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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando un modello transgenico di zebrafish. L'adattamento del protocollo per incorporare la modulazione della via di segnalazione utilizzando composti farmacologici è ampiamente dettagliato. È stata sviluppata una piattaforma MATLAB per quantificare la rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione, che viene presentata e discussa.

Abstract

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) risiede nella parte posteriore dell'occhio e svolge funzioni essenziali per mantenere la salute e l'integrità dei tessuti retinici e vascolari adiacenti. Allo stato attuale, la limitata capacità riparativa dell'RPE nei mammiferi, che è limitata a piccole lesioni, ha ostacolato il progresso verso la comprensione dei processi rigenerativi RPE in vivo . Qui, viene fornita una metodologia dettagliata per facilitare lo studio della riparazione RPE in vivo utilizzando il pesce zebra, un modello di vertebrato in grado di una robusta rigenerazione dei tessuti. Questo protocollo descrive un paradigma di lesione transgenico mediato da nitroreduttasi/metronidazolo (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), che si traduce in ablazione dei due terzi centrali dell'RPE dopo 24 ore di trattamento con MTZ, con successivo recupero tissutale. L'attenzione è posta sulle ablazioni RPE nel pesce zebra larvale e sono anche delineati i metodi per testare gli effetti dei composti farmacologici sulla rigenerazione RPE. Viene inoltre discussa la generazione e la convalida di RpEGEN, uno script MATLAB creato per automatizzare la quantificazione della rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione. Oltre ai meccanismi attivi di riparazione RPE, questo protocollo può essere esteso agli studi sulla degenerazione RPE e sulle risposte alle lesioni, nonché sugli effetti del danno RPE sui tessuti retinici e vascolari adiacenti, tra gli altri processi cellulari e molecolari. Questo sistema di zebrafish è promettente nell'identificazione di geni, reti e processi che guidano la rigenerazione RPE e i meccanismi correlati alla malattia RPE, con l'obiettivo a lungo termine di applicare queste conoscenze ai sistemi dei mammiferi e, in definitiva, allo sviluppo terapeutico.

Introduzione

La metodologia qui descritta descrive un protocollo per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando il pesce zebra larvale. L'RPE si estende sulla parte posteriore dell'occhio e risiede tra gli strati stratificati della retina neurale e lo strato di vascolarizzazione che costituisce la coroide. Il supporto trofico, l'assorbimento della luce fototossica e il mantenimento delle proteine del ciclo visivo sono solo alcune delle funzioni critiche che l'RPE svolge che sono essenziali per sostenere la salute e l'integrità di questi tessuti adiacenti1. Il danno all'RPE dei mammiferi è riparabile quando le lesioni sono piccole2; tuttavia, i danni subiti da lesioni più grandi o malattie degenerative progressive sono irreversibili. Nell'uomo, le malattie degenerative RPE (ad esempio, la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e la malattia di Stargardt) portano alla perdita permanente della vista e, con poche opzioni di trattamento disponibili, alla diminuzione della qualità della vita del paziente. La limitata capacità dell'RPE dei mammiferi di auto-ripararsi ha creato una lacuna di conoscenza nel campo dei processi rigenerativi RPE. Data la robusta capacità rigenerativa del pesce zebra in molti tipi di tessuto diversi, questo protocollo è stato sviluppato per stabilire un sistema di vertebrati in vivo per facilitare gli studi sull'RPE intrinsecamente rigenerante e scoprire i meccanismi che guidano tale risposta. Utilizzando il paradigma di ablazione qui delineato, la via di segnalazione Wnt canonica3, la via mTOR4 e le risposte immuno-correlate5 sono state identificate come mediatori critici della rigenerazione RPE, probabilmente con funzioni sovrapposte.

In questo paradigma di ablazione genetica, il pesce zebra Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 esprime il gene6 della nitroreductasi di derivazione batterica (NTR/nfsB) fuso a eGFP sotto il controllo dell'elemento potenziatore RPE, rpe65a7. L'ablazione si ottiene aggiungendo il profarmaco, il metronidazolo (MTZ), al sistema idrico che ospita il pesce zebra. L'attivazione intracellulare di MTZ da parte della nitroreduttasi provoca reticolazione del DNA e apoptosi nelle cellule che esprimono NTR/nfsB 8,9. Questa tecnologia è stata ampiamente utilizzata nel pesce zebra per ablare le cellule della retina 10,11,12,13 e altri tessuti 8. Insieme, questi elementi consentono l'espressione mirata (rpe65a) di una metodologia di ablazione cellulare inducibile (NTR/MTZ)8,9 e di un marcatore fluorescente (eGFP) per la visualizzazione.

Esistono anche altri interessanti modelli in vivo che possono essere utilizzati per studiare il potenziale rigenerativo dell'RPE14. Questi sono ampi e includono la transdifferenziazione RPE-retina post-retinectomia negli anfibi, in cui le cellule RPE perse per ricrescita retinica vengono sostituite15,16; Ripristino RPE post-infortunio nel topo MRL/MpJ "super curativo"17; e stimolazione esogena della proliferazione RPE in un modello di ratto di RPE spontanea e degenerazione retinica18, tra gli altri. Sono stati sviluppati anche modelli in vitro, come le cellule staminali RPE umane adulte (RPESC)19. Questi modelli sono tutti strumenti preziosi che lavorano per scoprire i processi cellulari legati alla rigenerazione RPE (ad esempio, proliferazione, differenziazione, ecc.); tuttavia, il pesce zebra è unico nella sua capacità di riparazione RPE intrinseca post-ablazione.

Mentre la metodologia qui è scritta per concentrarsi sulla comprensione dei meccanismi che guidano la rigenerazione RPE, la linea Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) e questo protocollo di ablazione genetica potrebbero essere utilizzati per studiare altri processi cellulari come l'apoptosi RPE, la degenerazione RPE e l'effetto della lesione RPE sui tessuti retinici e vascolari adiacenti. Il protocollo di ablazione può anche essere modificato per includere la manipolazione farmacologica, che è una comoda strategia preliminare per schermare le vie di segnalazione di interesse. Ad esempio, il blocco della via Wnt canonica utilizzando l'inibitore della risposta Wnt-1 (IWR-1)20, ha dimostrato di compromettere la rigenerazione RPE3. Questo è stato ripetuto qui per guidare gli utenti attraverso un esperimento di manipolazione farmacologica e servire come proof-of-concept per convalidare uno script MATLAB (RpEGEN) creato per quantificare la rigenerazione RPE basata sul recupero della pigmentazione. Come la linea transgenica e il protocollo di ablazione, gli script RpEGEN sono adattabili e potrebbero essere utilizzati per quantificare altri marcatori / processi cellulari all'interno dell'RPE.

Protocollo

Tutte le metodologie qui descritte sono conformi all'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Pittsburgh.

1. Preparazione prima della raccolta degli embrioni di zebrafish

  1. Impostare l'incubatrice embrionale a 28,5°C.
  2. Preparare una soluzione madre 25x dell'inibitore della melanogenesi, N-feniltiourea (PTU)21,22. Questa soluzione madre è scalata da una ricetta comune22 e 1x è pari allo 0,003% di peso per volume (% p/v) (ad esempio, 0,003 g di polvere PTU in 100 mL di solvente liquido).
    1. Per ottenere una grande soluzione madre 25x PTU, aggiungere 0,75 g di polvere PTU a 1 L di acqua deionizzata purificata (di seguito denominata dH2O) e mescolare accuratamente a temperatura ambiente (~ 25 °C) usando una barra di agitazione e una piastra di agitazione. Conservare a 4°C per un massimo di 3 mesi al riparo dalla luce.
      NOTA: è difficile ottenere PTU per andare in soluzione acquosa e può essere necessario mescolare prolungatamente durante la notte.
      ATTENZIONE: la PTU è pericolosa e bisogna fare attenzione a prevenire l'ingestione, l'inalazione e/o il contatto con la pelle o gli occhi. La polvere PTU e tutti i derivati liquidi PTU descritti nel presente documento potrebbero dover essere smaltiti come rifiuti chimici a seconda delle normative statali e istituzionali. Si raccomanda la conferma di adeguati metodi di smaltimento dei rifiuti PTU, se presenti, prima dell'uso.
    2. Per realizzare una soluzione di lavoro PTU 1,5x (di seguito denominata PTU 1,5x), aggiungere 60 mL di soluzione madre PTU 25x a 940 mL di acqua dell'impianto di alloggiamento zebrafish (di seguito denominata acqua di sistema). Sono stati descritti parametri ottimali di qualità dell'acqua per il pesce zebra23 e gli impianti acquatici dovrebbero disporre di procedure standard di monitoraggio dell'acqua. Conservare 1,5x PTU a 28,5°C per 1-2 settimane al riparo dalla luce.
      NOTA: questo protocollo viene eseguito di routine utilizzando le concentrazioni PTU, i solventi e i parametri di stoccaggio descritti nel passaggio 1.2. Per precauzione, gli embrioni / larve devono essere osservati ogni 1-2 giorni mentre sono in PTU per convalidare l'efficacia e confermare la depigmentazione sostenuta. Le condizioni di dissoluzione e/o conservazione devono essere ottimizzate se si sospetta una diminuzione della solubilità/efficacia della PTU.
  3. Preparare una soluzione madre di blu di metilene allo 0,05% p/v, un inibitore della crescita fungina, aggiungendo 0,05 g di polvere di blu di metilene a 100 ml di dH2O. Mescolare accuratamente usando una barra di agitazione e una piastra. Conservare a 4°C.
  4. Preparare pipette per la manipolazione di embrioni / larve (ad esempio, spostare embrioni / larve tra le piastre di Petri, separare le larve durante lo screening di fluorescenza, raccogliere larve eutanasizzate in tubi di microcentrifuga per la fissazione, ecc.) tagliando l'estremità affusolata di una pipetta di vetro Pasteur usando una penna a punta di diamante. Incidere intorno alla circonferenza della pipetta con la penna diamantata e tirare delicatamente o staccare l'estremità per fare una rottura pulita.
    NOTA: La bocca della pipetta deve essere liscia e abbastanza larga da assorbire facilmente un embrione ancora all'interno del corion senza tosatura. Utilizzare una pipetta di trasferimento del disegno della lampadina come alternativa. Le pipette preparate possono anche essere utilizzate per rimuovere il liquido durante i cambi d'acqua (piuttosto che versare) per ridurre al minimo la perdita di embrioni / larve.
  5. Preparare una soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (ad esempio, aggiungere 10 mL di PFA al 16% a 4 mL di PBS 10x e 26 mL di dH2O). Conservare a 4°C per un massimo di 4 settimane al riparo dalla luce.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è una sostanza chimica pericolosa e deve essere maneggiata in una cappa aspirante chimica e smaltita correttamente. Prestare attenzione e indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) per prevenire l'ingestione, l'inalazione e/o il contatto con la pelle o gli occhi.

2. Raccolta e mantenimento degli embrioni di Zebrafish prima dell'ablazione genetica (0-5 giorni dopo la fecondazione)

  1. Mantenere il pesce zebra adulto come descritto in precedenza 3,4,5. Il pomeriggio/sera prima della raccolta degli embrioni, separare il pesce zebra adulto in vasche di riproduzione per la deposizione delle uova.
  2. La mattina seguente (0 giorni dopo la fecondazione (dpf)), raccogliere gli embrioni in piastre di Petri di 10 cm di diametro in acqua di sistema e rimuovere tutte le uova non vitali o non fecondate, che appariranno opache e / o mostreranno citoplasma irregolare e scissione fallita24.
    NOTA: Gli eventi normali di scissione e stadiazione dello sviluppo saranno evidenti negli embrioni sani come descritto25. Le piastre di Petri devono essere mantenute piene per tre quarti (~ 30 ml per una parabola di 10 cm di diametro) per tutto il protocollo.
    1. Aggiungere due gocce di blu di metilene allo 0,05% p/v a ciascuna capsula di Petri, mescolare delicatamente e conservare gli embrioni a 28,5 °C per il resto del protocollo.
  3. Circa 6 ore dopo la fecondazione (hpf)4,5,26, sostituire l'acqua di sistema nelle piastre di Petri embrionali con 1,5x PTU (soluzione di lavoro fatta nella fase 1.2.2) e ricostituire il blu di metilene.
    NOTA: la PTU deve essere aggiunta agli embrioni prima dell'inizio della pigmentazione (cioè prima di 24 hpf)25 poiché i tessuti già pigmentati non si depigmentano con l'aggiunta di PTU21. Va notato, tuttavia, che nelle dimensioni ridotte degli occhi, nei pesci zebra trattati con PTU27,28,29 sono stati riportati riduzioni delle dimensioni degli occhi, deficit oculari e craniofacciali e interruzione di alcune vie di segnalazione (ad esempio, segnalazione tiroidea). La tossicità per lo sviluppo della PTU sembra dipendere dalla concentrazione e dalla tempistica dell'aggiunta di PTU27,29. Come accennato in precedenza per convalidare l'efficacia della PTU (fase 1.2), anche i segni di tossicità della PTU devono essere attentamente monitorati e, se sospettati, la concentrazione di lavoro e/o il tempo di aggiunta della PTU devono essere ottimizzati.
  4. Su 2-3 dpf, embrioni decorionati utilizzando una soluzione di pronasi appena fatta.
    1. Sciogliere la pronasi in 1,5x PTU ad una concentrazione di 2 mg/mL mediante vortice.
      ATTENZIONE: La pronasi è confezionata come polvere molto fine ed è irritante. Adottare misure per evitare l'inalazione e/o il contatto con la pelle, gli occhi, ecc.
    2. Separare gli embrioni nati dagli embrioni non schiusi e trattare la pronasi solo gli embrioni non schiusi.
    3. Sostituire 1,5x PTU con 2 mg/mL di soluzione di pronasi prodotta nel passaggio 2.4.1 e lasciare sugli embrioni non schiusi per 4-5 minuti con agitazione delicata (ad esempio, su un rotatore/agitatore da tavolo o mediante vortice manuale).
    4. Versare la soluzione di pronasi e risciacquare immediatamente con PTU fresco 1,5x. Triturare delicatamente 1,5x PTU risciacquare sugli embrioni con una pipetta di trasferimento a bulbo.
    5. Ripetere un secondo risciacquo PTU 1,5x per scartare tutti i detriti di corione, quindi ricostituire 1,5x PTU per la manutenzione.
      NOTA: gli embrioni possono anche essere decorianiati manualmente usando una pinza a punta fine. In questo caso, i detriti di corione devono essere rimossi e 1,5x PTU reintegrati dopo la decoerniazione manuale.
  5. Monitorare la salute embrionale / larvale e ricostituire 1,5 volte la PTU ogni 1-2 giorni. Gli embrioni/larve sono tenuti in PTU 1,5x fino all'ablazione a 5 dpf.
    NOTA: l'importanza dei passaggi 2.3 e 2.4 è affrontata ulteriormente nella sezione Discussione.

3. Screening delle larve di zebrafish per rpe65a:nfsB-eGFP e ablazione genetica dell'epitelio pigmentato retinico (5-6 giorni dopo la fecondazione)

  1. Preparare una soluzione fresca di metronidazolo (MTZ) da 10 mM su 5 dpf (giorno di ablazione). Questo processo richiede 2 ore per essere completato.
    1. Aggiungere la polvere MTZ all'acqua di sistema senza PTU e mescolare accuratamente agitando vigorosamente (ad esempio, 250 rotazioni al minuto) per 1 ora a 37 °C.
    2. Raffreddare la soluzione MTZ da 10 mM per ulteriori 1 ora a temperatura ambiente su un rotatore/agitatore da tavolo e garantire la completa dissoluzione prima di aggiungere alle piastre di Petri con larve.
      NOTA: Lo screening fluorescente e la separazione delle larve di eGFP+ (fase 3.2) possono essere eseguiti durante le incubazioni a temperatura ambiente e a 37 °C.
      ATTENZIONE: MTZ è pericoloso e bisogna fare attenzione per prevenire l'ingestione, l'inalazione e/o il contatto con la pelle o gli occhi. La polvere MTZ e tutti i derivati liquidi descritti nel presente documento potrebbero dover essere smaltiti come rifiuti chimici a seconda delle normative statali e istituzionali. Si raccomanda la conferma dei metodi di smaltimento dei rifiuti MTZ corretti, se presenti, prima dell'uso.
  2. Schermare le larve di zebrafish per il transgene rpe65a:nfsB-eGFP.
    1. Anestetizzare le larve con 0,168 g/L di tricaina (MS-222) e separare le larve transgeniche (eGFP+) (Figura 1) dalle larve non transgeniche (eGFP-) utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza con laser/filtro di eccitazione a 488 nm.
      NOTA: La tricaina deve essere aggiunta a 1,5x PTU e/o soluzioni farmacologiche composte poiché le larve devono rimanere immerse nel trattamento durante lo screening per eGFP. Incubare le larve in tricaina solo per la durata dello screening (ad esempio, ≤10 minuti per una singola capsula di Petri di 10 cm contenente 50 larve).
    2. Wake le larve schermate immediatamente pipettando direttamente in una capsula di Petri con PTU fresco 1,5x senza tricaina.
    3. Al termine dello screening, separare ulteriormente le larve di eGFP+ in due gruppi di piastre di Petri: un gruppo per ricevere il trattamento MTZ (ablato / MTZ +) e un gruppo per essere il controllo non blato (MTZ-).
  3. Ablare l'epitelio pigmentato retinico.
    1. Rimuovere 1,5x PTU dalle piastre di controllo non bloped (MTZ-) e aggiungere acqua fresca di sistema senza PTU.
    2. Rimuovere 1,5x PTU dalle piastre di trattamento ablate (MTZ+) e aggiungere la soluzione MTZ da 10 mM appena prodotta (fase 3.1.).
    3. Rimuovere la soluzione MTZ da 10 mM dopo esattamente 24 ore (designato 1 giorno dopo l'infortunio (dpi)) e aggiungere acqua di sistema fresca senza PTU. Sostituire l'acqua fresca del sistema senza PTU sulle piastre MTZ. Le larve non saranno nuovamente esposte alla PTU per il resto del protocollo.
      NOTA: potrebbe essere difficile pipettare o versare tutte le PTU 1,5x (passaggi 3.3.1 e 3.3.2) o 10 mM MTZ (fase 3.3.3) tra gli scambi di soluzione senza perdita larvale mentre gli animali nuotano attivamente. In questo caso, è possibile aggiungere lavaggi di acqua di sistema senza PTU per garantire un corretto scambio di soluzioni.

4. Mantenimento larvale post-ablazione genetica (6+ giorni dopo la fecondazione)

  1. Controllare le larve e reintegrare l'acqua del sistema senza PTU ogni giorno fino all'eutanasia (passaggio 5.6) o tornare alla struttura di stabulazione del pesce zebra.
  2. Monitorare il successo e l'entità dell'ablazione in vivo a 2 dpi (7 dpf) utilizzando l'illuminazione a luce trasmessa su uno stereomicroscopio (Figura 2).

5. Incorporare il trattamento farmacologico nel protocollo di ablazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

NOTA: Come eseguito in precedenza3, il trattamento con IWR-1 da 15 μM o controllo del veicolo con dimetilsolfossido (DMSO) a partire da 4 dpf è descritto qui come esperimento di esempio per testare RpEGEN. Le concentrazioni e le tempistiche possono variare con i diversi composti farmacologici e le raccomandazioni per la convalida dose-risposta, la durata del trattamento, lo screening e altri aspetti della progettazione sperimentale per gli studi di manipolazione farmacologica sono affrontate nella sezione Discussione. Seguire i passaggi 6 e 7 se è necessaria l'analisi delle immagini.

  1. Raccogliere e mantenere gli embrioni come descritto nella fase 2. Embrioni decionati su 2 dpf.
  2. Schermare le larve di eGFP+ su 4 dpf come descritto al punto 3.2. Piuttosto che le piastre di Petri, posizionare le larve di eGFP + in piastre a 6 pozzetti ad una densità di n ≤ 10 larve per 6 pozzetti per il trattamento farmacologico. Designare piastre separate a 6 pozzetti per le larve che non saranno compresse (MTZ-) e le larve che saranno ablate (MTZ+).
    NOTA: il segnale eGFP è visibile su 4 dpf ma appare dimmer rispetto all'intensità del segnale su 5 dpf.
  3. Pretrattare 4 larve di eGFP+ dpf con 15 μM IWR-1 o controllo del veicolo DMSO in volume per esattamente 24 ore prima dell'ablazione genetica con soluzione MTZ da 10 mM.
    NOTA: Spesso, molto poco composto è necessario per gli esperimenti di trattamento farmacologico. Per evitare di pesare piccole quantità di polvere di IWR-1, questo composto farmacologico viene acquistato già in soluzione DMSO, ad una concentrazione di 25 mM, e aliquotato in volumi più piccoli all'arrivo per evitare ripetuti cicli di congelamento-disgelo.
    1. Determinare il volume dei trattamenti farmacologici e di controllo del veicolo necessari e aliquotare 1,5x PTU in tubi conici di conseguenza. Si consiglia un volume di 5 ml/pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
    2. Aggiungere lo stock IWR-1 a 1,5x PTU per una concentrazione finale di 15 μM IWR-1 (ad esempio, 3 μL di 25 mM IWR-1 per 5 mL di 1,5x PTU). Aggiungere un volume corrispondente di stock DMSO a 1,5x PTU (ad esempio, 3 μL ≥ 99,7% DMSO per 5 mL di 1,5x PTU). Qui, questo finirà per produrre una concentrazione finale dello 0,06% volume / volume (% v / v) DMSO. Mescolare bene vorticosamente e confermare visivamente la dissoluzione dei composti.
      ATTENZIONE: DMSO, IWR-1 e altri composti farmacologici e solventi potrebbero dover essere smaltiti come rifiuti chimici a seconda delle normative statali e istituzionali. Prima dell'uso si raccomanda la conferma del livello di pericolo e dei metodi adeguati di smaltimento dei rifiuti per questi composti, se presenti.
    3. Rimuovere 1,5x PTU dalle larve eGFP+ in piastre a 6 pozzetti e aggiungere 5 mL/pozzetti di DMSO appena fatto 0,06% v/v o 15 μM IWR-1 trattamenti dal passo 5.3.2.
  4. Su 5 dpf, ablare l'RPE. Oltre al pretrattamento di 24 ore (fase 5.3), le larve rimarranno immerse in trattamenti farmacologici e di controllo del veicolo durante 24 ore di ablazione genetica con MTZ 10 mM e durante il recupero post-ablazione, fino alla fissazione (ad esempio, da 4-9 dpf).
    1. Effettuare 10 mM di soluzione MTZ 2 ore prima di eseguire l'ablazione genetica (fase 3.1).
    2. Determinare il volume dei trattamenti farmacologici e di controllo del veicolo necessari per piastre a 6 pozzetti sia non ablate (MTZ-) che ablate (MTZ+) e aliquote volumi appropriati di acqua dolce di sistema senza PTU (MTZ-) o soluzione MTZ da 10 mM (MTZ+) in tubi conici. Ciò produrrà quattro condizioni di trattamento: 1) 0,06% v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06% v/v DMSO, MTZ+; e 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Aggiungere le soluzioni stock IWR-1 e DMSO ai rispettivi tubi conici come eseguito nel passaggio 5.3.2. Mescolare bene vorticosamente e confermare visivamente la dissoluzione dei composti.
    4. Rimuovere i trattamenti 0,06% v/v DMSO e 15 μM IWR-1 in 1,5x PTU (fase 5.3.2) dalle piastre designate non blated (MTZ-) e ablate (MTZ+) a 6 pozzetti e reintegrare con i trattamenti appropriati effettuati nel passaggio 5.4.3.
    5. Rimuovere i trattamenti DMSO 0,06% v/v e IWR-1 da 15 μM in soluzione MTZ da 10 mM dopo esattamente 24 ore e reintegrare con trattamenti in acqua dolce di sistema senza PTU. Reintegrare i trattamenti DMSO 0,06% v/v e IWR-1 da 15 μM in acqua dolce di sistema senza PTU sulle piastre a 6 pozzetti non compresse (MTZ-).
  5. Seguire il mantenimento larvale post-ablazione come indicato nella fase 4 e reintegrare quotidianamente i trattamenti 0,06% v/v DMSO o 15 μM IWR-1 in acqua di sistema senza PTU.
  6. Eutanasia delle larve su 9 dpf (4 dpi per i fratelli trattati con MTZ abbinati all'età) immergendo gli animali in soluzione di tricaina da 0,3 g / L (sovradosaggio letale) accoppiato con un rapido raffreddamento (ad esempio, posizionare le piastre di Petri sul ghiaccio) per almeno 20 minutie 30. Verificare che le larve non rispondano al tocco e fissare il 4% di PFA (fase 1.5) per 3 ore a temperatura ambiente o a 4 °C durante la notte.
  7. Elaborare il tessuto larvale post-fissazione per l'acquisizione di immagini z-stack su un microscopio confocale come descritto in precedenza 5,31 e qui nella sezione Risultati rappresentativi. L'analisi nei passaggi 6 e 7 richiederà, come minimo, l'acquisizione di marcatori nucleari (ad esempio, DAPI) e immagini z-stack a campo luminoso.

6. Pre-elaborazione dell'immagine z-stack del microscopio confocale in FIJI (ImageJ)

  1. Importa e formatta le immagini z-stack del microscopio confocale utilizzando FIJI32.
    1. Apri le immagini del microscopio utilizzando le opzioni di importazione dei bioformati impostate su Visualizza stack con: Hyperstack e modalità Colore: Scala di grigi.
    2. Generare una proiezione di massima intensità dell'immagine del microscopio importata scegliendo Immagine | Stack | Progetto Z. Nella finestra ZProjection , impostate Avvia sezione e Interrompi sezione per includere tutte le sezioni per l'immagine. Ad esempio, impostare Start Slice: 1 e Stop Slice: 18 per uno z-stack con un totale di 18 slice. Scegliete Tipo di proiezione: Intensità massima e fate clic su OK.
    3. Convertire il file di proiezione di intensità massima in un'immagine a 8 bit (se non già) scegliendo Immagine | Tipo | 8 bit.
    4. Riorientare l'immagine in modo che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto e distale (cioè l'obiettivo) venga lasciato scegliendo Immagine | Trasforma | Capovolgi orizzontalmente (per l'ultimo comando, scegli l'opzione più adatta alla direzionalità necessaria per quell'immagine). Per un'immagine multicanale, fare clic su Sì nello stack di processo? per riorientare tutti i canali.
      NOTA: questo passaggio è fondamentale, ma non necessario se l'immagine è già nell'orientamento sinistro dorsale verso l'alto e distale. Vedere la Figura 3A-D e la Figura 4 per le immagini con gli occhi nella direzionalità corretta per l'elaborazione.
    5. Salvare la proiezione a intensità massima a 8 bit come file TIF (Tagged Image File Format) scegliendo File | Salva con nome | Tiff....
  2. Generare la regione di interesse RPE (ROI) utilizzando FIJI.
    1. Aprire un'immagine TIF a 8 bit generata come descritto nel passaggio 6.1. Avvia il ROI Manager scegliendo Analizza | Strumenti | ROI Manager.
    2. Usa | immagine Zoom e commutazione tra i canali DAPI e brightfield per identificare il punto o i punti in cui il lato apicale dell'RPE è adiacente alla punta della membrana limitante esterna (OLM) (Figura 3B', B", D', D"; punte di freccia blu). Usa questo punto di riferimento anatomico come punto di partenza del ROI.
    3. Creare il ROI RPE con lo strumento Selezioni poligonali (nella barra degli strumenti FIJI) utilizzando sia i canali immagine DAPI che brightfield e la funzione zoom (Image | Zoom) per identificare i confini APICALI e BASALI DELL'RPE. Portare le estremità dorsale e ventrale del ROI (cioè, dove il ROI passa dal lato apicale a quello basale dell'RPE) a un punto acuto piuttosto che smussare o arrotondare (Figura 3B', B", D', D"; linee magenta).
      NOTA: la creazione di un roi finale mirato è un passaggio fondamentale per ottimizzare il rilevamento degli endpoint utilizzando RpEGEN ed è affrontato nella sezione Discussione.
    4. Aggiungi il ROI facendo clic su Aggiungi in ROI Manager. Regola il ROI secondo necessità e fai clic su Aggiorna nel ROI Manager.
    5. Salva il file ROI scegliendo Altro>> | Salvare... all'interno del ROI Manager. Utilizzare nomi identici per i file di immagine ROI e TIF corrispondenti (ad esempio, [nome file].tif e [nome file].roi).
  3. Combina file TIF e ROI a 8 bit per ogni condizione in un'unica cartella. Ad esempio, la cartella, DMSO_9dpf, conterrà tutti i file TIF e ROI corrispondenti per il gruppo larvale trattato DMSO da 9 dpf non blated (MTZ-) 0,06% v/v.

7. Quantificazione e visualizzazione della rigenerazione RPE utilizzando script RpEGEN

  1. Installare e preparare gli script RpEGEN.
    1. Scarica gli script RpEGEN più recenti dal repository GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) facendo clic su Code | Scarica ZIP.
    2. Decomprimere la cartella e posizionarla nella posizione dell'area di lavoro desiderata (ad esempio, Desktop).
    3. Apri MATLAB.
    4. Passare alla cartella RpEGEN nel riquadro Cartella corrente (in genere sul lato sinistro).
    5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella RpEGEN e scegliere Aggiungi al percorso | Cartelle e sottocartelle selezionate. Questo aggiunge la cartella al percorso MATLAB in modo che possa trovare ed eseguire automaticamente tutti gli script nella cartella.
    6. Fare doppio clic sulla cartella RpEGEN nel riquadro Cartella corrente per visualizzare tutte le sottocartelle e i file M.
    7. Fare doppio clic sul file RpEGEN.m da aprire nel riquadro Editor .
    8. Nella sezione VARIABILI DEFINITE DALL'UTENTE del file RpEGEN.m, immettere i percorsi di directory per le cartelle contenenti i file ROI (con estensione roi), i file di immagine (.tif) e dove salvare i file di output. Immettere il nome del gruppo per il file .mat da esportare (ad esempio, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, ecc.) e la posizione del canale brightfield nello stack di immagini TIF (ad esempio, 3, se brightfield è il terzo canale in uno stack di immagini). Se il file di immagine contiene solo l'immagine brightfield, questo dovrebbe essere uguale a 1.
  2. Eseguire lo script RpEGEN.m e convalidare i risultati.
    NOTA: RpEGEN richiede che Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox e Statistics and Machine Learning Toolbox vengano attivati sulla licenza MATLAB utente per poter essere eseguiti. Inoltre, il readImageJROI toolbox33 disponibile gratuitamente è necessario per importare i ROI FIJI in MATLAB; tuttavia, viene fornito nella cartella RpEGEN insieme ad altri file di funzione M che non richiedono alcuna attivazione.
    1. Esegui lo script facendo clic sul pulsante Esegui nel menu Editor nella parte superiore di MATLAB.
      NOTA: una volta avviato, la finestra di comando fornirà un output dettagliato che indica la progressione dello script. Dopo aver salvato il file MAT contenente i dati estratti, verrà visualizzata una figura a tre pannelli che verrà salvata come PDF nella directory di output per ogni esecuzione dell'immagine. Si tratta di cifre di controllo qualità (QC) per assicurarsi che tutto sia stato eseguito correttamente e includono: 1) l'immagine brightfield sovrapposta dal ROI (Figura 4A); 2) il ROI con asse di mezzeria e distanza angolare associata (gradi) (Figura 4G); e 3) il ROI con i valori di intensità mediana della linea mediana (0-255, scala di colori a 8 bit) (Figura 4H). Attendere che i PDF QC siano stati salvati nella cartella di output e l'ultima figura sia scomparsa prima di procedere al passaggio successivo.
    2. Aprire i singoli PDF esportati nella cartella di output in qualsiasi visualizzatore PDF e verificare che tutti i ROI corrispondano alle immagini brightfield, che i valori di mezzeria siano approssimazioni ragionevoli del centro dei ROI e che i valori di intensità mediana siano adeguatamente popolati con dati (cioè non tutti lo stesso valore su tutta la linea di mezzeria).
      NOTA: una descrizione dettagliata e la struttura di ogni variabile salvata nel file MAT da RpEGEN.m è disponibile nella Tabella 1.
  3. Eseguire lo script RpEGEN_PermPlot.m.
    NOTA: lo script RpEGEN_PermPlot.m utilizza l'output di RpEGEN.m per eseguire confronti statistici utilizzando una simulazione di permutazione delle mediane di due gruppi e fornisce anche il codice per la riproduzione dei grafici in questo documento utilizzando il toolbox GRAMM34 disponibile gratuitamente, che è stato anche incluso nella cartella RpEGEN.
    1. Fare doppio clic sul file RpEGEN_PermPlot.m da aprire in una nuova scheda Editor .
    2. Nella SEZIONE 1 - VARIABILI DEFINITE DALL'UTENTE nel file RpEGEN_PermPlot.m, immettere il percorso della directory per la cartella di output contenente i file MAT dall'esecuzione di RpEGEN.m e immettere ogni nome di file MAT da caricare (ad esempio, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Esegui questa sezione dello script facendo clic sul pulsante Esegui sezione nel menu Editor nella parte superiore di MATLAB.
    4. Nella Sezione 2, inserisci i nomi dei due gruppi per il confronto statistico nel data_A e data_B variabili (questi sono i gruppi da cui verranno derivate le mediane usando la simulazione di permutazione). Nella variabile bin_sz , immettere il numero di gradi su cui integrare i valori di intensità mediana per i set di dati (il valore predefinito è 1-degree bins).
      NOTA: la variabile reps indica il numero di permutazioni da utilizzare per creare una distribuzione di probabilità e può essere impostata su qualsiasi numero (il valore predefinito è 20.000). In generale, un numero maggiore di ripetizioni sarà statisticamente più robusto, ma aumenterà il tempo di elaborazione.
    5. Esegui questa sezione dello script facendo clic sul pulsante Esegui sezione nel menu Editor nella parte superiore di MATLAB. Il completamento di questa sezione potrebbe richiedere del tempo a seconda del numero di ripetizioni specificate, ma fornisce un aggiornamento continuo dello stato nella finestra di comando.
    6. Eseguire le sezioni HEATMAP FIGURE e GROUP RESULTS AND P-VALUES in modo indipendente utilizzando il pulsante Esegui sezione . Modifica le variabili di dati in tutte le sezioni commentate con "INSERISCI DATI QUI". I PDF di queste figure vengono salvati automaticamente per ciascuno e possono essere facilmente modificati in qualsiasi post-elaborazione di software vettoriale.
      NOTA: i grafici generati nel file RpEGEN_PermPlot.m sono ad hoc e probabilmente richiederanno modifiche in base alle specifiche esigenze di visualizzazione e dati di ciascun utente. Tuttavia, le cifre forniscono una solida base che può essere facilmente individuata utilizzando sia i siti Web MATLAB che GRAMM.

Risultati

È noto che l'inibizione della via di segnalazione canonica Wnt compromette significativamente la rigenerazione RPE del pesce zebra utilizzando il paradigma di ablazione genetica (rpe65a:nfsB-eGFP) e la metodologia di manipolazione farmacologica (IWR-1) descritti nel protocollo3. Questo esperimento è stato ripetuto qui per convalidare un metodo automatizzato per quantificare la rigenerazione RPE del pesce zebra basato sulla pigmentazione. I risultati riassunti di seguito comprendevano tu...

Discussione

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'RPE e studiare i meccanismi di degenerazione e rigenerazione nel pesce zebra di età larvale. Questo protocollo è stato eseguito con successo anche nel pesce zebra adulto3 ma con una caratterizzazione meno estesa, motivo per cui le larve sono al centro dell'attenzione. Gli aspetti critici di questa parte del protocollo (fasi 1-4) includono: 1) aggiunta di 1,5x PTU agli embrioni prima dell'inizio della melanogenesi, 2) decorionaz...

Divulgazioni

L.L.L. è il co-inventore del brevetto statunitense n. 9.458.428, che descrive un metodo accelerato per derivare l'epitelio pigmentato retinico da cellule staminali pluripotenti umane; questo non è correlato al contenuto del presente documento. J.M.G. e G.B.F. non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Il lavoro qui descritto è stato supportato dal National Institutes of Health (RO1-EY29410 a J.M.G e NIH CORE Grant P30-EY08098 al Dipartimento di Oftalmologia); il Centro Immunotrapianto e Terapia UPMC (a L.L.L. e J.M.G.); e la Cattedra E. Ronald Salvitti in Ricerca Oftalmologica (a J.M.G.). Un ulteriore sostegno è stato ricevuto dalla Wiegand Fellowship in Ophthalmology (a L.L.L), dalla Eye & Ear Foundation di Pittsburgh e da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, New York, NY. Gli autori desiderano anche ringraziare Amanda Platt per l'assistenza tecnica e il Dr. Hugh Hammer e lo staff acquatico per l'eccellente supporto alla cura degli animali.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-well platesFisher Scientific07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific05-539-13Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing penFisher Scientific50-254-51Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %Fisher ScientificBP231Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)Fisher Scientific3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)LabnetI5110A
Fluorescence stereo microscopeZeissAxio Zoom.V16Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-4Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)Fisher ScientificBP117-100Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)Millipore SigmaM3761Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)Millipore SigmaP7629Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol freeFisher ScientificAA433689MChemical waste, proper disposal required
Petri dishesFisher ScientificFB087571210 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)Millipore SigmaP3813Used to make 10 X PBS stock
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Shaking incubatorBenchmarkH2010Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscopeLeicaS9iOr similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forcepsFine Science Tools91150-20Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shakerScilogexSK-D1807-E
Transfer pipetteMillipore SigmaZ1350033.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tosMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlToolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB supportMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

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