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Resumen

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando un modelo de pez cebra transgénico. La adaptación del protocolo para incorporar la modulación de la vía de señalización utilizando compuestos farmacológicos es ampliamente detallada. Se desarrolló una plataforma de MATLAB para cuantificar la regeneración de RPE basada en la pigmentación, que se presenta y discute.

Resumen

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) reside en la parte posterior del ojo y realiza funciones esenciales para mantener la salud y la integridad de los tejidos retinianos y vasculares adyacentes. En la actualidad, la limitada capacidad reparadora de la EPR de mamíferos, que se limita a pequeñas lesiones, ha obstaculizado el progreso hacia la comprensión de los procesos regenerativos de EPR in vivo . Aquí, se proporciona una metodología detallada para facilitar el estudio de la reparación in vivo de RPE utilizando el pez cebra, un modelo de vertebrados capaz de regeneración de tejidos robustos. Este protocolo describe un paradigma de lesión mediada por nitrorreductasa/metronidazol transgénico (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), que da como resultado la ablación de los dos tercios centrales del EPR después de 24 h de tratamiento con MTZ, con posterior recuperación tisular. Se hace hincapié en las ablaciones de EPR en larvas de pez cebra y también se describen los métodos para probar los efectos de los compuestos farmacológicos en la regeneración de EPR. También se discute la generación y validación de RpEGEN, un script de MATLAB creado para automatizar la cuantificación de la regeneración de RPE basada en la pigmentación. Más allá de los mecanismos activos de reparación del EPR, este protocolo se puede ampliar a estudios de la degeneración del EPR y las respuestas a las lesiones, así como a los efectos del daño del EPR en los tejidos retinianos y vasculares adyacentes, entre otros procesos celulares y moleculares. Este sistema de pez cebra es muy prometedor en la identificación de genes, redes y procesos que impulsan la regeneración de RPE y los mecanismos relacionados con la enfermedad de RPE, con el objetivo a largo plazo de aplicar este conocimiento a los sistemas de mamíferos y, en última instancia, hacia el desarrollo terapéutico.

Introducción

La metodología descrita aquí detalla un protocolo para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando larvas de pez cebra. El EPR se extiende sobre la parte posterior del ojo y reside entre las capas estratificadas de la retina neural y la capa de vasculatura que constituye la coroides. El soporte trófico, la absorción de luz fototóxica y el mantenimiento de las proteínas del ciclo visual son solo algunas de las funciones críticas que realiza el EPR que son esenciales para mantener la salud y la integridad de estos tejidos adyacentes1. El daño al EPR de mamíferos es reparable cuando las lesiones son pequeñas2; sin embargo, el daño sufrido por lesiones más grandes o enfermedad degenerativa progresiva es irreversible. En los seres humanos, las enfermedades degenerativas de EPR (por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la enfermedad de Stargardt) conducen a la pérdida permanente de la visión y, con pocas opciones de tratamiento disponibles, disminuyen la calidad de vida del paciente. La capacidad limitada del EPR de mamíferos para autorrepararse ha creado una brecha de conocimiento en el campo de los procesos regenerativos del EPR. Dada la robusta capacidad regenerativa del pez cebra en muchos tipos de tejidos diferentes, este protocolo se desarrolló para establecer un sistema de vertebrados in vivo para facilitar los estudios sobre el EPR intrínsecamente regenerador y descubrir mecanismos que impulsan esa respuesta. Utilizando el paradigma de ablación descrito aquí, la vía de señalización canónica Wnt3, la vía mTOR4 y las respuestas relacionadas con el sistema inmunológico5 se han identificado como mediadores críticos de la regeneración de RPE, probablemente con funciones superpuestas.

En este paradigma de ablación genética, el pez cebra Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 expresa el gen6 de la nitrorreductasa derivada de bacterias (NTR/nfsB) fusionado con eGFP bajo control del elemento potenciador de RPE, rpe65a7. La ablación se logra agregando el profármaco, metronidazol (MTZ), al sistema de agua que alberga el pez cebra. La activación intracelular de MTZ por nitrorreductasa da como resultado la reticulación del ADN y la apoptosis en células que expresan NTR/nfsB 8,9. Esta tecnología ha sido ampliamente utilizada en el pez cebra para extirpar células de la retina 10,11,12,13 y otros tejidos 8. Juntos, estos elementos permiten la expresión dirigida (rpe65a) de una metodología de ablación celular inducible (NTR/MTZ)8,9 y un marcador fluorescente (eGFP) para la visualización.

También existen otros modelos in vivo interesantes que se pueden utilizar para estudiar el potencial regenerativo del RPE14. Estos son amplios e incluyen la transdiferenciación de EPR a retina después de la retinectomía en anfibios, en la que las células de EPR perdidas por el recrecimiento retiniano se reemplazan15,16; Restauración de RPE post-lesión en el ratón MRL/MpJ "súper curativo"17; y estimulación exógena de la proliferación de EPR en un modelo de rata de EPR espontáneo y degeneración retiniana18, entre otros. También se han desarrollado modelos in vitro, como las células madre de EPR humanas adultas (RPESCs)19. Todos estos modelos son herramientas valiosas que trabajan para descubrir los procesos celulares relacionados con la regeneración de RPE (por ejemplo, proliferación, diferenciación, etc.); sin embargo, el pez cebra es único en su capacidad para la reparación intrínseca de RPE después de la ablación.

Si bien la metodología aquí está escrita para centrarse en la comprensión de los mecanismos que impulsan la regeneración de RPE, la línea Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) y este protocolo de ablación genética podrían utilizarse para estudiar otros procesos celulares como la apoptosis de RPE, la degeneración de RPE y el efecto de la lesión de RPE en los tejidos retinianos y vasculares adyacentes. El protocolo de ablación también se puede modificar para incluir la manipulación farmacológica, que es una estrategia preliminar conveniente para detectar vías de señalización de interés. Por ejemplo, se ha demostrado que el bloqueo de la vía Wnt canónica mediante el Inhibidor de la Respuesta Wnt-1 (IWR-1)20 perjudica la regeneracióndel EPR 3. Esto se repitió aquí para guiar a los usuarios a través de un experimento de manipulación farmacológica y servir como prueba de concepto para validar un script de MATLAB (RpEGEN) creado para cuantificar la regeneración de RPE basada en la recuperación de la pigmentación. Al igual que la línea transgénica y el protocolo de ablación, los scripts RpEGEN son adaptables y podrían usarse para cuantificar otros marcadores / procesos celulares dentro del RPE.

Protocolo

Todas las metodologías descritas en este documento cumplen con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pittsburgh.

1. Preparación previa a la recogida de embriones de pez cebra

  1. Ajuste la incubadora de embriones a 28,5 °C.
  2. Preparar una solución madre 25x del inhibidor de la melanogénesis, N-feniltiorea (PTU)21,22. Esta solución madre se escala a partir de una receta común22 y 1x es igual a 0.003% de peso por volumen (% p/v) (por ejemplo, 0.003 g de polvo de PTU en 100 mL de disolvente líquido).
    1. Para hacer una solución madre de PTU grande de 25x, agregue 0.75 g de polvo de PTU a 1 L de agua desionizada purificada (en adelante, dH2O) y mezcle bien a temperatura ambiente (~ 25 ° C) usando una barra de agitación y una placa de agitación. Conservar a 4°C durante un máximo de 3 meses protegido de la luz.
      NOTA: Es difícil conseguir que la PTU entre en solución acuosa y puede ser necesaria una agitación prolongada durante la noche.
      PRECAUCIÓN: La PTU es peligrosa y se debe tener cuidado para evitar la ingestión, inhalación y / o contacto con la piel o los ojos. El polvo de PTU y todos los derivados líquidos de PTU descritos en este documento pueden necesitar ser eliminados como desechos químicos dependiendo de las regulaciones estatales e institucionales. Se recomienda la confirmación de los métodos adecuados de eliminación de residuos de PTU, si los hubiera, antes de su uso.
    2. Para hacer una solución de trabajo de PTU de 1,5x (en lo sucesivo denominada PTU de 1,5x), agregue 60 ml de solución madre de PTU de 25 x a 940 ml de agua de la instalación de alojamiento de pez cebra (en lo sucesivo, "agua del sistema"). Se han descrito parámetros óptimos de calidad del agua para el pez cebra23 y las instalaciones acuáticas deben contar con procedimientos estándar de monitoreo del agua. Guarde 1.5x PTU a 28.5°C durante 1-2 semanas protegido de la luz.
      NOTA: Este protocolo se realiza de forma rutinaria utilizando las concentraciones de PTU, disolventes y parámetros de almacenamiento descritos en el paso 1.2. Como medida de precaución, los embriones / larvas deben observarse cada 1-2 días mientras están en PTU para validar la eficacia y confirmar la despigmentación sostenida. Las condiciones de disolución y/o almacenamiento deben optimizarse si se sospecha una disminución de la solubilidad/eficacia de la PTU.
  3. Prepare una solución madre de 0.05% p/v de azul de metileno, un inhibidor del crecimiento de hongos, agregando 0.05 g de polvo de azul de metileno a 100 ml de dH2O. Mezcle bien con una barra de agitación y una placa de agitación. Conservar a 4°C.
  4. Prepare pipetas para la manipulación de embriones / larvas (por ejemplo, mover embriones / larvas entre placas de Petri, separar larvas durante la detección de fluorescencia, recolectar larvas sacrificadas en tubos de microcentrífuga para su fijación, etc.) cortando el extremo cónico de una pipeta Pasteur de vidrio con una pluma de garabato de punta de diamante. Graba alrededor de la circunferencia de la pipeta con la pluma de diamante y tira suavemente o rompe el extremo para hacer un descanso limpio.
    NOTA: La boca de la pipeta debe ser lo suficientemente lisa y ancha como para absorber fácilmente un embrión aún dentro del corion sin esquilar. Use una pipeta de transferencia de extracción de bombilla como alternativa. Las pipetas preparadas también se pueden usar para eliminar el líquido durante los cambios de agua (en lugar de verter) para minimizar la pérdida de embriones / larvas.
  5. Prepare una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (por ejemplo, agregue 10 ml de PFA al 16% a 4 ml de 10 x PBS y 26 ml de dH2O). Conservar a 4°C durante un máximo de 4 semanas protegido de la luz.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un producto químico peligroso y debe manipularse en una campana extractora de humos químicos y eliminarse adecuadamente. Se debe tener cuidado y usar equipo de protección personal (EPP) para evitar la ingestión, inhalación y / o contacto con la piel o los ojos.

2. Recolección y mantenimiento de embriones de pez cebra antes de la ablación genética (0-5 días después de la fertilización)

  1. Mantener el pez cebra adulto como se describió anteriormente 3,4,5. La tarde / noche antes de la recolección de embriones, separe el pez cebra adulto en tanques de reproducción para el desove.
  2. A la mañana siguiente (0 días después de la fertilización (dpf)), recoger embriones en placas de Petri de 10 cm de diámetro en agua del sistema y eliminar todos los óvulos no viables o no fertilizados, que aparecerán opacos y / o mostrarán citoplasma irregular y escisión fallida24.
    NOTA: Los eventos normales de escisión y estadificación del desarrollo serán evidentes en embriones sanos como se describe25. Las placas de Petri deben mantenerse tres cuartas partes llenas (~ 30 ml para un plato de 10 cm de diámetro) durante todo el protocolo.
    1. Agregue dos gotas de azul de metileno al 0,05% p/v a cada placa de Petri, mezcle suavemente y almacene los embriones a 28,5 °C durante el resto del protocolo.
  3. Alrededor de las 6 h posteriores a la fertilización (hpf)4,5,26, reemplace el agua del sistema en placas de Petri embrionarias con 1.5x PTU (solución de trabajo hecha en el paso 1.2.2) y reponga el azul de metileno.
    NOTA: La PTU debe agregarse a los embriones antes del inicio de la pigmentación (es decir, antes de 24 hpf)25 ya que los tejidos ya pigmentados no se despigmentarán al agregar PTU21. Cabe señalar, sin embargo, que la reducción del tamaño de los ojos, los déficits oculares y craneofaciales, y la interrupción de algunas vías de señalización (por ejemplo, la señalización tiroidea) se han reportado en el pez cebra tratado con PTU 27,28,29. La toxicidad para el desarrollo de la PTU parece depender de la concentración y el momento de la adición de PTU27,29. Como se mencionó anteriormente para validar la eficacia de la PTU (paso 1.2), los signos de toxicidad de la PTU también deben controlarse cuidadosamente y, si se sospecha, se debe optimizar la concentración de trabajo y / o el tiempo de adición de PTU.
  4. En 2-3 dpf, dechorionar embriones usando solución de pronasa recién hecha.
    1. Disolver la pronasa en 1,5x PTU a una concentración de 2 mg/ml por vórtice.
      PRECAUCIÓN: La pronasa se envasa como un polvo muy fino y es irritante. Tomar medidas para evitar la inhalación y/o el contacto con la piel, los ojos, etc.
    2. Separe los embriones eclosionados de los embriones no eclosionados y trate solo los embriones no eclosionados.
    3. Reemplace 1.5x PTU con 2 mg/ml de solución de pronasa hecha en el paso 2.4.1 y deje en embriones no eclosionados durante 4-5 min con agitación suave (por ejemplo, en un rotador/agitador de mesa o mediante remolino manual).
    4. Vierta la solución de pronasa e inmediatamente enjuague con 1.5x PTU fresca. Triture suavemente 1.5x PTU enjuague sobre los embriones con una pipeta de transferencia de extracción de bulbo.
    5. Repita un segundo enjuague de PTU de 1.5x para desechar todos los restos de corion y luego reponga 1.5x PTU para mantenimiento.
      NOTA: Los embriones también se pueden descoronar manualmente usando fórceps de punta fina. En este caso, los restos de corion deben eliminarse y 1.5x PTU se debe reponer después de la deselección manual.
  5. Monitoree la salud del embrión / larva y reponga 1.5x PTU cada 1-2 días. Los embriones/larvas se mantienen en 1,5x PTU hasta la ablación a 5 dpf.
    NOTA: La importancia de los pasos 2.3 y 2.4 se aborda más a fondo en la sección Discusión.

3. Detección de larvas de pez cebra para rpe65a: nfsB-eGFP y ablación genética del epitelio pigmentario de la retina (5-6 días después de la fertilización)

  1. Haga una solución fresca de metronidazol (MTZ) de 10 mM a 5 dpf (día de la ablación). Este proceso tarda 2 h en completarse.
    1. Agregue polvo de MTZ al agua del sistema sin PTU y mezcle bien mediante agitación vigorosa (por ejemplo, 250 rotaciones por minuto) durante 1 h a 37 ° C.
    2. Enfríe la solución MTZ de 10 mM durante 1 h adicional a temperatura ambiente en un rotador/agitador de mesa y asegure la disolución completa antes de agregarla a las placas de Petri con larvas.
      NOTA: El cribado de fluorescencia y la separación de larvas de eGFP+ (paso 3.2) se pueden realizar durante las incubaciones a 37 °C y a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: MTZ es peligroso, y se debe tener cuidado para prevenir la ingestión, inhalación y / o contacto con la piel o los ojos. El polvo MTZ y todos los derivados líquidos descritos en este documento pueden necesitar ser eliminados como desechos químicos dependiendo de las regulaciones estatales e institucionales. Se recomienda la confirmación de los métodos adecuados de eliminación de residuos MTZ, si los hubiera, antes de su uso.
  2. Cribar larvas de pez cebra para el transgén rpe65a:nfsB-eGFP.
    1. Anestesiar larvas con 0,168 g/L de tricaína (MS-222) y separar larvas transgénicas (eGFP+) (Figura 1) de larvas no transgénicas (eGFP-) utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia con un láser/filtro de excitación de 488 nm.
      NOTA: Se debe agregar tricaína a 1.5x PTU y / o soluciones compuestas farmacológicas, ya que las larvas deben permanecer inmersas en el tratamiento mientras se examinan para detectar eGFP. Incubar larvas en tricaína solo durante la duración del cribado (por ejemplo, ≤10 min para una sola placa de Petri de 10 cm que contenga 50 larvas).
    2. Wake criabilizó las larvas inmediatamente pipeteando directamente en una placa de Petri con PTU fresca de 1.5x sin tricaína.
    3. Al finalizar el cribado, separe aún más las larvas de eGFP+ en dos grupos de placas de Petri: un grupo para recibir tratamiento MTZ (ablated/MTZ+) y un grupo para ser el control noblated (MTZ-).
  3. Extirpar el epitelio pigmentario de la retina.
    1. Retire 1.5x PTU de los platos de control sin abrir (MTZ-) y agregue agua fresca del sistema sin PTU.
    2. Retire 1,5 veces la PTU de los platos de tratamiento ablacionados (MTZ+) y agregue la solución MTZ de 10 mM recién hecha (paso 3.1.).
    3. Retire la solución MTZ de 10 mM después de exactamente 24 h (designada 1 día después de la lesión (dpi)) y agregue agua fresca del sistema sin PTU. Cambie el agua dulce del sistema sin PTU en el plato ( es) MTZ. Las larvas no volverán a estar expuestas a la PTU durante el resto del protocolo.
      NOTA: Puede ser difícil pipetear o verter todos los 1.5x PTU (pasos 3.3.1 y 3.3.2) o 10 mM MTZ (paso 3.3.3) entre los intercambios de solución sin pérdida larvaria ya que los animales están nadando activamente. En este caso, se pueden agregar lavados de agua del sistema sin PTU para garantizar un intercambio exitoso de soluciones.

4. Mantenimiento larvario post-ablación genética (más de 6 días post-fertilización)

  1. Revise las larvas y reponga el agua del sistema sin PTU diariamente hasta la eutanasia (paso 5.6) o regrese a la instalación de alojamiento de peces cebra.
  2. Monitoree el éxito y el alcance de la ablación in vivo a 2 dpi (7 dpf) utilizando la iluminación de luz transmitida en un microscopio estereoscópico (Figura 2).

5. Incorporación del tratamiento farmacológico en el protocolo de ablación del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra

NOTA: Como se realizó anteriormente3, el tratamiento con 15 μM IWR-1 o control de vehículos con sulfóxido de dimetilo (DMSO) a partir de 4 dpf se describe aquí como un experimento de ejemplo para probar RpEGEN. Las concentraciones y los plazos pueden variar con diferentes compuestos farmacológicos y las recomendaciones para la validación dosis-respuesta, la duración del tratamiento, el cribado y otros aspectos del diseño experimental para estudios de manipulación farmacológica se abordan en la sección Discusión. Siga los pasos 6 y 7 si se requiere análisis de imágenes.

  1. Recolectar y mantener embriones como se describe en el paso 2. Dechorionato embriones en 2 dpf.
  2. Cribar larvas de eGFP+ en 4 dpf como se describe en el paso 3.2. En lugar de placas de Petri, coloque las larvas de eGFP + en placas de 6 pocillos a una densidad de n ≤ 10 larvas por 6 pocillos para el tratamiento farmacológico. Designe placas separadas de 6 pocillos para larvas que no se ablacionarán (MTZ-) y larvas que serán ablacionadas (MTZ +).
    NOTA: La señal eGFP es visible en 4 dpf, pero parece más tenue que la intensidad de la señal en 5 dpf.
  3. Pretratar larvas de eGFP+ de 4 dpf con 15 μM IWR-1 o control de vehículo DMSO de volumen emparejado durante exactamente 24 h antes de la ablación genética con solución MTZ de 10 mM.
    NOTA: A menudo, se necesita muy poco compuesto para los experimentos de tratamiento farmacológico. Para evitar pesar pequeñas cantidades de polvo de IWR-1, este compuesto farmacológico se compra ya en solución DMSO, a una concentración de 25 mM, y se alicita en volúmenes más pequeños a su llegada para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
    1. Determinar el volumen de tratamientos farmacológicos y de control de vehículos necesarios y alícuota 1.5x PTU en tubos cónicos en consecuencia. Se recomienda un volumen de 5 ml/pocillo de una placa de 6 pocillos.
    2. Añadir el stock de IWR-1 a 1,5x PTU para una concentración final de 15 μM de IWR-1 (por ejemplo, 3 μL de 25 mM de IWR-1 por 5 mL de 1,5x PTU). Agregue un volumen coincidente de existencias de DMSO a 1,5x PTU (por ejemplo, 3 μL ≥ 99,7% DMSO por 5 mL de 1,5x PTU). Aquí, esto terminará produciendo una concentración final de 0.06% volumen / volumen (% v / v) DMSO. Mezclar bien por vórtice y confirmar visualmente la disolución de los compuestos.
      PRECAUCIÓN: DMSO, IWR-1 y otros compuestos farmacológicos y solventes pueden necesitar ser eliminados como desechos químicos dependiendo de las regulaciones estatales e institucionales. Se recomienda la confirmación del nivel de peligro y los métodos adecuados de eliminación de desechos para estos compuestos, si los hubiera, antes de su uso.
    3. Retire 1.5x PTU de las larvas de eGFP+ en placas de 6 pocillos y agregue 5 mL/pocillo de DMSO recién hecho al 0.06% v/v o tratamientos IWR-1 de 15 μM del paso 5.3.2.
  4. En 5 dpf, ablate el RPE. Además del pretratamiento de 24 h (paso 5.3), las larvas permanecerán inmersas en tratamientos farmacológicos y de control de vehículos durante 24 h de ablación genética con 10 mM MTZ y durante la recuperación post-ablación, hasta la fijación (por ejemplo, de 4-9 dpf).
    1. Hacer 10 mM MTZ solución 2 h antes de realizar la ablación genética (paso 3.1).
    2. Determinar el volumen de tratamientos farmacológicos y de control de vehículos necesarios para placas de 6 pocillos no ablacionadas (MTZ-) y ablacionadas (MTZ+) y alícuotas volúmenes apropiados de agua fresca del sistema sin PTU (MTZ-) o solución MTZ de 10 mM (MTZ+) en tubos cónicos. Esto producirá cuatro condiciones de tratamiento: 1) 0.06% v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0.06% v/v DMSO, MTZ+; y 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Agregue soluciones de stock IWR-1 y DMSO a los tubos cónicos respectivos como se realiza en el paso 5.3.2. Mezclar bien por vórtice y confirmar visualmente la disolución de los compuestos.
    4. Retire los tratamientos con DMSO al 0,06% v/v y 15 μM IWR-1 en 1,5x PTU (paso 5.3.2) de las placas de 6 pocillos designadas no ablacionadas (MTZ-) y ablacionadas (MTZ+) y reponga con los tratamientos apropiados realizados en el paso 5.4.3.
    5. Retire los tratamientos DMSO al 0,06% v/v y 15 μM IWR-1 en solución MTZ de 10 mM después de exactamente 24 h y reponga con tratamientos en agua dulce del sistema sin PTU. Reponga los tratamientos dmSO v/v 0,06% y IWR-1 de 15 μM en agua dulce del sistema sin PTU en la placa o placas de 6 pocillos no abraminadas (MTZ-).
  5. Siga el mantenimiento larvario después de la ablación como se describe en el paso 4 y reponga 0.06% v / v DMSO o 15 μM IWR-1 tratamientos diariamente en agua del sistema sin PTU.
  6. Sacrificar las larvas a 9 dpf (4 dpi para hermanos tratados con MTZ de la misma edad) sumergiendo a los animales en una solución de tricaína de 0,3 g / L (sobredosis letal) junto con un enfriamiento rápido (por ejemplo, colocar placas de Petri en hielo) durante al menos 20 min30. Verifique que las larvas no respondan al tacto y se fijen en PFA al 4% (paso 1.5) durante 3 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche.
  7. Procese el tejido larvario posterior a la fijación para la adquisición de imágenes de la pila z en un microscopio confocal como se describió anteriormente 5,31 y aquí en la sección Resultados representativos. El análisis en los pasos 6 y 7 requerirá, como mínimo, la adquisición de marcadores nucleares (por ejemplo, DAPI) e imágenes de pila z de campo brillante.

6. Preprocesamiento de imágenes z-stack de microscopio confocal en FIJI (ImageJ)

  1. Importe y formatee imágenes de la pila z del microscopio confocal utilizando FIJI32.
    1. Abra imágenes de microscopio utilizando las Opciones de importación de bioformatos establecidas en Ver pila con: Hyperstack y Modo de color: Escala de grises.
    2. Genere una proyección de máxima intensidad de la imagen del microscopio importada eligiendo Imagen | Pilas | Proyecto Z. En la ventana ZProjection , establezca Iniciar sector y Detener sector para incluir todos los sectores de esa imagen. Por ejemplo, establezca Start Slice: 1 y Stop Slice: 18 para una pila z que tenga un total de 18 slices. Elija Tipo de proyección: Intensidad máxima y haga clic en Aceptar.
    3. Convierta el archivo de proyección de máxima intensidad en una imagen de 8 bits (si aún no lo ha hecho) eligiendo Imagen | Tipo | 8 bits.
    4. Reoriente la imagen para que el lado dorsal esté hacia arriba y el distal (es decir, la lente) se deje eligiendo Imagen | Transformar | Voltear horizontalmente (para el último comando, elija la opción que mejor se adapte a la direccionalidad necesaria para esa imagen). Para obtener una imagen multicanal, haga clic en Sí en la pila de procesos. para reorientar todos los canales.
      NOTA: Este paso es crítico, pero no es necesario si la imagen ya está en la orientación dorsal hacia arriba, distal izquierda. Consulte la Figura 3A-D y la Figura 4 para imágenes con ojos en la direccionalidad correcta para el procesamiento.
    5. Guarde la proyección de intensidad máxima de 8 bits como un archivo de formato de archivo de imagen etiquetada (TIF) seleccionando Archivo | Guardar como | Tiff....
  2. Generar RPE región de interés (ROI) utilizando FIJI.
    1. Abra una imagen TIF de 8 bits generada como se describe en el paso 6.1. Inicie el Administrador de ROI eligiendo Analizar | Herramientas | Gestor de ROI.
    2. Usar | de imagen Zoom y alternar entre el DAPI y los canales de campo brillante para identificar los puntos en los que el lado apical del RPE está adyacente a la punta de la membrana limitante externa (OLM) (Figura 3B', B", D', D"; puntas de flecha azules). Utilice este hito anatómico como punto de partida del ROI.
    3. Cree el ROI de RPE con la herramienta Selecciones de polígonos (en la barra de herramientas FIJI) utilizando los canales de imagen DAPI y de campo brillante y la función de zoom (Imagen | Zoom) para identificar los límites apicales y basales del EPR. Lleve los extremos dorsal y ventral del ROI (es decir, donde el ROI pasa del lado apical al basal del RPE) a un punto agudo en lugar de embotar o redondear (Figura 3B', B", D', D"; líneas magenta).
      NOTA: La creación de un extremo de ROI puntiagudo es un paso crítico para optimizar la detección de puntos finales mediante RpEGEN y se aborda en la sección Discusión.
    4. Agregue el ROI haciendo clic en Agregar en el Administrador de ROI. Ajuste el ROI según sea necesario y haga clic en Actualizar en el Administrador de ROI.
    5. Guarde el archivo ROI eligiendo Más>> | Salvar... dentro del ROI Manager. Utilice nombres idénticos para los archivos de imagen ROI y TIF coincidentes (por ejemplo, [nombre de archivo].tif y [nombre de archivo].roi).
  3. Combine archivos TIF y ROI de 8 bits para cada condición en una sola carpeta. Por ejemplo, la carpeta, DMSO_9dpf, contendrá todos los archivos TIF y ROI coincidentes para el grupo larvario tratado con DMSO de 9 dpf sin abrir (MTZ-) 0.06% v/ v.

7. Cuantificación y visualización de la regeneración RPE mediante scripts RpEGEN

  1. Instale y prepare scripts RpEGEN.
    1. Descargue los últimos scripts rpEGEN del repositorio de GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) haciendo clic en Code | Descargar ZIP.
    2. Descomprima la carpeta y colóquela en la ubicación del espacio de trabajo deseada (por ejemplo, Escritorio).
    3. Abra MATLAB.
    4. Desplácese hasta la carpeta RpEGEN en el panel Carpeta actual (normalmente en el lado izquierdo).
    5. Haga clic derecho en la carpeta RpEGEN y elija Agregar a la ruta | Carpetas y subcarpetas seleccionadas. Esto agrega la carpeta a la ruta de MATLAB para que pueda buscar y ejecutar automáticamente cualquier script de la carpeta.
    6. Haga doble clic en la carpeta RpEGEN en el panel Carpeta actual para mostrar todas las subcarpetas y los archivos M.
    7. Haga doble clic en el archivo RpEGEN.m para abrirlo en el panel Editor .
    8. En la sección VARIABLES DEFINIDAS POR EL USUARIO del archivo RpEGEN.m, escriba las ubicaciones de directorio de las carpetas que contienen los archivos ROI (.roi), los archivos de imagen (.tif) y dónde se deben guardar los archivos de salida. Introduzca el nombre del grupo para el archivo .mat que se va a exportar (por ejemplo, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, etc.) y la ubicación del canal de campo brillante en la pila de imágenes TIF (por ejemplo, 3, si brightfield es el tercer canal de una pila de imágenes). Si el archivo de imagen solo contiene la imagen de campo brillante, entonces esto debe ser igual a 1.
  2. Ejecute el script RpEGEN.m y valide los resultados.
    NOTA: RpEGEN requiere que image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox y Statistics and Machine Learning Toolbox estén activados en la licencia de MATLAB de usuario para poder ejecutarse. Además, se requiere la caja de herramientas ReadImageJROI33 disponible gratuitamente para importar FIYI ROIs a MATLAB; sin embargo, se proporciona en la carpeta RpEGEN junto con otros archivos de función M que no requieren ninguna activación.
    1. Ejecute el script haciendo clic en el botón Ejecutar del menú Editor en la parte superior de MATLAB.
      NOTA: Una vez iniciado, la ventana Comando proporcionará un resultado detallado que indica la progresión del script. Después de guardar el archivo MAT que contiene los datos extraídos, aparecerá una figura de tres paneles y se guardará como PDF en el directorio de salida para cada ejecución de imagen. Estas son cifras de control de calidad (QC) para asegurarse de que todo se haya ejecutado correctamente e incluyen: 1) la imagen de campo brillante superpuesta por el ROI (Figura 4A); 2) el ROI con la línea central y la distancia angular asociada (grados) (Figura 4G); y 3) el ROI con los valores de intensidad de la mediana de la línea central (0-255, escala de color de 8 bits) (Figura 4H). Espere hasta que los PDF de control de calidad se hayan guardado en la carpeta de salida y la última figura haya desaparecido antes de continuar con el siguiente paso.
    2. Abra los pdf individuales exportados a la carpeta de salida en cualquier visor de PDF y verifique que todos los ROI coincidan con las imágenes de campo brillante, que los valores de la línea central sean aproximaciones razonables del centro de los ROI y que los valores de intensidad media estén debidamente rellenados con datos (es decir, no todos el mismo valor en toda la línea central).
      NOTA: Una descripción detallada y la estructura de cada variable guardada en el archivo MAT por RpEGEN.m se puede encontrar en la Tabla 1.
  3. Ejecute el script RpEGEN_PermPlot.m.
    NOTA: El script RpEGEN_PermPlot.m utiliza la salida de RpEGEN.m para ejecutar comparaciones estadísticas utilizando una simulación de permutación de las medianas de dos grupos y también proporciona el código para reproducir las gráficas de este documento utilizando la caja de herramientas GRAMM34 disponible gratuitamente, que también se ha incluido en la carpeta RpEGEN.
    1. Haga doble clic en el archivo RpEGEN_PermPlot.m para abrirlo en una nueva pestaña del Editor .
    2. En la SECCIÓN 1 - VARIABLES DEFINIDAS POR EL USUARIO en el archivo RpEGEN_PermPlot.m, ingrese la ubicación del directorio para la carpeta de salida que contiene los archivos MAT de la ejecución de RpEGEN.m e ingrese cada nombre de archivo MAT que se cargará (por ejemplo, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Ejecute esta sección del script haciendo clic en el botón Ejecutar sección en el menú Editor en la parte superior de MATLAB.
    4. En la Sección 2, ingrese los nombres de los dos grupos para la comparación estadística en el data_A y data_B variables (estos son los grupos de los cuales se derivarán las medianas utilizando la simulación de permutación). En la variable bin_sz , especifique el número de grados sobre los que se integrarán los valores de intensidad media de los conjuntos de datos (el valor predeterminado es bins de 1 grado).
      NOTA: La variable reps indica el número de permutaciones que se deben usar para construir una distribución de probabilidad y se puede establecer en cualquier número (el valor predeterminado es 20,000). En general, un mayor número de repeticiones será estadísticamente más robusto, pero aumentará el tiempo de procesamiento.
    5. Ejecute esta sección del script haciendo clic en el botón Ejecutar sección en el menú Editor en la parte superior de MATLAB. Esta sección puede tardar algún tiempo en completarse en función del número de repeticiones especificadas, pero proporciona una actualización continua del estado en la ventana de comandos.
    6. Ejecute las secciones FIGURA DE MAPA DE CALOR y RESULTADOS DE GRUPO Y VALORES P de forma independiente mediante el botón Ejecutar sección . Edite variables de datos en cualquier sección comentada con "ENTER DATA HERE". Los PDF de estas figuras se guardan automáticamente para cada uno y se pueden modificar fácilmente en cualquier software vectorial de posprocesamiento.
      NOTA: Las gráficas generadas en el archivo RpEGEN_PermPlot.m son ad hoc y es probable que requieran modificaciones basadas en los datos específicos de cada usuario y las necesidades de visualización. Sin embargo, las cifras proporcionan una base sólida que se puede individualizar fácilmente utilizando los sitios web de MATLAB y GRAMM.

Resultados

Se sabe que la inhibición de la vía canónica de señalización Wnt perjudica significativamente la regeneración del RPE del pez cebra utilizando el paradigma de ablación genética (rpe65a: nfsB-eGFP) y la metodología de manipulación farmacológica (IWR-1) descrita en el protocolo3. Este experimento se repitió aquí para validar un método automatizado para cuantificar la regeneración de RPE del pez cebra basada en la pigmentación. Los resultados resumidos a continuación abarcar...

Discusión

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el EPR y estudiar los mecanismos de degeneración y regeneración en peces cebra de edad larvaria. Este protocolo también se ha realizado con éxito en peces cebraadultos 3 pero con una caracterización menos extensa, por lo que las larvas son el foco aquí. Los aspectos críticos de esta parte del protocolo (pasos 1-4) incluyen: 1) agregar 1.5x PTU a los embriones antes del inicio de la melanogénesis, 2) descoorizar embriones ...

Divulgaciones

L.L.L. es el coinventor de la patente estadounidense # 9,458,428, que describe un método acelerado para derivar el epitelio pigmentario de la retina a partir de células madre pluripotentes humanas; esto no está relacionado con el contenido de este documento. J.M.G. y G.B.F. no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El trabajo descrito en este documento fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (RO1-EY29410 a J.M.G, y NIH CORE Grant P30-EY08098 al Departamento de Oftalmología); el UpMC Immune Transplant & Therapy Center (a L.L.L. y J.M.G.); y la Cátedra E. Ronald Salvitti en Investigación en Oftalmología (a J.M.G.). Se recibió apoyo adicional de la Beca Wiegand en Oftalmología (a L.L.L), la Fundación Eye & Ear de Pittsburgh, y una subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness, Nueva York, NY. Los autores también desean agradecer a Amanda Platt por la asistencia técnica y al Dr. Hugh Hammer y al personal acuático por su excelente apoyo para el cuidado de los animales.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-well platesFisher Scientific07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific05-539-13Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing penFisher Scientific50-254-51Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %Fisher ScientificBP231Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)Fisher Scientific3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)LabnetI5110A
Fluorescence stereo microscopeZeissAxio Zoom.V16Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-4Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)Fisher ScientificBP117-100Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)Millipore SigmaM3761Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)Millipore SigmaP7629Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol freeFisher ScientificAA433689MChemical waste, proper disposal required
Petri dishesFisher ScientificFB087571210 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)Millipore SigmaP3813Used to make 10 X PBS stock
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Shaking incubatorBenchmarkH2010Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscopeLeicaS9iOr similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forcepsFine Science Tools91150-20Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shakerScilogexSK-D1807-E
Transfer pipetteMillipore SigmaZ1350033.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tosMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlToolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB supportMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

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