandé de laisser un puits vide dans le gel entre chaque échantillon, car cela réduit le risque de contamination croisée de l’échantillon. Les utilisateurs expérimentés peuvent trouver approprié d’utiliser tous les puits tout en évitant soigneusement la contamination croisée, en particulier lors du traitement d’un grand nombre d’échantillons.
25. Retirez le gel coulé de la boîte de gel. Ouvrez le gel coulé selon les instructions du fabricant, retirez doucement le gel du gel coulé et placez-le dans un plateau contenant 100 mL de 1x TBE.
    REMARQUE: Assurez-vous de retirer doucement le gel du plâtre pour éviter de déchirer le gel car il est mince et fragile. Il est essentiel de préhumidifier les gants et le gel avec 1x TBE chaque fois que vous manipulez le gel. Le plateau de maintien du gel doit être légèrement plus grand que la taille du gel (environ 0,5 « de chaque côté). Les couvercles en plastique fournis avec des boîtes de rangement à tubes PCR à 96 puits sont des plateaux de maintien pratiques pour les tailles de mini gel standard.
26. Ajouter 10 μL de la tache de gel d’acide nucléique sur le plateau et faire tourbillonner doucement. Couvrir avec du papier d’aluminium pour protéger de la lumière et incuber statiquement à température ambiante pendant 10 min.
27. Rincez le gel deux fois avec 100 mL d’eau du robinet désionisée. Imagez le gel sous éclairage à la lumière bleue à l’aide d’un couvercle filtrant orange (Figure 2).
    REMARQUE: Les bibliothèques réussies affichent un frottis entre 100 et 500 bp. Il y aura également une bande dimère d’adaptateur proéminente ~ 125. La présence de dimères d’adaptateur n’est pas un indicateur de mauvaise qualité de bibliothèque. Cette quantité de dimères d’adaptateur est inévitable pour les expériences CUT&RUN effectuées sur des TF de faible abondance et est une conséquence de la faible quantité de matériel d’entrée utilisé pour préparer ces bibliothèques. N’utilisez pas de lumière ultraviolette, qui peut endommager l’ADN.
28. Comme le montre la figure 2, pour chaque bibliothèque, coupez le gel légèrement au-dessus de la bande dimère de l’adaptateur proéminente d’environ 125 pb (en vous assurant d’éviter de toucher la bande dimère de l’adaptateur) et en dessous de la marque d’échelle de 400 bp.
    REMARQUE: Il est essentiel d’éviter la bande dimère de l’adaptateur ~ 125. Même de petites quantités de dimères d’adaptateur réduiront considérablement la qualité de la bibliothèque.
29. Perforez le fond d’un tube de 0,65 mL à l’aide d’une aiguille de 22 G et placez le tube perforé à l’intérieur d’un tube de microfuge stérile de 2 mL. Transférer la tranche de gel dans le tube perforé à l’intérieur du tube de microfuge de 2 mL.
30. Centrifuger le tube de microfuge de 2 mL contenant le tube perforé de 0,65 mL et échantillonner à 10 000 × g à température ambiante pendant 2 min pour prélever la boue de gel à l’intérieur du tube de microfuge de 2 mL.
    REMARQUE: Le tube perforé doit maintenant être vide et peut être jeté. S’il reste encore du gel dans le tube perforé, replacez le tube perforé à l’intérieur du tube de microfuge de 2 mL et centrifugez à nouveau à 10 000 × g à température ambiante pendant 2 minutes supplémentaires.
31. À la boue de gel à l’intérieur du tube de microfuge de 2 mL, ajouter 300 μL de tampon d’élution de gel glacé et mélanger sur un nutateur à température ambiante pendant au moins 3 h ou pendant la nuit (12-16 h).
32. Transférer toute la boue liquide et gel dans une colonne filtrante de 0,22 μm. Centrifuger à 10 000 × g à température ambiante pendant 1 min; le volume collecté doit être d’environ 300 μL.
33. Ajouter 450 μL (~ 1,5 fois le volume de l’échantillon) de billes de purification de l’ADN, incuber à température ambiante pendant 5 minutes sur un nutateur, puis placer l’échantillon sur le rack magnétique jusqu’à ce que la boue soit claire.
    REMARQUE: Incuber les perles de purification de l’ADN à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation.
34. Retirez et jetez 500 μL du surnageant, en veillant à ne pas perturber les perles.
35. Retirez l’échantillon de la grille magnétique et mélangez les billes en pipetant de haut en bas 5 fois. Transférer 200 μL de l’échantillon dans un nouveau tube de bande PCR.
36. Placez le tube à bande sur le support magnétique et, une fois la boue dégagée, retirez et jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
37. Ajouter 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé à température ambiante dans les tubes et incuber à température ambiante pendant 30 s. Retirer et jeter soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette; répétez cette étape pour un total de deux lavages à l’éthanol à 80 %.
38. Faites tourner brièvement les tubes à 100 × g. Replacez les tubes sur le rack magnétique et retirez tout éthanol résiduel à l’aide d’une pipette. Séchez les billes à l’air libre jusqu’à 5 minutes pendant que les tubes restent sur la grille magnétique avec le couvercle ouvert.
    REMARQUE: Ne dépassez pas 5 minutes de temps de séchage car cela peut réduire considérablement le rendement final en ADN.
39. Retirez les tubes du rack magnétique et éluez l’ADN des billes en ajoutant 17 μL de 0,1x TE à pH 8. Bien mélanger et incuber les tubes pendant 5 min à température ambiante.
40. Placez les tubes sur le rack magnétique jusqu’à ce que la boue devienne claire. Une fois la boue éliminée, transférer soigneusement 15 μL du surnageant dans un tube PCR stérile de 0,2 mL.
41. Mesurer la quantité finale de la bibliothèque à l’aide du fluoromètre; utilisez cette bibliothèque finale pour le séquençage.
    REMARQUE : Jusqu’à 48 bibliothèques peuvent être regroupées et séquencées dans une seule voie à l’aide d’une plate-forme de séquençage qui fournit au moins 300 millions de lectures appariées de 40 bp ou plus.

12. Analyse de séquence CUT&RUN

REMARQUE : Cette section présente le protocole de calcul utilisé pour analyser les données de séquence CUT&RUN. Le protocole commence par la configuration de l’environnement virtuel de calcul et guide les utilisateurs tout au long de l’exécution des commandes sur leur ordinateur local. Ce protocole fonctionnera sur toutes les ressources de calcul, telles que les machines locales, les serveurs cloud virtuels et les clusters de calcul haute performance. Toutes les données CUT&RUN présentées dans ce document peuvent être consultées sur NCBI GEO sous le numéro d’acquisition GSE193803.

1. Téléchargez le code source de l’analyse CUT&RUN à partir de https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
   REMARQUE: Le flux de travail fonctionnera mieux sur un système d’exploitation MacOS ou Linux. Les utilisateurs Windows peuvent exécuter le flux de travail à l’aide de GitBash (voir la table des matériaux).
   1. Téléchargez directement le code depuis la page GitHub en cliquant sur le bouton vert Code | Télécharger l’option ZIP . Décompressez le dossier à un emplacement approprié sur l’ordinateur local.
2. Installez l’environnement Conda (voir la table des matériaux) et exécutez-le une seule fois.
   REMARQUE : Ce flux de travail utilise l’environnement de l’outil de ligne de commande Conda pour installer tous les logiciels et outils requis.
3. Une fois Conda installé (exécuté une seule fois), créez un environnement virtuel à l’aide du fichier supplémentaire 2 fourni avec la commande suivante :
   conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
4. Activez l’environnement virtuel chaque fois que ce workflow doit être exécuté à l’aide de :
   conda activer
5. Organisez les fichiers FASTQ bruts d’entrée dans un seul dossier, idéalement un dossier par expérience CUT&RUN.

13. Génération du fichier génome pour l’alignement

1. Générez le fichier de génome pour l’alignement (exécutez une seule fois pour chaque fichier de génome). Créez un dossier pour enregistrer tous les fichiers du génome de C. albicans , tels que :
   mkdir ca_genome_files

14. Téléchargement de l’assemblage du génome de C. albicans 21

1. Téléchargez l’assemblage du génome de C. albicans 21 à partir de la base de données du génome de Candida à l’aide d’outils wget ou curl (voir la table des matériaux)¹⁸.
   REMARQUE: L’assemblage 21 de C. albicans a été utilisé ici pour comparer les résultats de CUT&RUN avec les résultats de la puce ChIP précédemment publiés, qui étaient alignés sur l’assemblage 21. Les utilisateurs peuvent télécharger d’autres versions d’assemblage et exécuter des commandes similaires pour générer des fichiers de génome pertinents pour leurs besoins d’alignement.

15. Générer une base de données d’index Bowtie 2 (nom de la base de données : ca21)

1. Utilisez les éléments suivants :
   nœud papillon2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
   nœud papillon2-inspect -s ca21

16. Exécutez le pipeline d’analyse CUT&RUN

1. Lisez la section d’aide pour vous familiariser avec les paramètres du pipeline.
   bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Exécutez le fichier cut_n_run_pipeline.sh avec les paramètres pertinents

1. Exécutez le script :
   bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
   REMARQUE: Les paramètres pertinents avec des descriptions détaillées sur les lignes 19-36 du code sont décrits sur la page GitHub https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. Organiser les fichiers de sortie

1. Fusionnez les pics significatifs de toutes les réplications appelées par MACS2 situées dans /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 à l’aide de la fonction de fusion BedTools¹⁹.
   cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sort -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last,mean,first,mean,mean,mean > /path/to/merged_output.bed
   REMARQUE : Pour de plus amples renseignements et des pratiques exemplaires sur l’évaluation des pics qui se chevauchent dans les échantillons répliqués, veuillez consulter Landt et coll. ²⁰ et Boyd et coll. ²¹.

19. Supprimer les correspondances vers les régions génomiques répertoriées bloquées à l’aide de la fonction de soustraction de BedTools

1. Utilisez ce qui suit : soustraireBed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
   REMARQUE : Les régions répertoriées dans le génome de C. albicans sont fournies sous forme de fichier .bed dans le fichier supplémentaire 3. La liste se compose principalement d’éléments de séquence et de régions très répétitifs tels que les répétitions télomériques et les centromères qui donnent généralement des résultats faussement positifs dans les ensembles de données C. albicans CUT&RUN, ChIP-seq et ChIP-chip. Par conséquent, il est recommandé de supprimer les régions répertoriées par bloc. Cependant, pour certaines cibles protéiques, il peut être inapproprié ou indésirable d’exclure ces loci. Les utilisateurs peuvent ignorer cette étape pour conserver les signaux contenus dans ces régions répertoriées par bloc ou créer leurs propres régions répertoriées par bloc.

20. Fusionner les fichiers BigWig à partir de répliques à l’aide de la fonction UCSC bigWigMerge²²

1. Utilisez ce qui suit : bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
2. Convertissez la sortie BedGraph de bigWigMerge en BigWig à l’aide de la fonction UCSC bedGraphToBigWig.
   bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

Résultats

Ce protocole CUT&RUN robuste a été adapté et optimisé pour étudier la localisation à l’échelle du génome de TF spécifiques dans les biofilms et les cultures planctoniques de C. albicans (voir la figure 2 pour un aperçu de l’approche expérimentale). Un pipeline d’analyse de données approfondi est également inclus pour faciliter l’analyse des données de séquençage CUT&RUN résultantes et exige que les utilisateurs aient une expertise minimale en codage ou en bi...

Discussion

Ce protocole présente un pipeline expérimental et informatique complet pour la localisation à l’échelle du génome des TF régulateurs chez C. albicans. Il est conçu pour être hautement accessible à toute personne ayant une formation standard en microbiologie et en biologie moléculaire. En tirant parti de la plage dynamique élevée et des faibles exigences d’entrée d’échantillon du test CUT&RUN et en incluant des optimisations pour la localisation des interactions de liaison TF-ADN dans le biofi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes	VWR	490003-190
1 M CaCl2	Fisher Scientific	50-152-341
1 M PIPES	Fisher Scientific	AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates	Corning	351143
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
2% Digitonin	Fisher Scientific	CHR103MI
50 mL conical tubes	VWR	89039-658
5x phusion HF buffer	Fisher Scientific	F530S	Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar	Criterion	C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads	Beckman Coulter	A63880
Agilent Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific	VWR	89133-910
Bacto peptone	BD Biosciences	211677
Benchling primer design tool	Benchling		https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine	Fisher Scientific	AAJ77507AB
Calcofluor white stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
Candida Genome Database			http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads	Polysciences	86057-3
Conda software			https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit	Epicypher	14-1048	Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)	New England Biolabs	N0447S
Dextrose (D-glucose)	Fisher Scientific	D163
Difco D-mannitol	BD Biosciences	217020
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)	Fisher Scientific	R0611
DreamTaq green DNA polymerase	Fisher Scientific	EP0713	Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer	Fisher Scientific	EP0713	Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA	Epicypher	18-1401
ELMI Microplate incubator	ELMI	TRMS-04	Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof	VWR	89125-170
FastDigest MssI	Fisher Scientific	FD1344	Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer	Fisher Scientific	FD1344	Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400	Fisher BioReagents	BP525-25
Fluorescence microscope			User-dependent
Gel electrophoresis apparatus			User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder	Fisher Scientific	FERSM1192
GitBash workflow			https://gitforwindows.org/
GitHub source code			https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5	Boston BioProducts	BBH-75-K
High-speed centrifuge			User-dependent
Isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1830-4
Lens paper	VWR	52846-001
Ligation Enhancer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate	MP Biomedicals	215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody	Takara	632592	User-dependent
MACS2			https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes	Epicypher	10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes	Fisher Scientific	MR02
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC	Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView			http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
NaCl	VWR	470302-522
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
NCBI GEO			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit	New England Biolabs	E7645S	Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)	Goldbio	N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well	Fisher Scientific	EC62755BOX
Nutating mixer	VWR	82007-202
Nutrient broth	Criterion	C6471
pADH110	Addgene	90982	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119	Addgene	90985	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137	Addgene	90986	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139	Addgene	90987	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140	Addgene	90988	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase	Epicypher	15-1016 or 15-1116	50 rxn or 250 rxn
pCE1	Addgene	174434	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid	Fisher Scientific	FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase	Fisher Scientific	F530S	Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350	VWR	10791-816
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q33230
Qubit fluorometer	Life Technologies	Q33216	Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody	Epicypher	13-0042
RNase A	Sigma-Aldrich	10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets	Sigma-Aldrich	5056489001
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
Shaking incubator	Eppendorf	M12820004	User-dependent
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters	Fisher Scientific	07-200-385
Sterile inoculating loops	VWR	30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Fisher Scientific	S11494
SYTO 13 nucleic acid stain	Fisher Scientific	S7575	Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler			User-dependent
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sigma-Aldrich	252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution	Invitrogen	15632011
USER Enzyme			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer	VWR	10153-834
wget tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
Yeast extract	Criterion	C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)	Fisher Scientific	NC0439194