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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung eines transgenen Zebrafischmodells. Die Anpassung des Protokolls an die Modulation des Signalwegs unter Verwendung pharmakologischer Verbindungen ist ausführlich beschrieben. Eine MATLAB-Plattform zur Quantifizierung der RPE-Regeneration auf Basis von Pigmentierung wurde entwickelt und wird vorgestellt und diskutiert.

Zusammenfassung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) befindet sich im hinteren Teil des Auges und erfüllt Funktionen, die für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und Integrität benachbarter Netzhaut- und Gefäßgewebe unerlässlich sind. Gegenwärtig hat die begrenzte Reparationskapazität von RPE für Säugetiere, die auf kleine Verletzungen beschränkt ist, Fortschritte beim Verständnis der regenerativen Prozesse von RPE in vivo behindert. Hier wird eine detaillierte Methodik bereitgestellt, um die Untersuchung der In-vivo-RPE-Reparatur unter Verwendung des Zebrafisches zu erleichtern, einem Wirbeltiermodell, das in der Lage ist, eine robuste Geweberegeneration durchzuführen. Dieses Protokoll beschreibt ein transgenes Nitroreduktase/Metronidazol (NTR/MTZ)-vermitteltes Verletzungsparadigma (rpe65a:nfsB-eGFP), das nach 24-stündiger Behandlung mit MTZ zu einer Ablation der zentralen zwei Drittel der RPE mit anschließender Gewebewiederherstellung führt. Der Schwerpunkt liegt auf RPE-Ablationen in Larvenzebrafischen und es werden auch Methoden zur Prüfung der Auswirkungen pharmakologischer Verbindungen auf die RPE-Regeneration beschrieben. Die Generierung und Validierung von RpEGEN, einem MATLAB-Skript, das zur Automatisierung der Quantifizierung der RPE-Regeneration auf der Grundlage der Pigmentierung erstellt wurde, wird ebenfalls diskutiert. Über aktive RPE-Reparaturmechanismen hinaus kann dieses Protokoll auf Studien zu RPE-Degenerations- und Verletzungsreaktionen sowie zu den Auswirkungen von RPE-Schäden auf benachbarte Netzhaut- und Gefäßgewebe sowie auf andere zelluläre und molekulare Prozesse ausgeweitet werden. Dieses Zebrafischsystem ist vielversprechend bei der Identifizierung von Genen, Netzwerken und Prozessen, die die RPE-Regeneration und RPE-Krankheitsmechanismen vorantreiben, mit dem langfristigen Ziel, dieses Wissen auf Säugetiersysteme und letztendlich auf die therapeutische Entwicklung anzuwenden.

Einleitung

Die hierin beschriebene Methodik beschreibt ein Protokoll zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung von Larvenzebrafischen. Die RPE erstreckt sich über den Augenhintergrund und befindet sich zwischen den geschichteten Schichten der neuronalen Netzhaut und der Gefäßschicht, aus der die Aderhaut besteht. Trophische Unterstützung, Absorption von phototoxischem Licht und Aufrechterhaltung von Proteinen des visuellen Zyklus sind nur einige der kritischen Funktionen, die das RPE ausübt, die für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und Integrität dieser benachbarten Gewebe unerlässlichsind 1. Schäden an der RPE von Säugetieren sind reparierbar, wenn die Läsionen klein sind2; Schäden, die durch größere Verletzungen oder fortschreitende degenerative Erkrankungen erlitten werden, sind jedoch irreversibel. Beim Menschen führen degenerative RPE-Erkrankungen (z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und Stargardt-Krankheit) zu einem dauerhaften Sehverlust und, da nur wenige Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen, zu einer verminderten Lebensqualität der Patienten. Die begrenzte Fähigkeit von Säugetier-RPE, sich selbst zu reparieren, hat eine Wissenslücke im Bereich der regenerativen RPE-Prozesse geschaffen. Angesichts der robusten Regenerationsfähigkeit des Zebrafisches über viele verschiedene Gewebetypen hinweg wurde dieses Protokoll entwickelt, um ein In-vivo-Wirbeltiersystem zu etablieren, um Studien zur intrinsischen Regeneration von RPE zu erleichtern und Mechanismen aufzudecken, die diese Reaktion antreiben. Unter Verwendung des hier beschriebenen Ablationsparadigmas wurden der kanonische Wnt-Signalweg3, der mTOR-Signalweg4 und die immunbezogenen Reaktionen5 als kritische Mediatoren der RPE-Regeneration identifiziert, wahrscheinlich mit überlappenden Funktionen.

In diesem genetischen Ablationsparadigma exprimieren Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3-Zebrafische das bakteriell abgeleitete Nitroreduktase-Gen (NTR/nfsB)6, das unter Kontrolle des RPE-Enhancer-Elements rpe65a7 mit eGFP verschmolzen ist. Die Ablation wird durch Zugabe des Prodrugs, Metronidazol (MTZ), zu Systemwasser erreicht, das Zebrafische beherbergt. Die intrazelluläre Aktivierung von MTZ durch Nitroreduktase führt zu DNA-Vernetzung und Apoptose in NTR/nfsB-exprimierenden Zellen 8,9. Diese Technologie wurde häufig in Zebrafischen verwendet, um Zellen der Netzhaut10,11,12,13 und anderer Gewebe8 abzutragen. Zusammen ermöglichen diese Elemente die gezielte Expression (rpe65a) einer induzierbaren Zellablationsmethodik (NTR/MTZ)8,9 und eines fluoreszierenden Markers (eGFP) zur Visualisierung.

Es gibt auch andere interessante In-vivo-Modelle, mit denen das regenerative Potenzial des RPE14 untersucht werden kann. Diese sind breit gefächert und umfassen die RPE-zu-Retina-Transdifferenzierung nach der Retinektomie bei Amphibien, bei der RPE-Zellen, die durch das Nachwachsen der Netzhaut verloren gehen,ersetzt werden 15,16; RPE-Wiederherstellung nach der Verletzung in der "super heilenden" MRL/MpJ-Maus17; und exogene Stimulation der RPE-Proliferation in einem Rattenmodell von spontaner RPE und Netzhautdegeneration18, unter anderem. In-vitro-Modelle wie adulte humane RPE-Stammzellen (RPESCs)19 wurden ebenfalls entwickelt. Diese Modelle sind allesamt wertvolle Werkzeuge, um die zellulären Prozesse im Zusammenhang mit der RPE-Regeneration aufzudecken (z. B. Proliferation, Differenzierung usw.); Der Zebrafisch ist jedoch einzigartig in seiner Fähigkeit zur intrinsischen RPE-Reparatur nach der Ablation.

Während die Methodik hier geschrieben wurde, um sich auf das Verständnis der Mechanismen zu konzentrieren, die die RPE-Regeneration antreiben, könnten die Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) -Linie und dieses genetische Ablationsprotokoll verwendet werden, um andere zelluläre Prozesse wie RPE-Apoptose, RPE-Degeneration und die Auswirkungen von RPE-Verletzungen auf benachbarte Netzhaut- und Gefäßgewebe zu untersuchen. Das Ablationsprotokoll kann auch modifiziert werden, um pharmakologische Manipulation einzubeziehen, was eine bequeme Vorstrategie zum Screening von Signalwegen von Interesse ist. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Blockierung des kanonischen Wnt-Signalwegs mit Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 die RPE-Regenerationbeeinträchtigt 3. Dies wurde hier wiederholt, um Benutzer durch ein pharmakologisches Manipulationsexperiment zu führen und als Proof-of-Concept zu dienen, um ein MATLAB-Skript (RpEGEN) zu validieren, das zur Quantifizierung der RPE-Regeneration basierend auf der Wiederherstellung der Pigmentierung erstellt wurde. Wie das transgene Linien- und Ablationsprotokoll sind die RpEGEN-Skripte anpassungsfähig und könnten verwendet werden, um andere Marker / zelluläre Prozesse innerhalb der RPE zu quantifizieren.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden entsprechen dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pittsburgh.

1. Vorbereitung vor der Entnahme von Zebrafischembryonen

  1. Stellen Sie den Embryo-Inkubator auf 28,5 ° C ein.
  2. Es wird eine 25-fache Stammlösung des Melanogenesehemmers N-Phenylthioharnstoff (PTU)21,22 hergestellt. Diese Stammlösung wird nach einem gängigen Rezeptskaliert 22 und 1x entspricht 0,003% Gewicht pro Volumen (% w / v) (z. B. 0,003 g PTU-Pulver in 100 ml flüssiges Lösungsmittel).
    1. Um eine große 25-fache PTU-Stammlösung herzustellen, fügen Sie 0,75 g PTU-Pulver zu 1 L gereinigtem entionisiertem Wasser (im Folgenden als dH2O bezeichnet) hinzu und mischen Sie gründlich bei Raumtemperatur (~ 25 ° C) mit einem Rührstab und einer Rührplatte. Bis zu 3 Monate lichtgeschützt bei 4°C lagern.
      HINWEIS: Es ist schwierig, PTU in wässrige Lösung zu bringen, und ein längeres Rühren über Nacht kann erforderlich sein.
      VORSICHT: PTU ist gefährlich und es sollte darauf geachtet werden, dass die Einnahme, das Einatmen und / oder der Kontakt mit der Haut oder den Augen verhindert wird. PTU-Pulver und alle hierin beschriebenen flüssigen PTU-Derivate müssen je nach staatlichen und institutionellen Vorschriften möglicherweise als chemischer Abfall entsorgt werden. Eine Bestätigung der ordnungsgemäßen PTU-Abfallentsorgungsmethoden, falls vorhanden, wird vor der Verwendung empfohlen.
    2. Um eine 1,5-fache PTU-Arbeitslösung (im Folgenden als 1,5-fache PTU bezeichnet) herzustellen, fügen Sie 60 ml 25-fache PTU-Stammlösung zu 940 ml Wasser der Zebrafisch-Haltungseinrichtung hinzu (im Folgenden als Systemwasser bezeichnet). Optimale Wasserqualitätsparameter für Zebrafische wurden beschrieben23 und Aquaristikeinrichtungen sollten über Standard-Wasserüberwachungsverfahren verfügen. 1,5x PTU bei 28,5°C für 1-2 Wochen lichtgeschützt lagern.
      HINWEIS: Dieses Protokoll wird routinemäßig unter Verwendung der in Schritt 1.2 beschriebenen PTU-Konzentrationen, Lösungsmittel und Lagerparameter durchgeführt. Als Vorsichtsmaßnahme sollten Embryonen / Larven alle 1-2 Tage während der PTU beobachtet werden, um die Wirksamkeit zu bestätigen und eine anhaltende Depigmentierung zu bestätigen. Die Auflösungs- und/oder Lagerbedingungen sollten optimiert werden, wenn eine Abnahme der PTU-Löslichkeit/Wirksamkeit vermutet wird.
  3. Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,05% w/v Methylenblau, einem Pilzwachstumshemmer, vor, indem Sie 0,05 g Methylenblaupulver zu 100 ml dH2O hinzufügen. Bei 4°C lagern.
  4. Bereiten Sie Pipetten für die Manipulation von Embryonen / Larven vor (z. B. Bewegen von Embryonen / Larven zwischen Petrischalen, Trennen von Larven während des Fluoreszenzscreenings, Sammeln von eingeschläferten Larven in Mikrozentrifugenröhrchen zur Fixierung usw.), indem Sie das sich verjüngende Ende einer Pasteur-Pipette aus Glas mit einem Diamantspitzen-Ritzstift zurückschneiden. Ätzen Sie den Umfang der Pipette mit dem Diamantstift und ziehen oder schnappen Sie das Ende vorsichtig ab, um einen sauberen Bruch zu machen.
    HINWEIS: Der Mund der Pipette sollte glatt und breit genug sein, um einen Embryo leicht aufzunehmen, der sich noch im Chorion befindet, ohne zu scheren. Verwenden Sie alternativ eine Bulb Draw Transfer Pipette. Vorbereitete Pipetten können auch verwendet werden, um Flüssigkeit während des Wasserwechsels (anstatt beim Gießen) zu entfernen, um den Verlust von Embryonen / Larven zu minimieren.
  5. Bereiten Sie eine 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor (z. B. fügen Sie 10 ml 16% PFA zu 4 ml 10x PBS und 26 ml dH 2 O hinzu). Bei 4°C bis zu 4 Wochen lichtgeschützt lagern.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist eine gefährliche Chemikalie und sollte in einem chemischen Abzug gehandhabt und ordnungsgemäß entsorgt werden. Vorsicht ist geboten und persönliche Schutzausrüstung (PSA) sollte getragen werden, um die Einnahme, das Einatmen und / oder den Kontakt mit der Haut oder den Augen zu verhindern.

2. Entnahme und Pflege von Zebrafischembryonen vor der genetischen Ablation (0-5 Tage nach der Befruchtung)

  1. Pflegen Sie erwachsene Zebrafische wie zuvor beschrieben 3,4,5. Am Nachmittag/Abend vor der Embryonenentnahme trennen Sie erwachsene Zebrafische zum Laichen in Brutbecken.
  2. Am nächsten Morgen (0 Tage nach der Befruchtung (dpf)) sammeln Sie Embryonen in Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm in Systemwasser und entfernen alle nicht lebensfähigen oder unbefruchteten Eier, die undurchsichtig erscheinen und / oder unregelmäßiges Zytoplasma und fehlgeschlagene Spaltung aufweisen24.
    HINWEIS: Normale Spaltungs- und Entwicklungsstadionsereignisse werden bei gesunden Embryonen wie beschriebenauftreten 25. Petrischalen sollten während des gesamten Protokolls zu drei Vierteln gefüllt gehalten werden (~ 30 ml für eine Schale mit einem Durchmesser von 10 cm).
    1. Fügen Sie zwei Tropfen 0,05% w / v Methylenblau zu jeder Petrischale hinzu, mischen Sie vorsichtig und lagern Sie die Embryonen bei 28,5 ° C für den Rest des Protokolls.
  3. Um 6 h nach der Befruchtung (hpf)4,5,26 Systemwasser in Embryo-Petrischalen durch 1,5x PTU (Arbeitslösung in Schritt 1.2.2) ersetzen und Methylenblau auffüllen.
    HINWEIS: PTU muss den Embryonen vor Beginn der Pigmentierung (d. h. vor 24 hpf)25 zugesetzt werden, da bereits pigmentiertes Gewebe bei Zugabe von PTU21 nicht depigmentiert wird. Es sollte jedoch beachtet werden, dass bei PTU-behandelten Zebrafischen27,28,29 eine reduzierte Augengröße, okuläre und kraniofaziale Defizite und Störungen einiger Signalwege (z. B. Schilddrüsensignalisierung) berichtet wurden. Die Entwicklungstoxizität von PTU scheint von der Konzentration und dem Zeitpunkt der PTU-Addition abhängig zu sein27,29. Wie oben zur Validierung der PTU-Wirksamkeit (Schritt 1.2) erwähnt, sollten auch die Anzeichen einer PTU-Toxizität sorgfältig überwacht werden, und bei Verdacht sollten die Arbeitskonzentration und/oder der Zeitpunkt der PTU-Zugabe optimiert werden.
  4. Auf 2-3 dpf dechorionierte Embryonen mit frisch hergestellter Pronasenlösung.
    1. Pronase in 1,5x PTU in einer Konzentration von 2 mg/ml durch Vortexing auflösen.
      ACHTUNG: Pronase ist als sehr feines Pulver verpackt und reizend. Ergreifen Sie Maßnahmen, um das Einatmen und/oder den Kontakt mit Haut, Augen usw. zu vermeiden.
    2. Trennen Sie geschlüpfte Embryonen von nicht geschlüpften Embryonen und behandeln Sie nur nicht geschlüpfte Embryonen.
    3. Ersetzen Sie 1,5x PTU durch 2 mg/ml Pronasenlösung, die in Schritt 2.4.1 hergestellt wurde, und lassen Sie ungeschlüpfte Embryonen für 4-5 min mit sanftem Rühren (z. B. auf einem Tischrotator / Schüttler oder durch manuelles Schwenken).
    4. Gießen Sie die Pronase-Lösung ab und spülen Sie sie sofort mit frischen 1,5x PTU ab. Spülen Sie vorsichtig 1,5x PTU über Embryonen mit einer Bulb-Draw-Transferpipette.
    5. Wiederholen Sie eine zweite 1,5-fache PTU-Spülung, um alle Chorionablagerungen zu entsorgen, und füllen Sie dann die 1,5-fache PTU für die Wartung auf.
      HINWEIS: Embryonen können auch manuell mit einer Pinzette mit feiner Spitze dechorioniert werden. In diesem Fall sollten Chorionablagerungen entfernt und 1,5x PTU nach manueller Dechorionierung wieder aufgefüllt werden.
  5. Überwachen Sie die Gesundheit von Embryonen / Larven und füllen Sie alle 1-2 Tage 1,5x PTU auf. Embryonen/Larven werden in 1,5x PTU bis zur Ablation bei 5 dpf gehalten.
    HINWEIS: Die Bedeutung der Schritte 2.3 und 2.4 wird im Abschnitt "Diskussion" näher erläutert.

3. Screening von Zebrafischlarven auf rpe65a:nfsB-eGFP und genetische Ablation des retinalen Pigmentepithels (5-6 Tage nach der Befruchtung)

  1. Machen Sie eine frische 10 mM Metronidazol (MTZ) Lösung auf 5 dpf (Tag der Ablation). Dieser Vorgang dauert 2 Stunden.
    1. MTZ-Pulver in Systemwasser ohne PTU geben und durch kräftiges Schütteln (z. B. 250 Umdrehungen pro Minute) für 1 h bei 37 °C gründlich mischen.
    2. Kühlen Sie die 10 mM MTZ-Lösung für weitere 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Tischrotator / Shaker ab und sorgen Sie für eine vollständige Auflösung, bevor Sie Petrischalen mit Larven hinzufügen.
      HINWEIS: Das Fluoreszenz-Screening und die Trennung von eGFP+ -Larven (Schritt 3.2) können während der 37 °C- und Raumtemperatur-Inkubationen durchgeführt werden.
      VORSICHT: MTZ ist gefährlich und es sollte darauf geachtet werden, dass die Einnahme, das Einatmen und / oder der Kontakt mit der Haut oder den Augen verhindert wird. MTZ-Pulver und alle hier beschriebenen flüssigen Derivate müssen je nach staatlichen und institutionellen Vorschriften möglicherweise als chemischer Abfall entsorgt werden. Eine Bestätigung der ordnungsgemäßen MTZ-Abfallentsorgungsmethoden, falls vorhanden, wird vor der Verwendung empfohlen.
  2. Zebrafischlarven auf das transgene rpe65a:nfsB-eGFP screenen.
    1. Anästhesieren Sie Larven mit 0,168 g/L Tricain (MS-222) und trennen Sie transgene (eGFP+) Larven (Abbildung 1) aus nicht-transgenen (eGFP-) Larven mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop mit einem 488 nm Anregungslaser/-filter.
      HINWEIS: Tricain sollte zu 1,5x PTU und / oder pharmakologischen Verbindungslösungen hinzugefügt werden, da Larven in die Behandlung eingetaucht bleiben sollten, während sie auf eGFP untersucht werden. Inkubieren Sie Larven in Tricain nur für die Dauer des Screenings (z. B. ≤10 min für eine einzelne 10 cm Petrischale mit 50 Larven).
    2. Wake Screened Larven sofort durch Pipettieren direkt in eine Petrischale mit frischem 1,5x PTU ohne Tricain.
    3. Nach Abschluss des Screenings trennen Sie die eGFP+-Larven weiter in zwei Gruppen von Petrischalen auf: eine Gruppe, die eine MTZ-Behandlung erhält (ablatiert / MTZ +) und eine Gruppe, die die unverminderte (MTZ-) Kontrolle sein soll.
  3. Tragen Sie das retinale Pigmentepithel ab.
    1. Entfernen Sie 1,5x PTU aus dem unverminderten (MTZ) Kontrollgeschirr und fügen Sie frisches Systemwasser ohne PTU hinzu.
    2. Entfernen Sie 1,5x PTU aus dem abgetragenen (MTZ+) Behandlungsgeschirr und fügen Sie die frisch zubereitete 10 mM MTZ-Lösung hinzu (Schritt 3.1.).
    3. Entfernen Sie die 10 mM MTZ-Lösung nach genau 24 Stunden (1 Tag nach der Verletzung (dpi)) und fügen Sie frisches Systemwasser ohne PTU hinzu. Wechseln Sie das frische Systemwasser ohne PTU auf der/den MTZ-Schüssel (n). Larven werden für den Rest des Protokolls nicht mehr PTU ausgesetzt.
      HINWEIS: Es kann schwierig sein, alle 1,5x PTU (Schritte 3.3.1 und 3.3.2) oder 10 mM MTZ (Schritt 3.3.3) zwischen dem Lösungsaustausch ohne Larvenverlust zu pipettieren oder auszugießen, da die Tiere aktiv herumschwimmen. In diesem Fall können Waschungen von Systemwasser ohne PTU hinzugefügt werden, um einen erfolgreichen Lösungsaustausch zu gewährleisten.

4. Larvenerhaltung nach genetischer Ablation (6+ Tage nach der Befruchtung)

  1. Überprüfen Sie die Larven und füllen Sie das Systemwasser ohne PTU täglich bis zur Euthanasie auf (Schritt 5.6) oder kehren Sie zur Zebrafisch-Haltungseinrichtung zurück.
  2. Überwachen Sie den Erfolg und das Ausmaß der Ablation in vivo auf 2 dpi (7 dpf) mit Durchlichtbeleuchtung auf einem Stereomikroskop (Abbildung 2).

5. Einbeziehung der pharmakologischen Behandlung in das retinale Pigmentablationsprotokoll des Zebrafisches

HINWEIS: Wie bereitsdurchgeführt 3, wird hier eine Behandlung mit 15 μM IWR-1 oder volumenangepasster Dimethylsulfoxid (DMSO) Fahrzeugkontrolle ab 4 dpf als Beispielexperiment zum Testen von RpEGEN beschrieben. Konzentrationen und Zeitpläne können mit verschiedenen pharmakologischen Verbindungen variieren, und Empfehlungen für die Dosis-Wirkungs-Validierung, die Behandlungsdauer, das Screening und andere Aspekte des experimentellen Designs für pharmakologische Manipulationsstudien werden im Diskussionsabschnitt behandelt. Führen Sie die Schritte 6 und 7 aus, wenn eine Bildanalyse erforderlich ist.

  1. Sammeln und pflegen Sie Embryonen wie in Schritt 2 beschrieben. Dechorionat-Embryonen auf 2 dpf.
  2. Screenen Sie eGFP+- Larven auf 4 dpf, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Anstelle von Petrischalen legen Sie eGFP+ -Larven in 6-Well-Platten mit einer Dichte von n ≤ 10 Larven pro 6-Well zur pharmakologischen Behandlung. Bezeichnen Sie separate 6-Well-Platten für Larven, die nicht abgetragen werden (MTZ-) und Larven, die abgetragen werden (MTZ+).
    HINWEIS: Das eGFP-Signal ist bei 4 dpf sichtbar, erscheint aber bei 5 dpf dunkler als die Signalintensität.
  3. Pretreat 4 dpf eGFP+ Larven mit 15 μM IWR-1 oder volumenangepasster DMSO-Fahrzeugsteuerung für genau 24 h vor der genetischen Ablation mit 10 mM MTZ-Lösung.
    HINWEIS: Oft wird sehr wenig Verbindung für pharmakologische Behandlungsexperimente benötigt. Um das Wiegen kleiner Mengen IWR-1-Pulvers zu vermeiden, wird diese pharmakologische Verbindung bereits in DMSO-Lösung in einer Konzentration von 25 mM gekauft und bei der Ankunft in kleinere Mengen aliquotiert, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
    1. Bestimmen Sie das Volumen der erforderlichen pharmakologischen und fahrzeugkontrollierenden Behandlungen und aliquotieren Sie 1,5x PTU entsprechend in konische Röhrchen. Ein Volumen von 5 ml/Well einer 6-Well-Platte wird empfohlen.
    2. IWR-1-Material zu 1,5x PTU hinzufügen, um eine Endkonzentration von 15 μM IWR-1 zu erhalten (z. B. 3 μL von 25 mM IWR-1 pro 5 ml von 1,5x PTU). Fügen Sie ein abgestimmtes Volumen des DMSO-Bestands zu 1,5x PTU hinzu (z. B. 3 μL ≥ 99,7 % DMSO pro 5 ml 1,5x PTU). Hier führt dies zu einer Endkonzentration von 0,06% Volumen / Volumen (% v / v) DMSO. Mischen Sie gut durch Vortexen und bestätigen Sie visuell die Auflösung von Verbindungen.
      ACHTUNG: DMSO, IWR-1 und andere pharmakologische Verbindungen und Lösungsmittel müssen je nach staatlichen und institutionellen Vorschriften möglicherweise als chemischer Abfall entsorgt werden. Es wird empfohlen, die Gefahrenstufe und die ordnungsgemäßen Abfallentsorgungsmethoden für diese Verbindungen, falls vorhanden, vor der Verwendung zu bestätigen.
    3. Entfernen Sie 1,5x PTU aus den eGFP+ -Larven in 6-Well-Platten und fügen Sie 5 ml/Well frisch hergestellte 0,06% v/v DMSO- oder 15 μM IWR-1-Behandlungen aus Schritt 5.3.2 hinzu.
  4. Bei 5 dpf den RPE ablegen. Zusätzlich zur 24-stündigen Vorbehandlung (Schritt 5.3) bleiben die Larven während der 24-stündigen genetischen Ablation mit 10 mM MTZ und während der Erholung nach der Ablation bis zur Fixierung (z. B. von 4-9 dpf) in pharmakologische und fahrzeugkontrollierende Behandlungen eingetaucht.
    1. 10 mM MTZ-Lösung 2 Stunden vor der Durchführung der genetischen Ablation (Schritt 3.1).
    2. Bestimmen Sie das Volumen der pharmakologischen und fahrzeugkontrollierenden Behandlungen, die sowohl für unablatierte (MTZ-) als auch für abgetragene (MTZ+) 6-Well-Platten erforderlich sind, und aliquot geeignete Mengen an Frischwasser ohne PTU (MTZ-) oder 10 mM MTZ-Lösung (MTZ+) in konische Röhrchen. Dies führt zu vier Behandlungsbedingungen: 1) 0,06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06% v / v DMSO, MTZ +; und 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Fügen Sie IWR-1- und DMSO-Stammlösungen zu den jeweiligen konischen Rohren hinzu, wie in Schritt 5.3.2 ausgeführt. Mischen Sie gut durch Vortexen und bestätigen Sie visuell die Auflösung von Verbindungen.
    4. Entfernen Sie 0,06% v/v DMSO- und 15 μM IWR-1-Behandlungen in 1,5x PTU (Schritt 5.3.2) aus ausgewiesenen unablierten (MTZ-) und abgetragenen (MTZ+) 6-Well-Platten und füllen Sie sie mit den entsprechenden Behandlungen in Schritt 5.4.3 auf.
    5. Entfernen Sie 0,06% v/v DMSO- und 15 μM IWR-1-Behandlungen in 10 mM MTZ-Lösung nach genau 24 h und füllen Sie sie mit Behandlungen in frischem Systemwasser ohne PTU auf. Füllen Sie 0,06% v/v DMSO- und 15 μM IWR-1-Behandlungen in frischem Systemwasser ohne PTU auf der/den unverminderten (MTZ-) 6-Well-Platte(n) auf.
  5. Befolgen Sie die Larvenerhaltung nach der Ablation, wie in Schritt 4 beschrieben, und füllen Sie täglich 0,06% v/v DMSO- oder 15 μM IWR-1-Behandlungen in Systemwasser ohne PTU auf.
  6. Euthanasieren Sie Larven auf 9 dpf (4 dpi für altersangepasste MTZ-behandelte Geschwister), indem Sie die Tiere in 0,3 g/L Tricainlösung (tödliche Überdosierung) in Verbindung mit schnellem Abkühlen (z. B. Petrischalen auf Eis legen) für mindestens 20 min30 eintauchen. Stellen Sie sicher, dass Larven nicht auf Berührung reagieren und sich in 4% PFA (Schritt 1.5) für 3 h bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht fixieren.
  7. Verarbeiten Sie Larvengewebe nach der Fixierung für die Z-Stack-Bildaufnahme auf einem konfokalen Mikroskop, wie zuvor 5,31 beschrieben und hier im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse. Die Analyse in den Schritten 6 und 7 erfordert mindestens die Erfassung von Kernmarker- (z. B. DAPI) und Hellfeld-Z-Stack-Bildern.

6. Konfokalmikroskop Z-Stack Bildvorverarbeitung in FIDSCHI (ImageJ)

  1. Importieren und formatieren Sie konfokale Mikroskop-Z-Stack-Bilder mit FIJI32.
    1. Öffnen Sie Mikroskopbilder mit den Bioformat-Importoptionen , die auf Stapel anzeigen mit: Hyperstack und Farbmodus: Graustufen eingestellt sind.
    2. Erzeugen Sie eine maximale Intensität der Projektion des importierten Mikroskopbildes, indem Sie Bild | wählen Stapel | Z-Projekt. Legen Sie im ZProjection-Fenster Start Slice und Stop Slice so fest, dass alle Slices für dieses Bild enthalten sind. Legen Sie beispielsweise Start Slice: 1 und Stop Slice: 18 für einen Z-Stack mit insgesamt 18 Slices fest. Wählen Sie Projektionstyp: Maximale Intensität und klicken Sie auf OK.
    3. Konvertieren Sie die Projektionsdatei mit maximaler Intensität in ein 8-Bit-Bild (falls nicht bereits), indem Sie Bild | auswählen Typ | 8-Bit.
    4. Richten Sie das Bild so aus, dass die dorsale Seite oben und distal (d. h. das Objektiv) belassen wird, indem Sie Bild | auswählen | transformieren Horizontal spiegeln (wählen Sie für den letzten Befehl die Option aus, die der für dieses Bild erforderlichen Direktionalität am besten entspricht). Für ein Mehrkanalbild klicken Sie im Process Stack auf Yes (Ja). Fenster, um alle Kanäle neu auszurichten.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist kritisch, aber nicht erforderlich, wenn sich das Bild bereits in der dorsalen, distalen linken Ausrichtung befindet. In Abbildung 3A-D und Abbildung 4 finden Sie Bilder mit Augen in der richtigen Direktionalität für die Verarbeitung.
    5. Speichern Sie die Projektion mit maximaler 8-Bit-Intensität als TIF-Datei (Tagged Image File Format), indem Sie Datei | auswählen Als | speichern Tiff....
  2. Generieren Sie RPE Region of Interest (ROI) mit FIDSCHI.
    1. Öffnen Sie ein 8-Bit-TIF-Bild, das wie in Schritt 6.1 beschrieben generiert wurde. Starten Sie den ROI-Manager, indem Sie | analysieren auswählen Tools | ROI-Manager.
    2. Bild | verwenden Zoomen und Umschalten zwischen den DAPI- und Hellfeldkanälen, um die Punkte zu identifizieren, an denen die apikale Seite des RPE an die Spitze der äußeren Grenzmembran (OLM) angrenzt (Abbildung 3B', B", D', D"; blaue Pfeilspitzen). Verwenden Sie diesen anatomischen Meilenstein als Ausgangspunkt für den ROI.
    3. Erstellen Sie den RPE-ROI mit dem Werkzeug Polygonauswahl (in der FIJI-Symbolleiste) mit den DAPI- und Hellfeld-Bildkanälen und der Zoomfunktion (Image | Zoom), um apikale und basale RPE-Grenzen zu identifizieren. Bringen Sie die dorsalen und ventralen Enden des ROI (d. h. wo der ROI von der apikalen zur basalen Seite des RPE übergeht) auf einen scharfen Punkt, anstatt abzustumpfen oder abzurunden (Abbildung 3B', B", D', D"; magentafarbene Linien).
      HINWEIS: Das Erstellen eines spitzen ROI-Endes ist ein kritischer Schritt zur Optimierung der Endpunkterkennung mit RpEGEN und wird im Abschnitt Diskussion behandelt.
    4. Fügen Sie den ROI hinzu, indem Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen klicken. Passen Sie den ROI nach Bedarf an und klicken Sie im ROI-Manager auf Aktualisieren .
    5. Speichern Sie die ROI-Datei, indem Sie Mehr auswählen>> | Retten... innerhalb des ROI-Managers. Verwenden Sie identische Namen für übereinstimmende ROI- und TIF-Bilddateien (z. B. [Dateiname].tif und [Dateiname].roi).
  3. Kombinieren Sie 8-Bit-TIF- und ROI-Dateien für jede Bedingung in einem einzigen Ordner. Beispielsweise enthält der Ordner DMSO_9dpf alle übereinstimmenden TIF- und ROI-Dateien für die 9 dpf unablated (MTZ-) 0,06% v/v DMSO-behandelte Larvengruppe.

7. Quantifizierung und Visualisierung der RPE-Regeneration mittels RpEGEN-Skripten

  1. Installieren und bereiten Sie RpEGEN-Skripte vor.
    1. Laden Sie die neuesten RpEGEN-Skripte aus dem GitHub-Repository (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) herunter, indem Sie auf Code | klicken Laden Sie ZIP herunter.
    2. Entpacken Sie den Ordner und legen Sie ihn am gewünschten Arbeitsplatz (z. B. Desktop) ab.
    3. Öffnen Sie MATLAB.
    4. Navigieren Sie zum Ordner RpEGEN im Bereich Aktueller Ordner (normalerweise auf der linken Seite).
    5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Ordner RpEGEN und wählen Sie Add to Path | Ausgewählte Ordner und Unterordner. Dadurch wird der Ordner dem MATLAB-Pfad hinzugefügt, sodass alle Skripts im Ordner automatisch gefunden und ausgeführt werden können.
    6. Doppelklicken Sie im Bereich Aktueller Ordner auf den Ordner RpEGEN, um alle Unterordner und M-Dateien anzuzeigen.
    7. Doppelklicken Sie auf die Datei RpEGEN.m , um sie im Editor-Bereich zu öffnen.
    8. Geben Sie im Abschnitt BENUTZERDEFINIERTE VARIABLEN der Datei RpEGEN.m die Verzeichnisspeicherorte für die Ordner ein, die die ROI-Dateien (.roi), Bilddateien (.tif) enthalten und in denen die Ausgabedateien gespeichert werden sollen. Geben Sie den Gruppennamen für die zu exportierende .mat-Datei ein (z. B. DMSO_9dpf, DMSO_4dpi usw.) und die Position des Hellfeldkanals im TIF-Bildstapel (z. B. 3, wenn das Hellfeld der dritte Kanal in einem Bildstapel ist). Wenn die Bilddatei nur das Hellfeldbild enthält, sollte dies gleich 1 sein.
  2. Führen Sie das Skript RpEGEN.m aus und überprüfen Sie die Ergebnisse.
    HINWEIS: Für RpEGEN müssen die Image Processing Toolbox, die Curve Fitting Toolbox und die Statistics and Machine Learning Toolbox auf der MATLAB-Benutzerlizenz aktiviert sein. Darüber hinaus wird die frei verfügbare ReadImageJROI Toolbox33 benötigt, um FIJI-ROIs in MATLAB zu importieren; Es wird jedoch im RpEGEN-Ordner zusammen mit anderen Funktionen M-Dateien bereitgestellt, die keine Aktivierung erfordern.
    1. Führen Sie das Skript aus, indem Sie oben in MATLAB im Menü Editor auf die Schaltfläche Ausführen klicken.
      HINWEIS: Nach der Initiierung liefert das Befehlsfenster eine ausführliche Ausgabe, die den Fortschritt des Skripts angibt. Nach dem Speichern der MAT-Datei, die die extrahierten Daten enthält, wird eine dreiteilige Abbildung angezeigt, die für jeden Bildlauf als PDF im Ausgabeverzeichnis gespeichert wird. Dies sind Qualitätskontrollzahlen (QC), um sicherzustellen, dass alles ordnungsgemäß gelaufen ist, und beinhalten: 1) das vom ROI überlagerte Hellfeldbild (Abbildung 4A); 2) den ROI mit Mittellinie und zugehörigem Winkelabstand (Grad) (Abbildung 4G); und 3) der ROI mit den mittleren Medianintensitätswerten (0-255, 8-Bit-Farbskala) (Abbildung 4H). Warten Sie, bis die QC-PDFs im Ausgabeordner gespeichert wurden und die letzte Abbildung verschwunden ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    2. Öffnen Sie die einzelnen PDF-Dateien, die in den Ausgabeordner exportiert wurden, in einem beliebigen PDF-Viewer und überprüfen Sie, ob alle ROIs mit den Hellfeldbildern übereinstimmen, dass die Mittellinienwerte angemessene Annäherungen an den Mittelpunkt der ROIs sind und dass die Medianintensitätswerte angemessen mit Daten gefüllt sind (d. h. nicht alle den gleichen Wert über die gesamte Mittellinie).
      HINWEIS: Eine detaillierte Beschreibung und Struktur jeder von RpEGEN.m in der MAT-Datei gespeicherten Variablen finden Sie in Tabelle 1.
  3. Führen Sie das Skript RpEGEN_PermPlot.m aus.
    HINWEIS: Das Skript RpEGEN_PermPlot.m verwendet die Ausgabe von RpEGEN.m, um statistische Vergleiche mit einer Permutationssimulation der Mediane zweier Gruppen durchzuführen, und stellt auch den Code für die Reproduktion der Diagramme in diesem Artikel mit der frei verfügbaren GRAMM-Toolbox34 bereit, die ebenfalls im RpEGEN-Ordner enthalten ist.
    1. Doppelklicken Sie auf die Datei RpEGEN_PermPlot.m , um sie in einer neuen Editor-Registerkarte zu öffnen.
    2. Geben Sie unter ABSCHNITT 1 - BENUTZERDEFINIERTE VARIABLEN in der Datei RpEGEN_PermPlot.m den Verzeichnisspeicherort für den Ausgabeordner ein, der die MAT-Dateien aus RpEGEN.m enthält, und geben Sie jeden zu ladenden MAT-Dateinamen ein (z. B. DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Führen Sie diesen Abschnitt des Skripts aus, indem Sie oben in MATLAB auf die Schaltfläche Abschnitt ausführen im Menü Editor klicken.
    4. Geben Sie in Abschnitt 2 die Namen der beiden Gruppen für den statistischen Vergleich in den Variablen data_A und data_B ein (dies sind die Gruppen, aus denen die Mediane mit der Permutationssimulation abgeleitet werden). Geben Sie in der Variablen bin_sz die Anzahl der Grad ein, über die die Medianintensitätswerte für die Datasets integriert werden sollen (Standardwert sind 1-Grad-Ablagen).
      HINWEIS: Die Variable reps gibt die Anzahl der Permutationen an, die zum Erstellen einer Wahrscheinlichkeitsverteilung verwendet werden sollen, und kann auf eine beliebige Zahl gesetzt werden (Standardwert ist 20.000). Im Allgemeinen wird eine höhere Anzahl von Wiederholungen statistisch robuster sein, aber die Verarbeitungszeit erhöhen.
    5. Führen Sie diesen Abschnitt des Skripts aus, indem Sie oben in MATLAB auf die Schaltfläche Abschnitt ausführen im Menü Editor klicken. Dieser Abschnitt kann je nach Anzahl der angegebenen Wiederholungen einige Zeit in Anspruch nehmen, bietet jedoch eine fortlaufende Statusaktualisierung im Befehlsfenster.
    6. Führen Sie die Abschnitte HEATMAP FIGURE und GROUP RESULTS AND P-VALUES unabhängig voneinander aus, indem Sie die Schaltfläche Abschnitt ausführen verwenden. Bearbeiten Sie Datenvariablen in allen Abschnitten, die mit "HIER DATEN EINGEBEN" kommentiert werden. PDFs dieser Abbildungen werden automatisch für jede Datei gespeichert und können in jeder Vektorsoftware-Nachbearbeitung leicht geändert werden.
      HINWEIS: Die in der Datei RpEGEN_PermPlot.m generierten Diagramme sind ad hoc und erfordern wahrscheinlich Änderungen, die auf den spezifischen Daten- und Visualisierungsanforderungen jedes Benutzers basieren. Die Zahlen bieten jedoch eine solide Grundlage, die sowohl über MATLAB- als auch über GRAMM-Websites leicht individualisiert werden kann.

Ergebnisse

Es ist bekannt, dass die Hemmung des kanonischen Wnt-Signalwegs die RPE-Regeneration von Zebrafischen unter Verwendung des genetischen Ablationsparadigmas (rpe65a:nfsB-eGFP) und der pharmakologischen Manipulationsmethodik (IWR-1), die im Protokoll3 beschrieben sind, signifikant beeinträchtigt. Dieses Experiment wurde hier wiederholt, um eine automatisierte Methode zur Quantifizierung der RPE-Regeneration von Zebrafischen basierend auf Pigmentierung zu validieren. Die im Folgenden zusamme...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Abrundung der RPE und zur Untersuchung von Degenerations- und Regenerationsmechanismen bei larvengealterten Zebrafischen. Dieses Protokoll wurde auch bei erwachsenenZebrafischen 3 erfolgreich durchgeführt, jedoch mit weniger umfangreicher Charakterisierung, weshalb Larven hier im Mittelpunkt stehen. Zu den kritischen Aspekten dieses Teils des Protokolls (Schritte 1-4) gehören: 1) Zugabe von 1,5x PTU zu Embryonen vor Beginn der Melanogenese...

Offenlegungen

L.L.L. ist Miterfinder des US-Patents #9,458,428, das eine beschleunigte Methode zur Gewinnung von retinalem Pigmentepithel aus humanen pluripotenten Stammzellen beschreibt; Dies steht in keinem Zusammenhang mit dem hierin enthaltenen Inhalt. J.M.G. und G.B.F. haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die hierin beschriebenen Arbeiten wurden von den National Institutes of Health (RO1-EY29410 bis J.M.G. und NIH CORE Grant P30-EY08098 an die Abteilung für Augenheilkunde) unterstützt; das UPMC Immune Transplant & Therapy Center (zu L.L.L. und J.M.G.); und der E. Ronald Salvitti Lehrstuhl für Ophthalmologie Forschung (an J.M.G.). Zusätzliche Unterstützung erhielt die Wiegand Fellowship in Ophthalmology (an L.L.L.), die Eye & Ear Foundation of Pittsburgh und ein uneingeschränktes Stipendium von Research to Prevent Blindness, New York, NY. Die Autoren danken auch Amanda Platt für die technische Unterstützung und Dr. Hugh Hammer und den Aquatics-Mitarbeitern für die hervorragende Unterstützung der Tierpflege.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-well platesFisher Scientific07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific05-539-13Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing penFisher Scientific50-254-51Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %Fisher ScientificBP231Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)Fisher Scientific3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)LabnetI5110A
Fluorescence stereo microscopeZeissAxio Zoom.V16Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-4Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)Fisher ScientificBP117-100Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)Millipore SigmaM3761Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)Millipore SigmaP7629Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol freeFisher ScientificAA433689MChemical waste, proper disposal required
Petri dishesFisher ScientificFB087571210 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)Millipore SigmaP3813Used to make 10 X PBS stock
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Shaking incubatorBenchmarkH2010Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscopeLeicaS9iOr similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forcepsFine Science Tools91150-20Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shakerScilogexSK-D1807-E
Transfer pipetteMillipore SigmaZ1350033.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tosMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlToolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB supportMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

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