JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجية استئصال ظهارة صبغة الشبكية وراثيا (RPE) باستخدام نموذج الزرد المعدل وراثيا. تكييف البروتوكول لدمج تعديل مسار الإشارات باستخدام المركبات الدوائية مفصل على نطاق واسع. تم تطوير منصة MATLAB لقياس تجديد RPE على أساس التصبغ ويتم تقديمها ومناقشتها.

Abstract

توجد ظهارة صبغة الشبكية (RPE) في الجزء الخلفي من العين وتؤدي وظائف ضرورية للحفاظ على صحة وسلامة أنسجة الشبكية والأوعية الدموية المجاورة. وفي الوقت الحاضر، أعاقت القدرة المحدودة على إصلاح قواعد السلوك في الثدييات، التي تقتصر على الإصابات الصغيرة، التقدم المحرز في فهم العمليات التجديدية للقواعد في الجسم الحي . هنا ، يتم توفير منهجية مفصلة لتسهيل دراسة إصلاح RPE في الجسم الحي باستخدام الزرد ، وهو نموذج فقاري قادر على تجديد الأنسجة القوية. يصف هذا البروتوكول نموذج إصابة بوساطة النيتروجين / ميترونيدازول المعدل وراثيا (NTR / MTZ) (rpe65a: nfsB-eGFP) ، والذي يؤدي إلى استئصال الثلثين المركزيين من RPE بعد 24 ساعة من العلاج باستخدام MTZ ، مع استعادة الأنسجة لاحقا. وينصب التركيز على عمليات استئصال RPE في أسماك الزرد اليرقية وطرق اختبار آثار المركبات الدوائية على تجديد RPE. كما تمت مناقشة إنشاء والتحقق من صحة RpEGEN ، وهو برنامج نصي MATLAB تم إنشاؤه لأتمتة القياس الكمي لتجديد RPE على أساس التصبغ. بالإضافة إلى آليات إصلاح RPE النشطة ، يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل دراسات انحطاط RPE واستجابات الإصابة بالإضافة إلى آثار تلف RPE على أنسجة الشبكية والأوعية الدموية المجاورة ، من بين العمليات الخلوية والجزيئية الأخرى. يحمل نظام الزرد هذا وعدا كبيرا في تحديد الجينات والشبكات والعمليات التي تدفع تجديد RPE والآليات المتعلقة بأمراض RPE ، مع هدف طويل الأجل يتمثل في تطبيق هذه المعرفة على أنظمة الثدييات ، وفي النهاية ، نحو التطوير العلاجي.

Introduction

تفصل المنهجية الموصوفة هنا بروتوكولا لاستئصال ظهارة صبغة الشبكية (RPE) وراثيا باستخدام الزرد اليرقي. يمتد RPE فوق الجزء الخلفي من العين ويقيم بين الطبقات الطبقية للشبكية العصبية وطبقة الأوعية الدموية التي تشكل المشيمة. الدعم الغذائي ، وامتصاص الضوء السام للضوء ، والحفاظ على بروتينات الدورة البصرية ليست سوى بعض الوظائف الحرجة التي يؤديها RPE والتي تعتبر ضرورية للحفاظ على صحة وسلامة هذه الأنسجة المجاورة1. الأضرار التي لحقت RPE الثدييات قابلة للإصلاح عندما تكون الآفات صغيرة2 ؛ ومع ذلك ، فإن الأضرار التي تعاني منها الإصابات الأكبر أو الأمراض التنكسية التقدمية لا رجعة فيها. في البشر ، تؤدي الأمراض التنكسية RPE (على سبيل المثال ، التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ومرض Stargardt) إلى فقدان البصر الدائم ، ومع قلة خيارات العلاج المتاحة ، انخفاض نوعية حياة المريض. وقد خلقت القدرة المحدودة ل RPE الثدييات على الإصلاح الذاتي فجوة معرفية في مجال العمليات التجديدية RPE. وبالنظر إلى القدرة التجديدية القوية لأسماك الزرد عبر العديد من أنواع الأنسجة المختلفة، تم تطوير هذا البروتوكول لإنشاء نظام فقاريات في الجسم الحي لتسهيل الدراسات حول تجديد RPE بشكل جوهري والكشف عن الآليات التي تدفع هذه الاستجابة. باستخدام نموذج الاستئصال الموضح هنا ، تم تحديد مسار إشارات Wnt الأساسي3 ، ومسار mTOR4 ، والاستجابات المتعلقة بالمناعة5 كوسطاء حاسمين لتجديد RPE ، على الأرجح مع وظائف متداخلة.

في نموذج الاستئصال الجيني هذا، يعبر Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 الزرد عن الجين6 المشتق من البكتيريا النيتروجيني المختزل (NTR/nfsB) المنصهر في eGFP تحت سيطرة عنصر محسن RPE، rpe65a7. يتم تحقيق الاجتثاث عن طريق إضافة البرودوية ، ميترونيدازول (MTZ) ، إلى نظام الزرد الذي يحتوي على الماء. يؤدي التنشيط داخل الخلايا ل MTZ بواسطة nitroreductase إلى ترابط الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج في الخلايا المعبرة عن NTR / nfsB 8,9. وقد استخدمت هذه التكنولوجيا على نطاق واسع في أسماك الزرد للقضاء على خلايا شبكية العين 10،11،12،13 وغيرها من الأنسجة8. معا ، تتيح هذه العناصر التعبير المستهدف (rpe65a) لمنهجية استئصال الخلايا القابلة للحث (NTR / MTZ) 8,9 وعلامة الفلورسنت (eGFP) للتصور.

توجد أيضا نماذج أخرى مثيرة للاهتمام في الجسم الحي يمكن استخدامها لدراسة الإمكانات التجديدية ل RPE14. وهي واسعة النطاق وتشمل تحويل RPE إلى شبكية العين بعد استئصال شبكية العين في البرمائيات ، حيث يتم استبدال خلايا RPE المفقودة بسبب إعادة نمو الشبكية15,16 ؛ استعادة RPE بعد الإصابة في الماوس MRL / MpJ17 "الشفاء الفائق" ؛ والتحفيز الخارجي لانتشار RPE في نموذج الفئران من RPE التلقائي وتنكس الشبكية18 ، من بين أمور أخرى. كما تم تطوير نماذج في المختبر، مثل الخلايا الجذعية البشرية البالغة (RPESCs)19. وهذه النماذج كلها أدوات قيمة تعمل على الكشف عن العمليات الخلوية المتصلة بتجديد قواعد التشغيل والتقييم (مثل الانتشار، والتمايز، وما إلى ذلك)؛ ومع ذلك ، فإن الزرد فريد من نوعه في قدرته على إصلاح RPE الجوهري بعد الاستئصال.

في حين أن المنهجية هنا مكتوبة للتركيز على فهم الآليات التي تقود تجديد RPE ، يمكن استخدام خط Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) وبروتوكول الاستئصال الجيني هذا لدراسة العمليات الخلوية الأخرى مثل موت الخلايا المبرمج RPE ، وتنكس RPE ، وتأثير إصابة RPE على أنسجة الشبكية والأوعية الدموية المجاورة. يمكن أيضا تعديل بروتوكول الاستئصال ليشمل التلاعب الدوائي ، وهو استراتيجية أولية مريحة لفحص مسارات الإشارات ذات الاهتمام. على سبيل المثال ، ثبت أن حظر مسار Wnt الأساسي باستخدام مثبط استجابة Wnt Response-1 (IWR-1)20 ، يضعف تجديد RPE3. تم تكرار ذلك هنا لتوجيه المستخدمين من خلال تجربة التلاعب الدوائي ويكون بمثابة إثبات للمفهوم للتحقق من صحة برنامج نصي MATLAB (RpEGEN) تم إنشاؤه لتحديد تجديد RPE بناء على استعادة التصبغ. مثل الخط المعدل وراثيا وبروتوكول الاستئصال ، فإن نصوص RpEGEN قابلة للتكيف ويمكن استخدامها لتحديد العلامات / العمليات الخلوية الأخرى داخل RPE.

Protocol

جميع المنهجيات الموضحة هنا متوافقة مع اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) بجامعة بيتسبرغ.

1. التحضير قبل جمع جنين الزرد

  1. اضبط حاضنة الأجنة على 28.5 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد محلول مخزون 25x لمثبط تكوين الميلانوجينيا ، N-phenylthiourea (PTU) 21,22. يتم قياس محلول المخزون هذا من وصفة شائعة22 و 1x يساوي 0.003٪ من الوزن لكل حجم (٪ w / v) (على سبيل المثال ، 0.003 غرام من مسحوق PTU إلى 100 مل من المذيب السائل).
    1. لصنع محلول مخزون PTU كبير 25x ، أضف 0.75 جم من مسحوق PTU إلى 1 لتر من الماء النقي منزوع الأيونات (يشار إليه فيما يلي باسم dH2O) واخلطه جيدا في درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية) باستخدام شريط تحريك ولوحة تحريك. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر محمية من الضوء.
      ملاحظة: من الصعب الحصول على PTU للذهاب إلى محلول مائي وقد يكون من الضروري التحريك الممتد بين عشية وضحاها.
      تحذير: PTU خطير ، ويجب توخي الحذر لمنع الابتلاع والاستنشاق و / أو ملامسة الجلد أو العينين. قد تحتاج إلى التخلص من مسحوق PTU وجميع المشتقات السائلة PTU الموصوفة هنا كنفايات كيميائية اعتمادا على لوائح الدولة والمؤسسة. يوصى بتأكيد طرق التخلص من النفايات PTU المناسبة ، إن وجدت ، قبل الاستخدام.
    2. لإنشاء حل عمل 1.5x PTU (يشار إليه فيما يلي باسم 1.5x PTU) ، أضف 60 مل من محلول مخزون PTU 25x إلى 940 مل من مياه مرفق إسكان أسماك الزرد (يشار إليها فيما يلي باسم مياه النظام). وقد وصفت البارامترات المثلى لنوعية المياه لأسماك الزرد23 وينبغي أن يكون لدى مرافق الأحياء المائية إجراءات موحدة لرصد المياه. قم بتخزين 1.5x PTU على درجة حرارة 28.5 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع محمية من الضوء.
      ملاحظة: يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل روتيني باستخدام تركيزات PTU والمذيبات ومعلمات التخزين الموضحة في الخطوة 1.2. كإجراء وقائي ، يجب ملاحظة الأجنة / اليرقات كل 1-2 أيام أثناء وجودها في PTU للتحقق من الفعالية وتأكيد التصبغ المستدام. يجب تحسين ظروف الذوبان و / أو التخزين إذا تم الاشتباه في انخفاض في قابلية / فعالية PTU.
  3. قم بإعداد محلول مخزون بنسبة 0.05٪ w/v methylene blue ، وهو مثبط للنمو الفطري ، عن طريق إضافة 0.05 جم من مسحوق الميثيلين الأزرق إلى 100 مل من dH2O. اخلطه جيدا باستخدام شريط التحريك ولوحة التحريك. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  4. قم بإعداد ماصات للتلاعب بالأجنة / اليرقات (على سبيل المثال ، نقل الأجنة / اليرقات بين أطباق بتري ، وفصل اليرقات أثناء فحص التألق ، وجمع اليرقات الرحيمة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة للتثبيت ، وما إلى ذلك) عن طريق تقليل النهاية المدببة لماصة باستور الزجاجية باستخدام قلم كتابة طرف الماس. حفر حول محيط الماصة باستخدام قلم الماس واسحب الطرف أو التقطه برفق لعمل استراحة نظيفة.
    ملاحظة: يجب أن يكون فم الماصة سلسا وواسعا بما يكفي لاستيعاب الجنين بسهولة داخل المشيمة دون قص. استخدم ماصة نقل سحب المصباح كبديل. يمكن أيضا استخدام الماصات المحضرة لإزالة السائل أثناء تغيرات الماء (بدلا من الصب) لتقليل فقدان الجنين / اليرقات.
  5. قم بإعداد محلول بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة 4٪ في محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS) (على سبيل المثال ، أضف 10 مل من 16٪ PFA إلى 4 مل من 10x PBS و 26 مل من dH2O). يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع محمية من الضوء.
    تحذير: بارافورمالدهيد مادة كيميائية خطرة ويجب التعامل معها في غطاء الدخان الكيميائي والتخلص منها بشكل صحيح. يجب توخي الحذر ، ويجب ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) ، لمنع الابتلاع والاستنشاق و / أو ملامسة الجلد أو العينين.

2. جمع جنين الزرد وصيانته قبل الاستئصال الجيني (0-5 أيام بعد الإخصاب)

  1. الحفاظ على سمك الزرد البالغ كما هو موضح سابقا3،4،5. بعد الظهر / المساء قبل جمع الأجنة ، افصل أسماك الزرد البالغة في خزانات تربية للتبويض.
  2. في صباح اليوم التالي (0 أيام بعد الإخصاب (dpf))، جمع الأجنة في أطباق بتري قطرها 10 سم في ماء النظام وإزالة جميع البيض غير القابل للحياة أو غير المخصب، والتي سوف تظهر معتمة و / أو تظهر السيتوبلازم غير المنتظمة وفشل الانقسام24.
    ملاحظة: سيكون الانقسام الطبيعي وأحداث التدريج التنموي واضحة في الأجنة السليمة كما هو موضح25. يجب أن تبقى أطباق بتري ممتلئة بثلاثة أرباع (~ 30 مل لطبق قطره 10 سم) طوال البروتوكول.
    1. أضف قطرتين من 0.05٪ مع الميثيلين الأزرق إلى كل طبق بتري ، واخلطهما بلطف ، واخزني الأجنة على درجة حرارة 28.5 درجة مئوية لبقية البروتوكول.
  3. حوالي 6 ساعات بعد الإخصاب (hpf) 4،5،26 ، استبدل ماء النظام في أطباق بتري الجنينية ب 1.5x PTU (حل العمل المصنوع في الخطوة 1.2.2) وتجديد الميثيلين الأزرق.
    ملاحظة: يجب إضافة PTU إلى الأجنة قبل ظهور التصبغ (أي قبل 24 hpf)25 لأن الأنسجة المصطبغة بالفعل لن تتحلل عند إضافة PTU21. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه تم الإبلاغ عن انخفاض حجم العين ، والعجز في العين والقحف الوجهي ، وتعطيل بعض مسارات الإشارات (على سبيل المثال ، إشارات الغدة الدرقية) في أسماك الزرد المعالجة ب PTU27،28،29. يبدو أن السمية التنموية ل PTU تعتمد على تركيز وتوقيت إضافة PTU27,29. كما ذكر أعلاه للتحقق من فعالية PTU (الخطوة 1.2) ، يجب أيضا مراقبة علامات سمية PTU بعناية ، وإذا كان يشتبه في ذلك ، يجب تحسين تركيز العمل و / أو وقت إضافة PTU.
  4. على 2-3 dpf ، الأجنة dechorionate باستخدام محلول pronase الطازجة.
    1. يذوب البروناز في 1.5x PTU بتركيز 2 ملغ / مل عن طريق الدوامة.
      تنبيه: يتم تعبئة Pronase كمسحوق ناعم جدا وهو مهيج. اتخاذ تدابير لتجنب الاستنشاق و / أو ملامسة الجلد والعينين وما إلى ذلك.
    2. فصل الأجنة المفرخة عن الأجنة غير المفرخة وعلاج الأجنة غير المفرخة فقط.
    3. استبدل 1.5x PTU بمحلول بروناس 2 ملغم / مل مصنوع في الخطوة 2.4.1 واتركه على الأجنة غير المفرخة لمدة 4-5 دقائق مع إثارة لطيفة (على سبيل المثال ، على دوار / شاكر على الطاولة أو عن طريق الدوران اليدوي).
    4. يسكب محلول البروناس ويشطف على الفور ب 1.5x PTU طازج. شطف 1.5x PTU بلطف على الأجنة باستخدام ماصة نقل سحب المصباح.
    5. كرر شطف PTU الثاني بمعدل 1.5x للتخلص من جميع حطام المشيمة ، ثم قم بتجديد 1.5x PTU للصيانة.
      ملاحظة: يمكن أيضا إزالة الأحشاء يدويا باستخدام ملقط ذو رؤوس دقيقة. في هذه الحالة ، يجب إزالة حطام المشيمية وتجديد 1.5x PTU بعد إزالة الشوك اليدوي.
  5. مراقبة صحة الجنين / اليرقات وتجديد 1.5x PTU كل 1-2 أيام. يتم الاحتفاظ بالأجنة / اليرقات في 1.5x PTU حتى الاستئصال عند 5 dpf.
    ملاحظة: يتم تناول أهمية الخطوتين 2.3 و2.4 بمزيد من التفصيل في قسم المناقشة.

3. فحص يرقات الزرد ل rpe65a: nfsB-eGFP والاستئصال الجيني لظهارة صبغة الشبكية (5-6 أيام بعد الإخصاب)

  1. اصنع محلول ميترونيدازول (MTZ) طازج 10 مللي متر مربع على 5 dpf (يوم الاستئصال). تستغرق هذه العملية 2 ساعة لإكمالها.
    1. أضف مسحوق MTZ إلى ماء النظام بدون PTU واخلطه جيدا عن طريق الاهتزاز القوي (على سبيل المثال ، 250 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بتبريد محلول MTZ سعة 10 mM لمدة 1 ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة على دوار / شاكر على الطاولة وتأكد من الذوبان الكامل قبل الإضافة إلى أطباق Petri مع اليرقات.
      ملاحظة: يمكن إجراء فحص التألق وفصل يرقات eGFP + (الخطوة 3.2) أثناء حضانة 37 درجة مئوية ودرجة حرارة الغرفة.
      تحذير: MTZ خطرة ، ويجب توخي الحذر لمنع الابتلاع والاستنشاق و / أو ملامسة الجلد أو العينين. قد تحتاج إلى التخلص من مسحوق MTZ وجميع المشتقات السائلة الموضحة هنا كنفايات كيميائية اعتمادا على لوائح الدولة والمؤسسات. يوصى بتأكيد الطرق المناسبة للتخلص من نفايات MTZ ، إن وجدت ، قبل الاستخدام.
  2. شاشة يرقات الزرد ل rpe65a:nfsB-eGFP transgene.
    1. تخدير اليرقات مع 0.168 جم / لتر من التريكاين (MS-222) واليرقات المعدلة وراثيا (eGFP+) المنفصلة (الشكل 1) عن اليرقات غير المعدلة وراثيا (eGFP-) باستخدام مجهر ستيريو فلوري مع ليزر / مرشح إثارة 488 نانومتر.
      ملاحظة: يجب إضافة Tricaine إلى 1.5x PTU و / أو المحاليل المركبة الدوائية حيث يجب أن تظل اليرقات مغمورة في العلاج أثناء فحصها بحثا عن eGFP. احتضان اليرقات في التريكاين فقط طوال مدة الفحص (على سبيل المثال ، ≤10 دقائق لطبق بتري واحد 10 سم يحتوي على 50 يرقة).
    2. استيقظ على الفور من اليرقات التي تم فحصها عن طريق السحب مباشرة إلى طبق بتري مع 1.5x PTU طازج بدون تريكاين.
    3. عند الانتهاء من الفحص ، قم بفصل يرقات eGFP + إلى مجموعتين من أطباق Petri: مجموعة واحدة لتلقي علاج MTZ (ablated / MTZ +) ومجموعة واحدة لتكون التحكم غير المقيد (MTZ-).
  3. إزالة ظهارة صبغة الشبكية.
    1. قم بإزالة 1.5x PTU من أطباق التحكم غير المنفذة (MTZ-) وأضف مياه النظام العذبة بدون PTU.
    2. قم بإزالة 1.5x PTU من أطباق المعالجة المبطنة (MTZ +) وأضف محلول MTZ الطازج 10 mM (الخطوة 3.1).
    3. قم بإزالة محلول MTZ 10 mM بعد 24 ساعة بالضبط (معين بعد يوم واحد بعد الإصابة (dpi)) وأضف مياه النظام العذبة بدون PTU. تغيير مياه النظام العذبة بدون PTU على طبق ( أطباق) MTZ. لن تتعرض اليرقات ل PTU مرة أخرى لما تبقى من البروتوكول.
      ملاحظة: قد يكون من الصعب ماصة أو صب كل 1.5x PTU (الخطوتان 3.3.1 و 3.3.2) أو 10 mM MTZ (الخطوة 3.3.3) بين تبادل المحلول دون فقدان اليرقات لأن الحيوانات تسبح بنشاط. في هذه الحالة ، يمكن إضافة غسل (غسلات) مياه النظام بدون PTU لضمان تبادل الحلول بنجاح.

4. صيانة اليرقات بعد الاستئصال الوراثي (6+ أيام بعد الإخصاب)

  1. تحقق من اليرقات وقم بتجديد مياه النظام بدون PTU يوميا حتى القتل الرحيم (الخطوة 5.6) أو العودة إلى مرفق إسكان أسماك الزرد.
  2. راقب نجاح ومدى الاستئصال في الجسم الحي على 2 نقطة في البوصة (7 dpf) باستخدام إضاءة الضوء المنقولة على مجهر ستيريو (الشكل 2).

5. دمج العلاج الدوائي في بروتوكول استئصال ظهارة الظهارة الصباغية لأسماك الزرد

ملاحظة: كما تم إجراؤه سابقا3 ، يتم توضيح المعالجة باستخدام 15 ميكرومتر IWR-1 أو التحكم في مركبة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) المطابق للحجم بدءا من 4 dpf هنا كمثال على تجربة لاختبار RpEGEN. قد تختلف التركيزات والجداول الزمنية باختلاف المركبات الدوائية ويتم تناول التوصيات للتحقق من صحة الاستجابة للجرعة ، ومدة العلاج ، والفحص ، والجوانب الأخرى للتصميم التجريبي لدراسات التلاعب الدوائي في قسم المناقشة. اتبع الخطوتين 6 و7 إذا كان تحليل الصورة مطلوبا.

  1. جمع الأجنة وصيانتها كما هو موضح في الخطوة 2. الأجنة dechorionate على 2 dpf.
  2. قم بفحص يرقات eGFP + على 4 dpf كما هو موضح في الخطوة 3.2. بدلا من أطباق بتري ، ضع يرقات eGFP + في ألواح من 6 آبار بكثافة n ≤ 10 يرقات لكل 6 آبار للعلاج الدوائي. قم بتعيين لوحات منفصلة من 6 آبار لليرقات التي سيتم تحريرها (MTZ-) واليرقات التي سيتم استئصالها (MTZ +).
    ملاحظة: تكون إشارة eGFP مرئية على 4 dpf ولكنها تبدو باهتة من شدة الإشارة على 5 dpf.
  3. قبل معالجة يرقات eGFP+ 4 dpf eGFP+ مع 15 ميكرومتر IWR-1 أو التحكم في مركبة DMSO المتطابقة مع الحجم لمدة 24 ساعة بالضبط قبل الاستئصال الجيني باستخدام محلول MTZ 10 mM.
    ملاحظة: في كثير من الأحيان ، هناك حاجة إلى القليل جدا من المركب لتجارب العلاج الدوائي. لتجنب وزن كميات صغيرة من مسحوق IWR-1 ، يتم شراء هذا المركب الدوائي بالفعل في محلول DMSO ، بتركيز 25 mM ، ويتم اقتباسه إلى أحجام أصغر عند الوصول لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.
    1. تحديد حجم العلاجات الدوائية والتحكم في المركبات اللازمة و aliquot 1.5x PTU في أنابيب مخروطية وفقا لذلك. يوصى باستخدام حجم 5 مل / بئر من لوحة 6 آبار.
    2. أضف مخزون IWR-1 إلى 1.5x PTU للحصول على تركيز نهائي قدره 15 ميكرومتر IWR-1 (على سبيل المثال ، 3 ميكرولتر من 25 mM IWR-1 لكل 5 مل من 1.5x PTU). أضف حجما مطابقا من مخزون DMSO إلى 1.5x PTU (على سبيل المثال ، 3 ميكرولتر ≥ 99.7٪ DMSO لكل 5 مل من 1.5x PTU). هنا ، سيؤدي ذلك في النهاية إلى تركيز نهائي بنسبة 0.06٪ حجم / حجم (٪ v / v) DMSO. تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتؤكد بصريا ذوبان المركبات.
      تحذير: قد يلزم التخلص من DMSO و IWR-1 والمركبات والمذيبات الدوائية الأخرى كنفايات كيميائية اعتمادا على لوائح الدولة والمؤسسة. يوصى بتأكيد مستوى الخطر والطرق المناسبة للتخلص من النفايات لهذه المركبات ، إن وجدت ، قبل الاستخدام.
    3. قم بإزالة 1.5x PTU من يرقات eGFP + في ألواح 6 آبار وأضف 5 مل / بئر من معالجات DMSO v/v الطازجة المصنوعة حديثا بنسبة 0.06٪ أو 15 ميكرومتر IWR-1 من الخطوة 5.3.2.
  4. على 5 dpf ، قم بإلغاء RPE. بالإضافة إلى المعالجة المسبقة لمدة 24 ساعة (الخطوة 5.3) ، ستظل اليرقات مغمورة في العلاجات الدوائية وعلاجات التحكم في المركبات خلال 24 ساعة من الاستئصال الجيني باستخدام 10 mM MTZ وأثناء التعافي بعد الاستئصال ، حتى التثبيت (على سبيل المثال ، من 4-9 dpf).
    1. اصنع محلول MTZ 10 mM قبل 2 ساعة من إجراء الاستئصال الجيني (الخطوة 3.1).
    2. تحديد حجم المعالجات الدوائية ومعالجات التحكم في المركبات اللازمة لكل من الصفائح غير المبطنة (MTZ-) و (MTZ-) ذات 6 آبار و aliquot الكميات المناسبة من مياه النظام العذبة بدون PTU (MTZ-) أو محلول MTZ 10 mM (MTZ +) في أنابيب مخروطية الشكل. سيؤدي ذلك إلى أربعة شروط علاجية: 1) 0.06٪ v / v DMSO ، MTZ-؛ 2) 15 ميكرومتر IWR-1 ، MTZ - ؛ 3) 0.06٪ ضد / v DMSO، MTZ +؛ و 4) 15 ميكرومتر IWR-1 ، MTZ +.
    3. أضف حلول مخزون IWR-1 و DMSO إلى الأنابيب المخروطية ذات الصلة كما تم تنفيذها في الخطوة 5.3.2. تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتؤكد بصريا ذوبان المركبات.
    4. قم بإزالة 0.06٪ v/v DMSO و 15 ميكرومتر IWR-1 من العلاجات في 1.5x PTU (الخطوة 5.3.2) من لوحات 6 آبار (MTZ-) و (MTZ+) المعينة غير الملغومة (MTZ+) وتجديدها باستخدام العلاجات المناسبة التي تم إجراؤها في الخطوة 5.4.3.
    5. قم بإزالة 0.06٪ v / v DMSO و 15 μM IWR-1 في محلول MTZ 10 mM بعد 24 ساعة بالضبط وتجديده بالمعالجات في مياه النظام العذبة بدون PTU. قم بتجديد 0.06٪ v / v DMSO و 15 μM IWR-1 في مياه النظام العذبة بدون PTU على لوحة (لوحات) 6 آبار غير معطلة (MTZ-).
  5. اتبع صيانة اليرقات بعد الاستئصال كما هو موضح في الخطوة 4 وقم بتجديد 0.06٪ v / v DMSO أو 15 μM IWR-1 يوميا في مياه النظام بدون PTU.
  6. القتل الرحيم لليرقات على 9 dpf (4 DPI للأشقاء المعالجين ب MTZ المتطابقين مع العمر) عن طريق غمر الحيوانات في محلول تريكاين 0.3 جم / لتر (جرعة زائدة قاتلة) إلى جانب التبريد السريع (على سبيل المثال ، ضع أطباق بتري على الجليد) لمدة 20 دقيقة على الأقل30. تحقق للتأكد من أن اليرقات لا تستجيب للمس والإصلاح في 4٪ PFA (الخطوة 1.5) لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  7. معالجة الأنسجة اليرقية بعد التثبيت للحصول على صورة z-stack على المجهر البؤري كما هو موضح سابقا 5,31 وهنا في قسم النتائج التمثيلية. وسيتطلب التحليل الوارد في الخطوتين 6 و7، كحد أدنى، الحصول على علامة نووية (مثل DAPI) وصور سطوع فيلد z-stack.

6. المجهر البؤري z-stack الصورة المعالجة المسبقة في فيجي (ImageJ)

  1. استيراد وتنسيق صور المجهر البؤري z-stack باستخدام FIJI32.
    1. افتح صور المجهر باستخدام خيارات استيراد التنسيقات الحيوية التي تم تعيينها لعرض المكدس باستخدام: Hyperstack ووضع اللون: تدرج رمادي.
    2. قم بإنشاء إسقاط أقصى كثافة لصورة المجهر المستوردة عن طريق اختيار صورة | مكدسات | مشروع Z. في نافذة ZProjection، قم بتعيين Start Slice و Stop Slice لتضمين كل الشرائح لتلك الصورة. على سبيل المثال، قم بتعيين شريحة البدء: 1 وشريحة التوقف: 18 لمكدس z يحتوي على إجمالي 18 شريحة. اختر نوع العرض: أقصى كثافة وانقر على موافق.
    3. قم بتحويل ملف الإسقاط الأقصى للكثافة إلى صورة 8 بت (إن لم يكن بالفعل) عن طريق اختيار صورة | النوع | 8 بت.
    4. أعد توجيه الصورة بحيث يكون الجانب الظهري لأعلى ويترك بعيدا (أي العدسة) عن طريق اختيار الصورة | تحويل | اقلب أفقيا (بالنسبة للأمر الأخير، حدد الخيار الذي يناسب الاتجاه المطلوب لتلك الصورة). للحصول على صورة متعددة القنوات ، انقر فوق نعم في مكدس العملية؟ نافذة لإعادة توجيه جميع القنوات.
      ملاحظة: هذه الخطوة بالغة الأهمية، ولكنها ليست ضرورية إذا كانت الصورة موجودة بالفعل في الاتجاه الظهري لأعلى والاتجاه الأيسر البعيد. انظر الشكل 3A-D والشكل 4 للحصول على صور ذات عيون في الاتجاه الصحيح للمعالجة.
    5. احفظ الإسقاط الأقصى للكثافة 8 بت كملف بتنسيق ملف صورة (TIF) باختيار ملف | وفر باسم| تيب....
  2. إنشاء منطقة اهتمام RPE (ROI) باستخدام FIJI.
    1. افتح صورة TIF 8 بت تم إنشاؤها كما هو موضح في الخطوة 6.1. ابدأ تشغيل مدير عائد الاستثمار باختيار تحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار.
    2. استخدام | الصور قم بالتكبير والتبديل بين قنوات DAPI و brightfield لتحديد النقطة (النقاط) التي يكون فيها الجانب القمي من RPE مجاورا لطرف الغشاء المحدد الخارجي (OLM) (الشكل 3B '، B "، D ، D "؛ رؤوس الأسهم الزرقاء). استخدم هذا المعلم التشريحي كنقطة انطلاق لعائد الاستثمار.
    3. قم بإنشاء عائد استثمار RPE باستخدام أداة تحديدات المضلع (في شريط أدوات FIJI) باستخدام كل من قنوات الصور DAPI و brightfield ووظيفة التكبير/التصغير (الصورة | Zoom) لتحديد حدود RPE القمية والقاعدية. اجلب الأطراف الظهرية والبطنية لعائد الاستثمار (أي حيث ينتقل عائد الاستثمار من الجانب القمي إلى الجانب القاعدي من RPE) إلى نقطة حادة بدلا من التثبيط أو التقريب (الشكل 3B '، B "، D ، D "؛ خطوط أرجوانية).
      ملاحظة: يعد إنشاء نهاية عائد استثمار مدببة خطوة حاسمة لتحسين اكتشاف نقطة النهاية باستخدام RpEGEN ويتم تناولها في قسم المناقشة.
    4. أضف عائد الاستثمار بالنقر فوق إضافة في مدير عائد الاستثمار. اضبط عائد الاستثمار حسب الحاجة وانقر على تحديث في مدير عائد الاستثمار.
    5. احفظ ملف عائد الاستثمار باختيار المزيد>> | أنقذ... داخل مدير عائد الاستثمار. استخدم أسماء متطابقة لملفات صور عائد الاستثمار وTIF المتطابقة (على سبيل المثال، [اسم الملف].tif و[اسم الملف].roi).
  3. دمج ملفات TIF وعائد الاستثمار 8 بت لكل شرط في مجلد واحد. على سبيل المثال، سيحتوي المجلد، DMSO_9dpf، على جميع ملفات TIF وعائد الاستثمار المتطابقة لمجموعة اليرقات المعالجة ب 9 dpf unablated (MTZ-) 0.06٪ v/v DMSO.

7. القياس الكمي والتصور لتجديد RPE باستخدام نصوص RpEGEN

  1. تثبيت وإعداد البرامج النصية RpEGEN.
    1. قم بتنزيل أحدث البرامج النصية RpEGEN من مستودع GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) بالنقر فوق Code | تنزيل ملف ZIP.
    2. قم بفك ضغط المجلد ووضعه في موقع مساحة العمل المطلوب (على سبيل المثال، سطح المكتب).
    3. افتح MATLAB.
    4. انتقل إلى مجلد RpEGEN في جزء المجلد الحالي (عادة على الجانب الأيمن).
    5. انقر بزر الماوس الأيمن فوق مجلد RpEGEN واختر إضافة إلى المسار | المجلدات والمجلدات الفرعية المحددة. يؤدي ذلك إلى إضافة المجلد إلى مسار MATLAB حتى يتمكن تلقائيا من العثور على أي برامج نصية في المجلد وتشغيلها.
    6. انقر نقرا مزدوجا فوق المجلد RpEGEN في جزء المجلد الحالي لإظهار كافة المجلدات الفرعية وملفات M.
    7. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف RpEGEN.m لفتحه في جزء المحرر .
    8. ضمن قسم المتغيرات المعرفة من قبل المستخدم من ملف RpEGEN.M، أدخل مواقع الدليل للمجلدات التي تحتوي على ملفات عائد الاستثمار (.ROI) وملفات الصور (.tif) وحيث يجب حفظ ملفات الإخراج. أدخل اسم المجموعة لملف .mat المراد تصديره (على سبيل المثال، DMSO_9dpf DMSO_4dpi وما إلى ذلك) وموقع قناة الحقل الساطع في مكدس صور TIF (على سبيل المثال، 3، إذا كان الحقل الساطع هو القناة الثالثة في مكدس الصور). إذا كان ملف الصورة يحتوي فقط على صورة الحقل الساطع ، فيجب أن يكون هذا مساويا ل 1.
  2. قم بتشغيل البرنامج النصي RpEGEN.m والتحقق من صحة النتائج.
    ملاحظة: يتطلب RpEGEN تنشيط مربع أدوات معالجة الصور وصندوق أدوات تركيب المنحنى وصندوق أدوات الإحصائيات والتعلم الآلي على ترخيص MATLAB للمستخدم من أجل التشغيل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مجموعة أدوات ReadImageJROI33 المتاحة مجانا مطلوبة لاستيراد عائد الاستثمار في فيجي إلى MATLAB؛ ومع ذلك ، يتم توفيره في مجلد RpEGEN جنبا إلى جنب مع ملفات M الوظيفية الأخرى التي لا تتطلب أي تنشيط.
    1. قم بتشغيل البرنامج النصي بالنقر فوق الزر " تشغيل " في قائمة "محرر " في الجزء العلوي من MATLAB.
      ملاحظة: بمجرد بدء التشغيل، ستوفر نافذة الأوامر مخرجات مطولة تشير إلى تقدم البرنامج النصي. بعد حفظ ملف MAT الذي يحتوي على البيانات المستخرجة ، سيظهر شكل من ثلاث لوحات ويتم حفظه كملف PDF في دليل المخرجات لكل صورة يتم تشغيلها. هذه هي أرقام مراقبة الجودة (QC) للتأكد من أن كل شيء قد تم تشغيله بشكل صحيح وتشمل: 1) صورة الحقل الساطع التي تراكبها عائد الاستثمار (الشكل 4A) ؛ 2) عائد الاستثمار مع خط الوسط والمسافة الزاوية المرتبطة بها (درجات) (الشكل 4G) ؛ و 3) عائد الاستثمار مع قيم كثافة متوسط خط الوسط (0-255 ، مقياس ألوان 8 بت) (الشكل 4H). انتظر حتى يتم حفظ ملفات PDF لمراقبة الجودة في مجلد الإخراج ويختفي الشكل الأخير قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
    2. افتح ملفات PDF الفردية المصدرة إلى مجلد المخرجات في أي عارض PDF وتحقق من أن جميع عائد الاستثمار يتطابق مع صور الحقول الساطعة، وأن قيم خط الوسط هي تقريب معقول لمركز عائد الاستثمار، وأن قيم متوسط الكثافة يتم تعبئتها بشكل مناسب بالبيانات (أي ليست كل نفس القيمة عبر خط الوسط بأكمله).
      ملاحظة: يمكن العثور على وصف مفصل وهيكل لكل متغير محفوظ في ملف MAT بواسطة RpEGEN.m في الجدول 1.
  3. قم بتشغيل البرنامج النصي RpEGEN_PermPlot.m.
    ملاحظة: يستخدم البرنامج النصي RpEGEN_PermPlot.m مخرجات RpEGEN.m لإجراء مقارنات إحصائية باستخدام محاكاة تبديل لمتوسطات مجموعتين ويوفر أيضا التعليمات البرمجية لإعادة إنتاج المؤامرات في هذه الورقة باستخدام صندوق أدوات GRAMM34 المتاح مجانا ، والذي تم تضمينه أيضا في مجلد RpEGEN.
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف RpEGEN_PermPlot.m لفتحه في علامة تبويب محرر جديدة.
    2. ضمن القسم 1 - المتغيرات المعرفة من قبل المستخدم في ملف RpEGEN_PermPlot.M، أدخل موقع الدليل لمجلد الإخراج الذي يحتوي على ملفات MAT من تشغيل RpEGEN.M وأدخل كل اسم ملف MAT المراد تحميله (على سبيل المثال، DMSO_4dpi.mat IWR1_4dpi.mat).
    3. قم بتشغيل هذا القسم من البرنامج النصي بالنقر فوق الزر " تشغيل القسم " في قائمة " المحرر" أعلى MATLAB.
    4. في القسم 2، أدخل اسمي المجموعتين للمقارنة الإحصائية في data_A والمتغيرات data_B (هذه هي المجموعات التي سيتم اشتقاق الوسيطات منها باستخدام محاكاة التباديل). في متغير bin_sz ، أدخل عدد الدرجات التي سيتم من خلالها دمج قيم الكثافة المتوسطة لمجموعات البيانات (الافتراضي هو صناديق 1 درجة).
      ملاحظة: يشير متغير reps إلى عدد التباديل التي يجب استخدامها لإنشاء توزيع احتمالي ويمكن تعيينها إلى أي رقم (القيمة الافتراضية هي 20000). بشكل عام ، سيكون عدد أكبر من التكرار أكثر قوة من الناحية الإحصائية ولكنه سيزيد من وقت المعالجة.
    5. قم بتشغيل هذا القسم من البرنامج النصي بالنقر فوق الزر " تشغيل القسم " في قائمة " المحرر" أعلى MATLAB. قد يستغرق هذا القسم بعض الوقت لإكماله استنادا إلى عدد مرات التكرار المحددة ولكنه يوفر تحديثا مستمرا للحالة في نافذة الأوامر.
    6. قم بتشغيل أقسام HEATMAP FIGURE و GROUP RESULTS AND P-VALUES بشكل مستقل باستخدام الزر تشغيل القسم . قم بتحرير متغيرات البيانات في أي أقسام تم التعليق عليها باستخدام "أدخل البيانات هنا". يتم حفظ ملفات PDF الخاصة بهذه الأرقام تلقائيا لكل منها ويمكن تعديلها بسهولة في أي معالجة لاحقة لبرنامج متجه.
      ملاحظة: تكون المؤامرات التي تم إنشاؤها في ملف RpEGEN_PermPlot.m مخصصة ومن المحتمل أن تتطلب تعديلات استنادا إلى احتياجات البيانات والتصور المحددة لكل مستخدم. ومع ذلك ، توفر الأرقام أساسا متينا يمكن تخصيصه بسهولة باستخدام كل من موقعي MATLAB و GRAMM.

النتائج

من المعروف أن تثبيط مسار إشارات Wnt الأساسي يضعف بشكل كبير تجديد RPE لأسماك الزرد باستخدام نموذج الاستئصال الجيني (rpe65a: nfsB-eGFP) ومنهجية التلاعب الدوائي (IWR-1) الموصوفة في البروتوكول3. تم تكرار هذه التجربة هنا للتحقق من صحة طريقة آلية لقياس كمية تجديد RPE لأسماك الزرد بناء على الت?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول منهجية لاستئصال RPE وراثيا ودراسة آليات التنكس والتجديد في أسماك الزرد في عمر اليرقات. كما تم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح في الزرد البالغ3 ولكن مع توصيف أقل شمولا ، وهذا هو السبب في أن اليرقات هي التركيز هنا. تشمل الجوانب الحرجة لهذا الجزء من البروتوكول (الخطو?...

Disclosures

L.L.L. هو المخترع المشارك في براءة الاختراع الأمريكية رقم 9,458,428 ، والتي تصف طريقة سريعة لاشتقاق ظهارة صبغة الشبكية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. هذا لا علاقة له بالمحتوى الموجود هنا. ليس لدى J.M.G. و G.B.F. ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

تم دعم العمل الموصوف هنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (RO1-EY29410 إلى J.M.G ، ومنحة NIH CORE P30-EY08098 إلى قسم طب العيون) ؛ مركز UPMC لزراعة وعلاج المناعة (إلى L.L.L. و J.M.G.) ؛ وكرسي E. Ronald Salvitti في أبحاث طب العيون (إلى J.M.G.). تم تلقي دعم إضافي من زمالة ويغاند في طب العيون (إلى L.L.L) ، ومؤسسة العين والأذن في بيتسبرغ ، ومنحة غير مقيدة من Research to Prevent Blindness ، New York ، NY. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا أماندا بلات على المساعدة التقنية والدكتور هيو هامر وموظفي الألعاب المائية على دعمهم الممتاز لرعاية الحيوانات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-well platesFisher Scientific07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific05-539-13Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing penFisher Scientific50-254-51Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %Fisher ScientificBP231Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)Fisher Scientific3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)LabnetI5110A
Fluorescence stereo microscopeZeissAxio Zoom.V16Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-4Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)Fisher ScientificBP117-100Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)Millipore SigmaM3761Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)Millipore SigmaP7629Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol freeFisher ScientificAA433689MChemical waste, proper disposal required
Petri dishesFisher ScientificFB087571210 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)Millipore SigmaP3813Used to make 10 X PBS stock
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Shaking incubatorBenchmarkH2010Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscopeLeicaS9iOr similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forcepsFine Science Tools91150-20Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shakerScilogexSK-D1807-E
Transfer pipetteMillipore SigmaZ1350033.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tosMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlToolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB supportMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. . Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Hammer, H. S. . Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. . Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. . GitHub - ReadImageJROI Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021)
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181 RpEGEN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved