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要約

このプロトコルは、トランスジェニックゼブラフィッシュモデルを用いて網膜色素上皮(RPE)を遺伝的にアブレーションする方法論を記載している。薬理学的化合物を用いたシグナル伝達経路調節を組み込むようにプロトコルを適応させることは、広範囲に詳述されている。色素沈着に基づいてRPE再生を定量化するためのMATLABプラットフォームが開発され、提示され、議論される。

要約

網膜色素上皮(RPE)は、眼の後ろに存在し、隣接する網膜および血管組織の健康と完全性を維持するために不可欠な機能を果たす。現在、哺乳類RPEの修復能力は小さく、小さな傷害に限定されているため、 in vivoRPE 再生プロセスの理解が進んでいません。ここでは、堅牢な組織再生が可能な脊椎動物モデルであるゼブラフィッシュを利用した in vivo RPE修復の研究を容易にするために詳細な方法論が提供される。このプロトコルは、トランスジェニックニトロレダクターゼ/メトロニダゾール(NTR/MTZ)媒介性傷害パラダイム(rpe65a:nfsB-eGFP)を記述しており、MTZによる24時間治療後にRPEの中央3分の2がアブレーションされ、その後の組織が回復する。ゼブラフィッシュの幼虫におけるRPEアブレーションに焦点が当てられ、RPE再生に対する薬理学的化合物の効果をテストするための方法も概説されている。色素沈着に基づくRPE再生の定量化を自動化するために作成されたMATLABスクリプトであるRpEGENの生成と検証についても説明します。能動的RPE修復機構を超えて、このプロトコルは、RPE変性および傷害応答の研究、ならびに隣接する網膜および血管組織に対するRPE損傷の影響、とりわけ他の細胞および分子プロセスの研究に拡張することができる。このゼブラフィッシュシステムは、RPE再生およびRPE疾患関連メカニズムを駆動する遺伝子、ネットワーク、およびプロセスの同定において大きな可能性を秘めており、この知識を哺乳類系に適用し、最終的には治療開発に応用するという長期的な目標を掲げています。

概要

本明細書に記載の方法論は、ゼブラフィッシュの幼虫を利用して網膜色素上皮(RPE)を遺伝的にアブレーションするためのプロトコールを詳述する。RPEは眼の後ろに延び、神経網膜の層状層と脈絡膜を構成する血管系の層の間に存在する。栄養サポート、光毒性光の吸収、および視覚サイクルタンパク質の維持は、RPEが果たす重要な機能の一部に過ぎず、これらの隣接組織の健康および完全性を維持するために不可欠である1。哺乳類RPEへの損傷は、病変が小さい場合に回復可能である2;しかし、より大きな傷害または進行性変性疾患によって被る損傷は不可逆的である。ヒトでは、RPE変性疾患(加齢黄斑変性症(AMD)やスターガルト病など)は、永久的な視力喪失をもたらし、利用可能な治療選択肢がほとんどなく、患者の生活の質を低下させる。哺乳類のRPEが自己修復する能力が限られているため、RPE再生プロセスの分野で知識のギャップが生じています。多くの異なる組織タイプにわたるゼブラフィッシュの堅牢な再生能力を考慮して、このプロトコルは、本質的に再生RPEに関する研究を容易にし、その応答を駆動するメカニズムを明らかにするために 、in vivo 脊椎動物システムを確立するために開発されました。ここで概説したアブレーションパラダイムを用いて、標準的なWntシグナル伝達経路3、mTOR経路4、および免疫関連応答5 が、RPE再生の重要なメディエーターとして同定され、重複する機能を有する可能性が高い。

この遺伝子アブレーションパラダイムにおいて、Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3ゼブラフィッシュは、RPEエンハンサーエレメントrpe65a7の制御下でeGFPに融合した細菌由来ニトロレダクターゼ(NTR/nfsB)遺伝子6を発現する。アブレーションは、プロドラッグであるメトロニダゾール(MTZ)をゼブラフィッシュを収容する系水に添加することによって達成される。ニトロレダクターゼによるMTZの細胞内活性化は、NTR/nfsB発現細胞においてDNA架橋およびアポトーシスをもたらす8,9。この技術は、網膜10、11、12、13および他の組織8の細胞をアブレーションするためにゼブラフィッシュにおいて広く使用されている。これらの要素を組み合わせることで、誘導性細胞アブレーション法(NTR/MTZ)8,9の標的発現(rpe65a)と蛍光マーカー(eGFP)を可視化することができます。

RPE14の再生可能性を研究するために使用できる他の興味深いインビボモデルも存在する。これらは広範であり、両生類における網膜切除術後のRPEから網膜への分化転換を含み、網膜再増殖によって失われたRPE細胞が置き換えられる15,16;「スーパーヒーリング」MRL/MpJマウスにおける損傷後のRPE回復17;とりわけ、自発的RPEおよび網膜変性のラットモデルにおけるRPE増殖の外因性刺激18が挙げられる。成体ヒトRPE幹細胞(RPESC)19などのインビトロモデルも開発されている。これらのモデルはすべて、RPE再生に関連する細胞プロセス(例えば、増殖、分化など)を明らかにするのに役立つ貴重なツールです。しかし、ゼブラフィッシュは、アブレーション後の固有のRPE修復能力においてユニークです。

ここでの方法論はRPE再生を駆動するメカニズムの理解に焦点を当てるために書かれていますが、 Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) ラインとこの遺伝子アブレーションプロトコルは、RPEアポトーシス、RPE変性、および隣接する網膜および血管組織に対するRPE損傷の影響などの他の細胞プロセスを研究するために利用することができます。アブレーションプロトコルはまた、薬理学的操作を含むように改変することもでき、これは、目的のシグナル伝達経路をスクリーニングするための便利な予備的戦略である。例えば、Wnt応答−1の阻害剤(IWR−1)20を用いて標準的なWnt経路を遮断することは、RPE再生3を損なうことが示されている。これは、薬理学的操作実験を通してユーザーを導き、色素沈着の回復に基づいてRPE再生を定量化するために作成されたMATLABスクリプト(RpEGEN)を検証するための概念実証として機能するためにここで繰り返されました。トランスジェニックラインおよびアブレーションプロトコルと同様に、RpEGENスクリプトは適応性があり、RPE内の他のマーカー/細胞プロセスを定量するために使用できます。

プロトコル

ここに概説されているすべての方法論は、ピッツバーグ大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)に準拠しています。

1. ゼブラフィッシュ胚採取前の準備

  1. 胚培養器を28.5°Cに設定します。
  2. メラニン生成阻害剤であるN-フェニルチオ尿素(PTU)21,22の25倍の原液を調製する。この原液は、一般的なレシピ22からスケーリングされ、1xは、体積当たり0.003%重量(%w / v)に等しい(例えば、0.003gのPTU粉末を100mLの液体溶媒に入れる)。
    1. 大きな25xPTU原液を作るには、精製脱イオン水1LにPTU粉末0.75g(以下、dH2Oと記す)を加え、攪拌子と攪拌板を用いて室温(~25°C)で十分に混合する。光から保護され、最大3ヶ月間4°Cで保管してください。
      注:PTUを水溶液に入れることは困難であり、一晩の長時間の攪拌が必要な場合があります。
      注意: PTUは危険であり、摂取、吸入、および/または皮膚や目との接触を防ぐために注意する必要があります。PTU粉末および本明細書に記載されるすべてのPTU液体誘導体は、州および機関の規制に応じて化学廃棄物として処分される必要があるかもしれない。PTU廃棄物処理方法がある場合は、使用前に適切な方法を確認することをお勧めします。
    2. 1.5x PTU作業液(以下、1.5x PTU)を作るには、ゼブラフィッシュ収容施設用水940mL(以下、システム水)に25x PTU原液60mLを加えます。ゼブラフィッシュの最適な水質パラメータは23 で説明されており、水生施設には標準的な水監視手順が整備されている必要があります。1.5x PTUを28.5°Cで1〜2週間光から保護して保管してください。
      メモ: このプロトコルは、ステップ 1.2 で説明した PTU 濃度、溶媒、および保存パラメータを使用して日常的に実行されます。予防措置として、PTUにいる間、胚/幼虫を1〜2日ごとに観察して、有効性を検証し、持続的な色素沈着を確認する必要があります。溶解および/または保存条件は、PTU溶解度/有効性の低下が疑われる場合、最適化されるべきである。
  3. dH2O100mLにメチレンブルー粉末0.05gを加えて、真菌増殖抑制剤であるメチレンブルー0.05%w/vの原液を調製し、攪拌子及び攪拌板を用いて十分に混合する。4°Cで保存してください。
  4. ダイヤモンドチップスクライブペンを使用してガラスパスツールピペットのテーパーエンドを切断して、胚/幼虫操作(例えば、ペトリ皿間で胚/幼虫を移動する、蛍光スクリーニング中に幼虫を分離する、固定のために安楽死させた幼虫を微量遠心チューブに集めるなど)用のピペットを準備します。ダイヤモンドペンでピペットの周囲をエッチングし、端を軽く引っ張るかカチッと音を立ててきれいに壊します。
    注:ピペットの口は、剪断することなく絨毛膜の内側にある胚を簡単に取り込むのに十分なほど滑らかで広くなければなりません。代替として電球ドロー転送ピペットを使用してください。調製されたピペットは、胚/幼虫の損失を最小限に抑えるために、水交換中に(注ぐのではなく)液体を除去するためにも使用できます。
  5. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製する(例えば、10mLの16%PFAを4mLの10x PBSおよび26mLのdH2Oに加える)。4°Cで最大4週間、光から保護して保管してください。
    警告: パラホルムアルデヒドは危険な化学物質であり、化学ヒュームフード内で取り扱い、適切に廃棄してください。摂取、吸入、および/または皮膚や目との接触を防ぐために、注意を払い、個人用保護具(PPE)を着用する必要があります。

2.遺伝子切除前のゼブラフィッシュ胚の収集と維持(受精後0〜5日)

  1. 前述のように成体のゼブラフィッシュを維持する 3,4,5.胚収集の前の午後/夕方、成体のゼブラフィッシュを繁殖タンクに分けて産卵させます。
  2. 翌朝(受精後0日(dpf))、胚をシステム水中の直径10cmのペトリ皿に集め、不透明に見える、および/または不規則な細胞質および切断の失敗を示す生存不能または未受精卵をすべて除去する24。
    注:正常な切断および発生ステージング事象は、25に記載されるように健康な胚において明らかであろう。ペトリ皿は、プロトコル全体を通して4分の3(直径10cmの皿の場合は〜30mL)をいっぱいに保たなければなりません。
    1. 各ペトリ皿に0.05%w/vメチレンブルーを2滴加え、穏やかに混ぜ合わせ、残りのプロトコルで胚を28.5°Cで保存します。
  3. 受精後約6時間(hpf)4,5,26で、胚ペトリ皿のシステム水を1.5x PTU(ステップ1.2.2で作られた作業溶液)で置き換え、メチレンブルーを補充する。
    注:PTU 21の添加時に既に色素沈着した組織は脱色素化しないため、色素沈着の開始前(すなわち、24馬力前)25にPTUを胚に添加しなければならない。しかしながら、眼の大きさの減少、眼および頭蓋顔面の欠損、およびいくつかのシグナル伝達経路の破壊(例えば、甲状腺シグナル伝達)がPTU処置ゼブラフィッシュにおいて報告されていることに留意すべきである27、28、29。PTUの発生毒性は、PTU添加の濃度およびタイミングに依存するようである27、29。PTUの有効性を検証するために上で述べたように(ステップ1.2)、PTU毒性の徴候も注意深く監視し、疑わしい場合は、PTU添加の作業濃度および/または時間を最適化する必要があります。
  4. 2〜3dpf上で、新たに作製されたプロナーゼ溶液を用いて胚を脱絨毛する。
    1. ボルテックス処理により、プロナーゼを1.5x PTUに2mg/mLの濃度で溶解させる。
      警告: プロナーゼは非常に微粉末として包装されており、刺激物です。吸入や皮膚、目などとの接触を避けるための対策を講じる。
    2. 孵化した胚を孵化していない胚から分離し、孵化していない胚のみをプロナーゼ処理する。
    3. 1.5x PTUをステップ2.4.1で作成した2mg/mLのプロナーゼ溶液と交換し、孵化していない胚の上に穏やかな攪拌(例えば、卓上回転子/振とう機上または手動旋回)で4〜5分間放置する。
    4. プロナーゼ溶液を注ぎ、すぐに新鮮な1.5x PTUですすいでください。1.5倍のPTUを穏やかに粉砕し、球根引き転写ピペットで胚をすすいでください。
    5. 2回目の1.5x PTUリンスを繰り返してすべての絨毛膜破片を捨て、メンテナンスのために1.5x PTUを補充します。
      注:胚は、先端の細かい鉗子を使用して手動で絨毛を切除することもできます。この場合、絨毛膜の破片を除去し、手動の絨毛除去後に1.5倍のPTUを補充する必要があります。
  5. 胚/幼虫の健康状態を監視し、1〜2日ごとに1.5倍のPTUを補充する。胚/幼虫は、5dpfでアブレーションされるまで1.5倍のPTUに保持される。
    注: ステップ 2.3 および 2.4 の重要性については、「ディスカッション」セクションで詳しく説明します。

3. ゼブラフィッシュ幼虫の rpe65a:nfsB-eGFPのスクリーニングと網膜色素上皮の遺伝子切除(受精後5~6日)

  1. 新鮮な10mMメトロニダゾール(MTZ)溶液を5dpf(アブレーションの日)で作る。このプロセスは完了するまでに2時間かかります。
    1. PTUを含まないシステム水にMTZ粉末を加え、37°Cで1時間激しく振とう(例えば、毎分250回転)することによって十分に混合する。
    2. 卓上回転子/シェーカー上で10mM MTZ溶液を室温でさらに1時間冷却し、幼虫でペトリ皿に加える前に完全な溶解を確実にする。
      注:eGFP+ 幼虫の蛍光スクリーニングおよび分離(ステップ3.2)は、37°Cおよび室温のインキュベーション中に行うことができる。
      警告: MTZ は危険であり、摂取、吸入、および/または皮膚や目との接触を防ぐように注意する必要があります。MTZ粉末および本明細書に記載されるすべての液体誘導体は、州および機関の規制に応じて化学廃棄物として処分する必要があるかもしれない。MTZ廃棄物処理方法がある場合は、使用前に確認することをお勧めします。
  2. ゼブラフィッシュの幼虫を rpe65a:nfsB-eGFP導入遺伝子用にスクリーニングする。
    1. 0.168 g/Lのトリカイン(MS-222)で幼虫を麻酔し、488nm励起レーザー/フィルターを備えた蛍光実体顕微鏡を用いて、トランスジェニック(eGFP+)幼虫(図1)を非トランスジェニック(eGFP−)幼虫から分離する。
      注:幼虫はeGFPのスクリーニング中も治療に没頭したままにしておく必要があるため、トリカインを1.5x PTUおよび/または薬理学的化合物溶液に添加する必要があります。スクリーニングの期間中のみ、幼虫をトリカイン中で孵化させる(例えば、50匹の幼虫を含む単一の10cmペトリ皿に対して≤10分間)。
    2. スクリーニングされた幼虫を、トリカインを含まない新鮮な1.5倍のPTUを含むペトリ皿に直接ピペッティングすることによって直ちに起こす。
    3. スクリーニングが完了したら、eGFP+幼虫をさらに2つのペトリ皿のグループに分ける:MTZ処置を受ける1つのグループ(アブレーション/MTZ+)およびアブレーションなし(MTZ−)対照である1つのグループ。
  3. 網膜色素上皮をアブレーションする。
    1. アブレーションされていない(MTZ-)コントロールディッシュから1.5倍のPTUを取り出し、PTUなしで新鮮なシステム水を追加します。
    2. アブレーション(MTZ +)処理皿から1.5倍のPTUを取り出し、作りたての10mM MTZ溶液を加えます(ステップ3.1)。
    3. 10 mM MTZ 溶液をちょうど 24 時間後 (傷害後 1 日(dpi)と指定)で除去し、PTU なしで淡いシステム水を追加します。MTZ- 皿のPTUなしで新鮮なシステム水を交換してください。幼虫は、プロトコルの残りの部分で再びPTUに曝露されることはない。
      注:動物が活発に泳いでいるので、幼虫の損失なしに溶液交換の間にすべての1.5x PTU(ステップ3.3.1および3.3.2)または10mM MTZ(ステップ3.3.3)をピペットまたは注ぎ取ることは難しいかもしれません。この場合、PTUを使用しないシステム水の洗浄を追加して、溶液交換を成功させることができます。

4.遺伝的アブレーション後の幼虫維持(受精後6日以上)

  1. 幼虫をチェックし、安楽死(ステップ5.6)までPTUなしで毎日システム水を補充するか、ゼブラフィッシュの飼育施設に戻ります。
  2. 実体顕微鏡上の透過光照明を用いて、2dpi( 7dpf)上のインビボでの アブレーションの成功と程度をモニターする(図2)。

5. ゼブラフィッシュ網膜色素上皮アブレーションプロトコールへの薬理学的治療の組み込み

注:以前に行ったように、3、15μM IWR-1または4dpfから始まる体積整合ジメチルスルホキシド(DMSO)ビヒクルコントロールによる処理は、RpEGENを試験するための実験例として概説されています。濃度およびタイムラインは薬理学的化合物によって異なる場合があり、用量反応検証、治療期間、スクリーニング、および薬理学的操作研究のための実験計画の他の側面に関する推奨事項については、ディスカッションセクションで説明します。画像解析が必要な場合は、手順 6 と 7 に従います。

  1. ステップ2で説明したように胚を収集して維持する。2 dpf上のデコリオネート胚。
  2. ステップ3.2で説明されているように、4 dpfでeGFP+ 幼虫をスクリーニングする。ペトリ皿ではなく、薬理学的治療のために、eGFP+ 幼虫を6ウェルあたりn≤10幼虫の密度で6ウェルプレートに入れる。アブレーションされない幼虫(MTZ−)とアブレーションされる幼虫(MTZ+)のための別々の6ウェルプレートを指定する。
    メモ: eGFP 信号は 4 dpf で見ることができますが、5 dpf の信号強度よりも暗く見えます。
  3. 4 dpf eGFP+ 幼虫を 15 μM IWR-1 または容積適合 DMSO ビヒクルコントロールで 10 mM MTZ 溶液で遺伝子アブレーションする前に正確に 24 時間前処理します。
    注:多くの場合、薬理学的治療実験にはほとんど化合物は必要ありません。少量のIWR-1粉末の計量を避けるために、この薬理学的化合物は、DMSO溶液中で25mMの濃度で既に購入され、到着時により少ない容量に小分けされ、凍結融解サイクルの繰り返しを避ける。
    1. 必要な薬理学的およびビヒクル制御治療の量を決定し、それに応じて1.5倍のPTUを円錐形チューブにアリコートします。6ウェルプレートの容量が5mL/ウェルです。
    2. IWR-1ストックを1.5x PTUに加え、最終濃度15 μM IWR-1(例えば、1.5x PTUの5 mLあたり3 μLの25 mM IWR-1)にする。一致した量のDMSOストックを1.5x PTUに加える(例えば、1.5x PTUの5mLあたり3μL≥99.7%DMSOを含む)。ここで、これは0.06%の体積/体積(% v/v)DMSOの最終濃度をもたらすことになる。ボルテックス処理によりよく混合し、化合物の溶解を目視で確認する。
      注意:DMSO、IWR-1、およびその他の薬理学的化合物および溶媒は、州および機関の規制によっては、化学廃棄物として処分する必要がある場合があります。これらの化合物の危険レベルと適切な廃棄物処理方法(もしあれば)を、使用前に確認することをお勧めします。
    3. 6ウェルプレートのeGFP+ 幼虫から1.5x PTUを除去し、ステップ5.3.2から新たに作製した0.06% v/v DMSOまたは15μM IWR-1処理を5mL/ウェル加える。
  4. 5 dpf で、RPE をアブレーションします。24時間前処理(ステップ5.3)に加えて、幼虫は、10mM MTZによる24時間の遺伝子アブレーションの間およびアブレーション後の回収中、固定まで(例えば、4〜9dpfから)薬理学的およびビヒクルコントロール治療に浸漬されたままである。
    1. 遺伝子アブレーションを行う2時間前に10mM MTZ溶液を作る(ステップ3.1)。
    2. 非アブレーション(MTZ-)およびアブレーション(MTZ+)6ウェルプレートの両方に必要な薬理学的およびビヒクルコントロール治療の量を決定し、PTU(MTZ-)または10mM MTZ溶液(MTZ+)を含まない淡水のいずれかの適切な容量を円錐形チューブにアリコートします。これにより、4つの処理条件が得られます:1)0.06%v / v DMSO、MTZ - ;2) 15μM IWR-1, MTZ-;3) 0.06% v/v DMSO, MTZ+;4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. IWR-1 および DMSO ストック溶液を、ステップ 5.3.2 で実行したように、それぞれの円錐管に追加します。ボルテックス処理によりよく混合し、化合物の溶解を目視で確認する。
    4. 指定された非アブレーション(MTZ-)およびアブレーション(MTZ+)6ウェルプレートから、1.5x PTU(ステップ5.3.2)の0.06%v/v DMSOおよび15μM IWR-1処理を除去し、ステップ5.4.3で行った適切な処理を補充します。
    5. 10 mM MTZ 溶液中の 0.06% v/v DMSO および 15 μM IWR-1 処理を 24 時間後に除去し、PTU を含まない淡水で処理を補充します。0.06% v/v DMSOおよび15 μM IWR-1処理を、アブレーションされていない(MTZ-)6ウェルプレート上のPTUを含まない淡水に補充します。
  5. ステップ4で概説したアブレーション後の幼虫維持に従い、PTUを含まないシステム水に毎日0.06% v/v DMSOまたは15μM IWR-1処理を補充します。
  6. 動物を0.3 g/Lのトリカイン溶液(致死的な過剰摂取)に浸し、急速冷却(例えば 、ペトリ皿を氷の上に置く)を少なくとも20分間30分間行うことによって、9dpf(年齢が一致したMTZ処理兄弟の場合は4dpi)で幼虫を安楽死させる。幼虫が触って触ることに反応しないことを確認し、室温または4°Cで一晩3時間(ステップ1.5)固定する。
  7. zスタック画像取得のための固定後幼虫組織を、前述のように共焦点顕微鏡上で処理する5、31 およびここの代表結果のセクションで説明した。ステップ6および7の分析では、少なくとも核マーカー(DAPIなど)および明視野zスタック画像の取得が必要となる。

6. フィジーにおける共焦点顕微鏡zスタック画像前処理(ImageJ)

  1. FIJI32を使用して共焦点顕微鏡zスタック画像をインポートしてフォーマットします。
    1. [ バイオフォーマットのインポートオプション ]で[スタックの表示方法]に設定された[ ハイパースタック ]および[ カラーモード:グレースケール]を使用して顕微鏡画像を開きます。
    2. 「画像」を選択して、インポートした顕微鏡画像の最大強度投影を生成|スタック|Z プロジェクト。「ZProjection」ウィンドウで、「スライスの開始」と「スライスの停止」を設定して、そのイメージのすべてのスライスを含めます。たとえば、合計 18 個のスライスを持つ Z スタックに対して、「スライスの開始: 1」と「スライスの停止: 18」を設定します。投影タイプ:最大強度を選択し、[OK]をクリックします。
    3. 「画像」を選択して、最大強度投影ファイルを 8 ビット画像(まだ変換していない場合) |タイプ |8 ビット。
    4. [画像]を選択して、背側が上向きで遠位(つまり、レンズ)が残るように画像の向き を変え|変換|「水平方向に反転」( 最後のコマンドでは、その画像に必要な方向性に最も適したオプションを選択します)。マルチチャンネル画像の場合は、プロセススタックで [はい ]をクリックします か? ウィンドウは、すべてのチャンネルの向きを変更します。
      注: この手順は重要ですが、画像が既に背側上、遠位左向きになっている場合は不要です。処理のために正しい方向にある目を持つ画像については、図3A-Dおよび図4を参照してください。
    5. 「ファイル」を選択して、8 ビットの最大強度投影をタグ付き画像ファイル形式 (TIF) ファイルとして保存 ||として保存ティフ...。
  2. FIJIを使用してRPE関心領域(ROI)を生成します。
    1. 手順 6.1 の説明に従って生成された 8 ビットの TIF イメージを開きます。ROI マネージャを起動して、[ |の分析] を選択します。ツールの|ROI マネージャー。
    2. 画像|を使用するDAPI チャンネルと明視野チャンネルをズームおよび切り替えて、RPE の頂端側が外側制限膜 (OLM) の先端に隣接する点を特定します (図 3B'、B"、D'、D"、青い矢印)。この解剖学的ランドマークをROIの出発点として使用します。
    3. DAPIと明視野の両方の画像チャンネルとズーム機能を使用して、ポリゴン選択ツール(FIJIツールバー内)でRPE ROIを作成します(画像|ズーム)を使用して、頂端と基底RPEの境界を特定します。ROIの背側端と腹側端(すなわち、ROIがRPEの頂端から基底側に移行する場所)を、鈍くしたり丸めたりするのではなく、鋭い点に持っていきます(図3B'、B"、D'、D";マゼンタ線)。
      注: ポイントされた ROI エンドの作成は、RpEGEN を使用してエンドポイント検出を最適化するための重要な手順であり、「ディスカッション」セクションで説明します。
    4. ROI マネージャの [ 追加 ] をクリックして、ROI を追加します。必要に応じてROIを調整し、ROIマネージャの[ 更新 ]をクリックします。
    5. [その他] を選択して ROI ファイルを保存 >> |セーブ。。。 ROIマネージャ内。一致した ROI イメージ ファイルと TIF イメージ ファイル ([ファイル名].tif と [ファイル名].roi など) には同じ名前を使用します。
  3. 各条件の 8 ビット TIF ファイルと ROI ファイルを 1 つのフォルダーに結合します。たとえば、 DMSO_9dpfのフォルダには、9 dpf unablated (MTZ-) 0.06% v/v DMSO 処理幼虫群の一致した TIF ファイルと ROI ファイルがすべて含まれます。

7. RpEGENスクリプトを用いたRPE再生の定量化と可視化

  1. RpEGEN スクリプトをインストールして準備します。
    1. GitHubリポジトリ(https://github.com/burchfisher/RpEGEN)から最新のRpEGENスクリプトをダウンロードするには、[コード|]をクリックします。 ZIPをダウンロードしてください。
    2. フォルダを解凍し、目的のワークスペースの場所(デスクトップなど)に配置します。
    3. MATLAB を開きます。
    4. [現在のフォルダ]ペイン(通常は左側)で RpEGENフォルダ に移動します。
    5. RpEGENフォルダを右クリックし、[パスに追加]|選択します。選択したフォルダとサブフォルダ。これにより、フォルダーが MATLAB パスに追加され、フォルダー内のスクリプトを自動的に検索して実行できるようになります。
    6. [現在のフォルダ]ペインで RpEGEN フォルダをダブルクリックすると、すべてのサブ フォルダ とM個のファイルが表示されます。
    7. RpEGEN.mファイルをダブルクリックして、[エディタ]ペインで開きます。
    8. RpEGEN.m ファイルの [ユーザー定義変数 ] セクションで、ROI ファイル (.ROI)、イメージ ファイル (.tif)、および出力ファイルの保存場所を含むフォルダーのディレクトリの場所を入力します。エクスポートする .mat ファイルのグループ名 (DMSO_9dpf、DMSO_4dpiなど) と、TIF イメージスタック内の明視野チャンネルの位置 (たとえば、ブライトフィールドが画像スタックの 3 番目のチャンネルの場合は 3) を入力します。画像ファイルに明視野画像のみが含まれている場合は、1 に等しくなければなりません。
  2. RpEGEN.m スクリプトを実行し、結果を検証します。
    メモ: RpEGEN を実行するには、画像処理ツールボックス、カーブフィッティングツールボックス、および統計および機械学習ツールボックスをユーザー MATLAB ライセンスでアクティブ化する必要があります。さらに、FIJI ROIをMATLAB にインポートするには、無料で利用可能なReadImageJROIツールボックス33が必要です。ただし、RpEGEN フォルダには、アクティブ化を必要としない他の関数 M ファイルと共に用意されています。
    1. MATLAB の上部にある [エディター] メニューの [実行] ボタンをクリックしてスクリプトを実行します。
      注: 開始されると、 コマンド ウィンドウにスクリプトの進行状況を示す詳細な出力が表示されます。抽出されたデータを含むMATファイルを保存すると、3パネルの図が表示され、各画像実行の出力ディレクトリにPDFとして保存されます。これらは、すべてが適切に実行されていることを確認するための品質管理(QC)の数値であり、1)ROIによってオーバーレイされた明視野画像(図4A)が含まれます。2)中心線および関連する角度距離(度)を有するROI(図4G)。3)中心線中央値強度値(0〜255、8ビットカラースケール)を有するROIを有する(図4H)。QC PDFが出力フォルダに保存され、最後の図が消えるまで待ってから、次の手順に進みます。
    2. 出力フォルダに書き出された個々のPDFを任意のPDFビューアで開き、すべてのROIが明視野画像と一致すること、中心線値がROIの中心の妥当な近似値であること、および中央値強度値にデータが適切に設定されていることを確認します(つまり、中心線全体ですべて同じ値ではない)。
      メモ: RpEGEN.m によって MAT ファイルに保存された各変数の詳細な説明と構造については、 表 1 を参照してください。
  3. RpEGEN_PermPlot.m スクリプトを実行します。
    注: RpEGEN_PermPlot.m スクリプトは、RpEGEN.m の出力を使用して、2 つのグループの中央値の順列シミュレーションを使用して統計的比較を実行し、また、RpEGEN フォルダーに含まれている、無料で入手できる GRAMM ツールボックス34 を使用して、このホワイト ペーパーのプロットを再現するためのコードも提供します。
    1. RpEGEN_PermPlot.mファイルをダブルクリックして、新しいエディタタブで開きます。
    2. セクション 1 - RpEGEN_PermPlot.m ファイルの ユーザー定義変数 で、RpEGEN.m を実行してから MAT ファイルを含む出力フォルダーのディレクトリの場所を入力し、ロードする各 MAT ファイル名 (DMSO_4dpi.mat、IWR1_4dpi.mat など) を入力します。
    3. スクリプトのこのセクションを実行するには、MATLAB の上部にある [エディター] メニューの [セクションの実行] ボタンをクリックします。
    4. セクション2で、統計的比較のために2つのグループの名前をdata_A変数とdata_B変数に入力します(これらは順列シミュレーションを使用して中央値が導出されるグループです)。bin_sz 変数に、データセットの強度の中央値を積分する度数を入力します (デフォルトは 1 度のビンです)。
      メモ: reps 変数は、確率分布の構築に使用する順列の数を示し、任意の数に設定できます (デフォルト値は 20,000)。一般に、繰り返し回数が多いほど統計的に堅牢になりますが、処理時間は長くなります。
    5. スクリプトのこのセクションを実行するには、MATLAB の上部にある [エディター] メニューの [セクションの実行] ボタンをクリックします。このセクションは、指定された繰り返しの数によっては完了するまでに時間がかかる場合がありますが、コマンド ウィンドウで継続的に状態を更新します。
    6. ヒート マップ図 セクションと グループ結果セクションとP値 セクションを個別に実行し、[ セクションの実行] ボタンを使用します。「ここにデータを入力」とコメントされたセクションのデータ変数を編集します。これらの図のPDFは、それぞれについて自動的に保存され、任意のベクトルソフトウェアの後処理で簡単に変更することができます。
      注: RpEGEN_PermPlot.m ファイルで生成されるプロットは アドホック であり、各ユーザーの特定のデータと視覚化のニーズに基づいて変更が必要になる可能性があります。しかし、この数字は、MATLABとGRAMMの両方のWebサイトを使用して簡単に個別化できる強固な基盤を提供します。

結果

標準的なWntシグナル伝達経路を阻害することは、プロトコル3に記載されている遺伝子アブレーションパラダイム(rpe65a:nfsB-eGFP)および薬理学的操作方法論(IWR-1)を用いたゼブラフィッシュRPE再生を著しく損なうことが知られている。色素沈着に基づいてゼブラフィッシュRPE再生を定量するための自動化された方法を検証するために、この実験をここで繰り返した。以下?...

ディスカッション

このプロトコルは、RPEを遺伝的にアブレーションし、幼虫齢ゼブラフィッシュの変性と再生のメカニズムを研究するための方法論を説明しています。このプロトコルは、成虫のゼブラフィッシュ3でも首尾よく実行されていますが、それほど広範な特性評価が行われていないため、幼虫がここで焦点を当てています。プロトコルのこの部分(ステップ1〜4)の重要な側面には、1)...

開示事項

L.L.L.は、ヒト多能性幹細胞から網膜色素上皮を誘導するための迅速な方法を記載した米国特許第9,458,428号の共同発明者である。これは、ここの内容とは無関係です。J.M.G.およびG.B.F.は開示するものは何もありません。

謝辞

本明細書に記載された研究は、国立衛生研究所(RO1-EY29410からJ.M.G.へ、およびNIH CORE Grant P30-EY08098から眼科へ)によって支援された。UPMC Immune Transplant & Therapy Center(L.L.L.およびJ.M.G.へ)E. Ronald Salvitti Chair in Ophthalmology Research(J.M.G.へ)。Wiegand Fellowship in Ophthalmology(L.へ)、ピッツバーグのEye & Ear Foundation、およびNew York, NYのResearch to Prevent Blindnessから無制限の助成金が受けられました。著者らはまた、技術支援のアマンダ・プラットと、優れた動物ケアサポートのためのヒュー・ハマー博士と水生生物スタッフに感謝したい。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-well platesFisher Scientific07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific05-539-13Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing penFisher Scientific50-254-51Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %Fisher ScientificBP231Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)Fisher Scientific3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)LabnetI5110A
Fluorescence stereo microscopeZeissAxio Zoom.V16Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-4Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)Fisher ScientificBP117-100Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)Millipore SigmaM3761Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)Millipore SigmaP7629Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol freeFisher ScientificAA433689MChemical waste, proper disposal required
Petri dishesFisher ScientificFB087571210 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)Millipore SigmaP3813Used to make 10 X PBS stock
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Shaking incubatorBenchmarkH2010Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscopeLeicaS9iOr similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forcepsFine Science Tools91150-20Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shakerScilogexSK-D1807-E
Transfer pipetteMillipore SigmaZ1350033.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tosMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlToolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB supportMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

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