JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, transgenik zebra balığı modeli kullanarak retinal pigment epitelini (RPE) genetik olarak ablate etme metodolojisini açıklamaktadır. Farmakolojik bileşikler kullanarak sinyal yolu modülasyonunu içerecek şekilde protokolün uyarlanması kapsamlı bir şekilde detaylandırılmıştır. Pigmentasyona dayalı RPE rejenerasyonunu ölçmek için bir MATLAB platformu geliştirildi ve sunuldu ve tartışıldı.

Özet

Retinal pigment epiteli (RPE) gözün arkasında bulunur ve komşu retinal ve vasküler dokuların sağlığını ve bütünlüğünü korumak için gerekli işlevleri yerine getirir. Günümüzde, küçük yaralanmalarla sınırlı olan memeli RPE'nin sınırlı onarıcı kapasitesi, in vivo RPE rejeneratif süreçlerini anlamadaki ilerlemeyi engellemiştir. Burada, sağlam doku rejenerasyonu yapabilen omurgalı bir model olan zebra balığı kullanılarak in vivo RPE onarımının incelenmesini kolaylaştırmak için ayrıntılı bir metodoloji sağlanmaktadır. Bu protokol, transgenik bir nitroredüktaz / metronidazol (NTR / MTZ) aracılı yaralanma paradigmasını (rpe65a: nfsB-eGFP) tanımlar, bu da MTZ ile 24 saatlik tedaviden sonra RPE'nin merkezi üçte ikisinin ablasyonuna ve ardından doku iyileşmesine neden olur. Larva zebra balığında RPE ablasyonlarına odaklanılmış ve farmakolojik bileşiklerin RPE rejenerasyonu üzerindeki etkilerini test etmek için yöntemler de özetlenmiştir. Pigmentasyona dayalı RPE rejenerasyonunun nicelleştirilmesini otomatikleştirmek için oluşturulan bir MATLAB betiği olan RpEGEN'in oluşturulması ve doğrulanması da tartışılmaktadır. Aktif RPE onarım mekanizmalarının ötesinde, bu protokol, RPE dejenerasyonu ve yaralanma yanıtlarının yanı sıra RPE hasarının diğer hücresel ve moleküler süreçlerin yanı sıra bitişik retinal ve vasküler dokular üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmalara genişletilebilir. Bu zebra balığı sistemi, RPE rejenerasyonunu ve RPE hastalığıyla ilgili mekanizmaları yönlendiren genleri, ağları ve süreçleri tanımlamada, bu bilgiyi memeli sistemlerine ve nihayetinde terapötik gelişime doğru uygulamak için uzun vadeli bir amaç doğrultusunda önemli bir umut vaat etmektedir.

Giriş

Burada açıklanan metodoloji, larva zebra balığı kullanarak retinal pigment epitelini (RPE) genetik olarak ablate etmek için bir protokolü detaylandırmaktadır. RPE gözün arkasına uzanır ve nöral retinanın tabakalaşmış tabakaları ile koroidi oluşturan vaskülatür tabakası arasında bulunur. Trofik destek, fototoksik ışığın emilimi ve görsel döngü proteinlerinin bakımı, RPE'nin bu bitişik dokuların sağlığını ve bütünlüğünü sürdürmek için gerekli olan kritik işlevlerden sadecebirkaçıdır 1. Memeli RPE'sine verilen hasar, lezyonlar küçük olduğunda onarılabilir2; Bununla birlikte, daha büyük yaralanmaların veya ilerleyici dejeneratif hastalıkların maruz kaldığı hasar geri dönüşümsüzdür. İnsanlarda, RPE dejeneratif hastalıkları (örneğin, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve Stargardt hastalığı) kalıcı görme kaybına ve az sayıda tedavi seçeneği ile hastanın yaşam kalitesinin düşmesine neden olur. Memeli RPE'nin kendi kendini onarma yeteneğinin sınırlı olması, RPE rejeneratif süreçleri alanında bir bilgi boşluğu yaratmıştır. Zebra balıklarının birçok farklı doku tipinde sağlam rejeneratif kapasitesi göz önüne alındığında, bu protokol, içsel olarak yenilenen RPE ile ilgili çalışmaları kolaylaştırmak ve bu yanıtı yönlendiren mekanizmaları ortaya çıkarmak için in vivo omurgalı bir sistem kurmak için geliştirilmiştir. Burada özetlenen ablasyon paradigması kullanılarak, kanonik Wnt sinyal yolu3, mTOR yolu4 ve bağışıklık ile ilgili yanıtlar5 , muhtemelen örtüşen işlevlerle RPE rejenerasyonunun kritik mediatörleri olarak tanımlanmıştır.

Bu genetik ablasyon paradigmasında, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebra balığı, RPE arttırıcı elementin kontrolü altında eGFP'ye kaynaşmış bakteri kaynaklı nitroredüktaz (NTR / nfsB) gen 6'yı eksprese eder, rpe65a7. Ablasyon, zebra balığı barındıran sisteme ön ilaç metronidazol (MTZ) eklenerek elde edilir. MTZ'nin nitroredüktaz ile hücre içi aktivasyonu, NTR / nfsB eksprese eden hücrelerde DNA çapraz bağlanması ve apoptoz ile sonuçlanır 8,9. Bu teknoloji, zebra balıklarında retina10,11,12,13 hücrelerini ve diğer dokuları ablate etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır8. Bu elemanlar birlikte, indüklenebilir hücre ablasyon metodolojisinin (NTR / MTZ) 8,9 ve görselleştirme için bir floresan işaretleyicinin (eGFP) hedeflenen ekspresyonunu (rpe65a) sağlar.

RPE14'ün rejeneratif potansiyelini incelemek için kullanılabilecek diğer ilginç in vivo modeller de mevcuttur. Bunlar geniştir ve amfibilerde retinektomi sonrası RPE-retina transdiferansiyasyonunu içerir, burada retinal yeniden büyümeye kaybedilen RPE hücreleri değiştirilir15,16; "Süper şifa" MRL / MpJ fare17'de yaralanma sonrası RPE restorasyonu; ve diğerlerinin yanı sıra spontan RPE ve retinal dejenerasyon18'in bir sıçan modelinde RPE proliferasyonunun eksojen uyarılması. Yetişkin insan RPE kök hücreleri (RPESC'ler)19 gibi in vitro modeller de geliştirilmiştir. Bu modellerin tümü, RPE rejenerasyonu ile ilgili hücresel süreçleri ortaya çıkarmak için çalışan değerli araçlardır (örneğin, proliferasyon, farklılaşma, vb.); Bununla birlikte, zebra balığı, ablasyon sonrası içsel RPE onarımı için kapasitesinde benzersizdir.

Buradaki metodoloji, RPE rejenerasyonunu yönlendiren mekanizmaları anlamaya odaklanmak için yazılmış olsa da, Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) hattı ve bu genetik ablasyon protokolü, RPE apoptozisi, RPE dejenerasyonu ve RPE hasarının bitişik retinal ve vasküler dokular üzerindeki etkisi gibi diğer hücresel süreçleri incelemek için kullanılabilir. Ablasyon protokolü, ilgilenilen sinyal yollarını taramak için uygun bir ön strateji olan farmakolojik manipülasyonu içerecek şekilde de değiştirilebilir. Örneğin, Wnt Yanıt-1 İnhibitörü (IWR-1)20 kullanılarak kanonik Wnt yolunun bloke edilmesinin, RPE rejenerasyonunu bozduğugösterilmiştir 3. Bu, kullanıcılara farmakolojik bir manipülasyon deneyi boyunca rehberlik etmek ve pigmentasyonun geri kazanımına dayalı RPE rejenerasyonunu ölçmek için oluşturulan bir MATLAB komut dosyasını (RpEGEN) doğrulamak için kavram kanıtı olarak hizmet etmek için burada tekrarlandı. Transgenik çizgi ve ablasyon protokolü gibi, RpEGEN komut dosyaları uyarlanabilir ve RPE içindeki diğer belirteçleri / hücresel süreçleri ölçmek için kullanılabilir.

Protokol

Burada özetlenen tüm metodolojiler, Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ile uyumludur.

1. Zebra balığı embriyo toplama işleminden önce hazırlık

  1. Embriyo inkübatörünü 28.5 ° C'ye ayarlayın.
  2. Melanogenez inhibitörü, N-feniltiourea (PTU) 21,22'nin 25x stok çözeltisini hazırlayın. Bu stok çözeltisi ortak bir reçete22'den ölçeklendirilir ve 1x, hacim başına% 0,003 ağırlığa eşittir (% w / v) (örneğin, 0,003 g PTU tozu 100 mL sıvı çözücüye).
    1. Büyük bir 25x PTU stok çözeltisi yapmak için, 1 L arıtılmış deiyonize suya (bundan böyle dH2O olarak anılacaktır) 0,75 g PTU tozu ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ve karıştırma plakası kullanarak oda sıcaklığında (~ 25 ° C) iyice karıştırın. Işıktan korunan 3 aya kadar 4°C'de saklayın.
      NOT: PTU'nun sulu çözeltiye girmesini sağlamak zordur ve gece boyunca uzun süreli karıştırma gerekebilir.
      DİKKAT: PTU tehlikelidir ve yutulmasını, solunmasını ve / veya cilt veya gözlerle temasını önlemek için özen gösterilmelidir. PTU tozu ve burada açıklanan tüm PTU sıvı türevlerinin, devlet ve kurumsal düzenlemelere bağlı olarak kimyasal atık olarak bertaraf edilmesi gerekebilir. Kullanımdan önce varsa uygun PTU atık bertaraf yöntemlerinin onaylanması önerilir.
    2. 1,5x PTU çalışma çözümü (bundan böyle 1,5x PTU olarak anılacaktır) yapmak için, 940 mL zebra balığı muhafaza tesisi suyuna (bundan böyle sistem suyu olarak anılacaktır) 60 mL 25x PTU stok çözeltisi ekleyin. Zebra balığı için optimum su kalitesi parametreleri tanımlanmıştır23 ve su sporları tesislerinde standart su izleme prosedürleri uygulanmalıdır. 1,5x PTU'yu ışıktan korunan 1-2 hafta boyunca 28,5 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu protokol, adım 1.2'de açıklanan PTU konsantrasyonları, çözücüler ve depolama parametreleri kullanılarak rutin olarak gerçekleştirilir. Bir önlem olarak, etkinliği doğrulamak ve sürekli depigmentasyonu doğrulamak için PTU'dayken embriyolar / larvalar her 1-2 günde bir gözlenmelidir. PTU çözünürlüğünde/etkinliğinde azalma olduğundan şüpheleniliyorsa, çözünme ve/veya depolama koşulları optimize edilmelidir.
  3. 100 mL dH2O'ya 0.05 g metilen mavisi tozu ekleyerek bir mantar büyüme inhibitörü olan metilen mavisi% 0.05'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. 4°C'de saklayın.
  4. Elmas uçlu karalama kalemi kullanarak bir cam Pasteur pipetinin konik ucunu keserek embriyo/larva manipülasyonu için pipetler hazırlayın (örneğin, Petri bulaşıkları arasında embriyoları/larvaları hareket ettirmek, floresan taraması sırasında larvaları ayırmak, ötenazi larvalarını fiksasyon için mikrosantrifüj tüplerine toplamak, vb.). Elmas kalemle pipetin çevresini aşındırın ve temiz bir mola vermek için ucunu yavaşça çekin veya çıkarın.
    NOT: Pipetin ağzı, akoryonun içinde kalan bir embriyoyu kesmeden kolayca alabilecek kadar pürüzsüz ve geniş olmalıdır. Alternatif olarak bir ampul çekme transfer pipeti kullanın. Hazırlanan pipetler, embriyo / larva kaybını en aza indirmek için su değişimleri sırasında (dökmek yerine) sıvıyı uzaklaştırmak için de kullanılabilir.
  5. 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın (örneğin; 4 mL'lik 10x PBS'ye 10 mL'lik PFA'lık 10 mL ve 26 mL dH2O'ya 10 mL PFA ekleyin). Işıktan korunan 4 haftaya kadar 4°C'de saklayın.
    DİKKAT: Paraformaldehit tehlikeli bir kimyasaldır ve kimyasal bir duman başlığında kullanılmalı ve uygun şekilde atılmalıdır. Yutulmasını, solunmasını ve / veya cilt veya gözlerle temasını önlemek için özen gösterilmeli ve kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilmelidir.

2. Zebra balığı genetik ablasyon öncesi embriyo toplama ve bakımı (döllenmeden 0-5 gün sonra)

  1. Yetişkin zebra balıklarını daha önce tarif edildiği gibi koruyun 3,4,5. Embriyo toplamadan önceki öğleden sonra / akşam, yetişkin zebra balıklarını yumurtlama için üreme tanklarına ayırın.
  2. Ertesi sabah (döllenmeden 0 gün sonra (dpf)), embriyoları sistem suyunda 10 cm çapında Petri kaplarına toplayın ve opak görünecek ve / veya düzensiz sitoplazma ve başarısız bölünme24 gösterecek olan tüm cansız veya döllenmemiş yumurtaları çıkarın.
    NOT: Normal bölünme ve gelişimsel evreleme olayları, sağlıklı embriyolarda tarif edildiği gibi belirgin olacaktır25. Petri kapları, protokol boyunca dörtte üçü dolu (10 cm çapında bir çanak için ~ 30 mL) tutulmalıdır.
    1. Her Petri kabına iki damla% 0.05 w / v metilen mavisi ekleyin, nazikçe karıştırın ve protokolün geri kalanı için embriyoları 28.5 ° C'de saklayın.
  3. Yaklaşık 6 saat döllenme sonrası (hpf)4,5,26, embriyo Petri kaplarındaki sistem suyunu 1.5x PTU (adım 1.2.2'de yapılan çalışma çözeltisi) ile değiştirin ve metilen mavisini yenileyin.
    NOT: PTU, pigmentasyonun başlamasından önce embriyolara eklenmelidir (yani, 24 hpf'den önce)25, çünkü zaten pigmentli dokular PTU21'in eklenmesiyle pigment çözmez. Bununla birlikte, PTU ile tedavi edilen zebra balığı27,28,29'da göz boyutunun azalması, oküler ve kraniyofasiyal eksikliklerin ve bazı sinyal yollarının bozulmasının (örneğin, tiroid sinyalizasyonu) bildirildiği belirtilmelidir. PTU'nun gelişimsel toksisitesi, PTU ilavesi27,29'un konsantrasyonuna ve zamanlamasına bağlı görünmektedir. PTU etkinliğini doğrulamak için yukarıda belirtildiği gibi (adım 1.2), PTU toksisitesi belirtileri de dikkatle izlenmeli ve şüpheleniliyorsa, PTU ilavesinin çalışma konsantrasyonu ve / veya zamanı optimize edilmelidir.
  4. 2-3 dpf'de, taze yapılmış pronaz çözeltisi kullanarak embriyoları dekoryonatlayın.
    1. Pronazları vorteks yoluyla 2 mg / mL'lik bir konsantrasyonda 1.5x PTU'da çözün.
      DİKKAT: Pronaz çok ince bir toz halinde paketlenmiştir ve tahriş edicidir. Solunmasını ve / veya cilt, göz vb. İle temasını önlemek için önlemler alın.
    2. Yumurtadan çıkmış embriyoları yumurtadan çıkmamış embriyolardan ayırın ve sadece yumurtadan çıkmamış embriyoları pronaz ile tedavi edin.
    3. 1.5x PTU'yu adım 2.4.1'de yapılan 2 mg / mL pronaz çözeltisi ile değiştirin ve yumurtadan çıkmamış embriyolarda nazik ajitasyonla 4-5 dakika bekletin (örneğin, bir masa üstü döndürücü / çalkalayıcı veya manuel döner ile).
    4. Pronaz çözeltisini dökün ve hemen taze 1.5x PTU ile durulayın. 1.5x PTU'yu ampul çekme transfer pipeti ile embriyoların üzerinde nazikçe tritüre edin.
    5. Tüm akoryon kalıntılarını atmak için ikinci bir 1,5x PTU durulamasını tekrarlayın ve ardından bakım için 1,5x PTU'yu doldurun.
      NOT: Embriyolar ayrıca ince uçlu forseps kullanılarak manuel olarak dekoriyonize edilebilir. Bu durumda, koryon kalıntıları çıkarılmalı ve manuel dekoryonasyondan sonra 1.5x PTU yenilenmelidir.
  5. Embriyo / larva sağlığını izleyin ve her 1-2 günde bir 1.5x PTU'yu yenileyin. Embriyolar / larvalar 5 dpf'de ablasyona kadar 1.5x PTU'da tutulur.
    NOT: Adım 2.3 ve 2.4'ün önemi Tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

3. Zebra balığı larvalarının rpe65a:nfsB-eGFP taraması ve retinal pigment epitelinin genetik ablasyonu (döllenmeden 5-6 gün sonra)

  1. 5 dpf'de (ablasyon günü) taze bir 10 mM metronidazol (MTZ) çözeltisi yapın. Bu işlemin tamamlanması 2 saat sürer.
    1. PTU olmadan sistem suyuna MTZ tozu ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca kuvvetli çalkalama (örneğin, dakikada 250 dönüş) ile iyice karıştırın.
    2. 10 mM MTZ solüsyonunu oda sıcaklığında 1 saat daha soğutun ve larvalarla Petri kaplarına eklemeden önce tamamen çözünmesini sağlayın.
      NOT: Floresan taraması ve eGFP + larvalarının ayrılması (adım 3.2), 37 °C ve oda sıcaklığındaki inkübasyonlar sırasında gerçekleştirilebilir.
      DİKKAT: MTZ tehlikelidir ve yutulmasını, solunmasını ve / veya cilt veya gözlerle temasını önlemek için özen gösterilmelidir. MTZ tozu ve burada açıklanan tüm sıvı türevlerinin, devlet ve kurumsal düzenlemelere bağlı olarak kimyasal atık olarak bertaraf edilmesi gerekebilir. Kullanımdan önce varsa, uygun MTZ atık bertaraf yöntemlerinin onaylanması önerilir.
  2. zebra balığı larvalarını rpe65a:nfsB-eGFP transgeni için tarayın.
    1. Larvaları 0.168 g / L trikain (MS-222) ile anestezi yapın ve transgenik (eGFP +) larvaları (Şekil 1) transgenik olmayan (eGFP-) larvalardan 488 nm uyarma lazeri / filtresi ile floresan stereo mikroskop kullanarak ayırın.
      NOT: Trikain, 1.5x PTU ve / veya farmakolojik bileşik çözeltilere eklenmelidir, çünkü larvalar eGFP için taranırken tedaviye daldırılmalıdır. Larvaları trikaine sadece tarama süresince inkübe edin (örneğin; 50 larva içeren tek bir 10 cm'lik Petri kabı için ≤10 dakika).
    2. Trikainsiz taze 1.5x PTU ile doğrudan bir Petri kabına pipet yaparak larvaları hemen uyandırın.
    3. Taramanın tamamlanmasının ardından, eGFP + larvalarını iki Petri kabı grubuna ayırın: MTZ tedavisi almak için bir grup (ablated / MTZ +) ve bir grup unblated (MTZ-) kontrolü olmak.
  3. Retinal pigment epitelini ablate edin.
    1. Kabartılmamış (MTZ-) kontrol kaplarından 1,5x PTU'yu çıkarın ve PTU olmadan tatlı sistem suyu ekleyin.
    2. Ablatlanmış (MTZ +) işlem kaplarından 1,5x PTU'yu çıkarın ve taze yapılmış 10 mM MTZ çözeltisini ekleyin (adım 3.1.).
    3. 10 mM MTZ solüsyonunu tam olarak 24 saat sonra çıkarın (yaralanma sonrası 1 gün (dpi) olarak belirlenmiştir) ve PTU olmadan tatlı sistem suyu ekleyin. MTZ çanaklarında PTU olmadan tatlı sistem suyunu değiştirin. Larvalar, protokolün geri kalanında tekrar PTU'ya maruz kalmayacaktır.
      NOT: Hayvanlar aktif olarak yüzerken larva kaybı olmadan çözelti değişimleri arasında 1,5x PTU'nun (adım 3.3.1 ve 3.3.2) veya 10 mM MTZ'nin (adım 3.3.3) tamamını pipetlemek veya dökmek zor olabilir. Bu durumda, başarılı bir çözüm değişimi sağlamak için PTU'suz sistem suyunun yıkanması (yıkanması) eklenebilir.

4. Genetik ablasyon sonrası larva bakımı (döllenme sonrası 6+ gün)

  1. Larvaları kontrol edin ve ötanaziye kadar (adım 5.6) veya zebra balığı barınma tesisine geri dönene kadar PTU olmadan sistem suyunu günlük olarak doldurun.
  2. Bir stereo mikroskop üzerinde iletilen ışık aydınlatmasını kullanarak 2 dpi (7 dpf) üzerinde in vivo ablasyonun başarısını ve kapsamını izleyin (Şekil 2).

5. Zebra balığı retinal pigment epitel ablasyon protokolüne farmakolojik tedavinin dahil edilmesi

NOT: Daha önce3 kez gerçekleştirildiği gibi, 4 dpf'den başlayan 15 μM IWR-1 veya hacim uyumlu dimetil sülfoksit (DMSO) araç kontrolü ile tedavi, RpEGEN'i test etmek için örnek bir deney olarak burada özetlenmiştir. Konsantrasyonlar ve zaman çizelgeleri farklı farmakolojik bileşiklere göre değişebilir ve doz-yanıt doğrulaması, tedavi süresi, tarama ve farmakolojik manipülasyon çalışmaları için deneysel tasarımın diğer yönleri için öneriler Tartışma bölümünde ele alınmıştır. Görüntü analizi gerekiyorsa 6. ve 7. adımları izleyin.

  1. Embriyoları adım 2'de açıklandığı gibi toplayın ve koruyun. 2 dpf'de embriyoları dekoryonat.
  2. Adım 3.2'de açıklandığı gibi eGFP + larvalarını 4 dpf üzerinde tarayın. Petri kapları yerine, farmakolojik tedavi için eGFP + larvalarını 6 kuyucuk başına n ≤ 10 larva yoğunluğunda 6 kuyucuklu plakalara yerleştirin. Unblated (MTZ-) ve ablatize edilecek larvalar (MTZ +) için ayrı 6 kuyucuklu plakalar belirleyin.
    NOT: eGFP sinyali 4 dpf'de görünür, ancak 5 dpf'deki sinyal yoğunluğundan daha sönük görünür.
  3. 10 mM MTZ çözeltisi ile genetik ablasyondan önce tam 24 saat boyunca 15 μM IWR-1 veya hacim uyumlu DMSO araç kontrolü ile 4 dpf eGFP+ larvasına ön işlem yapın.
    NOT: Genellikle, farmakolojik tedavi deneyleri için çok az bileşik gereklidir. Az miktarda IWR-1 tozunun tartılmasını önlemek için, bu farmakolojik bileşik zaten DMSO çözeltisinde, 25 mM'lik bir konsantrasyonda satın alınır ve tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için varışta daha küçük hacimlere ayrılır.
    1. Gerekli farmakolojik ve araç kontrol tedavilerinin hacmini belirleyin ve buna göre konik tüplere 1.5x PTU aliquot yapın. 6 delikli bir plakanın 5 mL/kuyucuk hacmi önerilir.
    2. 15 μM IWR-1 nihai konsantrasyonu için 1,5x PTU'ya IWR-1 stoğu ekleyin (örneğin, 1,5x PTU'nun 5 mL'si başına 3 μL 25 mM IWR-1). 1,5x PTU'ya eşleşen bir DMSO stok hacmi ekleyin (ör. 1,5x PTU'nun 5 mL'si başına 3 μL ≥ %99,7 DMSO). Burada, bu,% 0.06 hacim / hacim (% v / v) DMSO'luk bir nihai konsantrasyon elde edecektir. Vorteks ile iyice karıştırın ve bileşiklerin çözünmesini görsel olarak onaylayın.
      DİKKAT: DMSO, IBR-1 ve diğer farmakolojik bileşiklerin ve çözücülerin, devlet ve kurumsal düzenlemelere bağlı olarak kimyasal atık olarak atılması gerekebilir. Kullanımdan önce tehlike seviyesinin ve varsa bu bileşikler için uygun atık bertaraf yöntemlerinin doğrulanması önerilir.
    3. 6 delikli plakalarda eGFP + larvalarından 1.5x PTU'yu çıkarın ve 5.3.2. adımdan itibaren taze yapılmış% 0.06 v / v DMSO veya 15 μM IWR-1 tedavilerinden 5 mL / kuyucuk ekleyin.
  4. 5 dpf'de, RPE'yi ablayın. 24 saatlik ön tedaviye (adım 5.3) ek olarak, larvalar 10 mM MTZ ile 24 saatlik genetik ablasyon sırasında ve ablasyon sonrası iyileşme sırasında, fiksasyona kadar (örneğin, 4-9 dpf'den) farmakolojik ve araç kontrol tedavilerine dalmış kalacaktır.
    1. Genetik ablasyon yapmadan 2 saat önce 10 mM MTZ solüsyonu yapın (adım 3.1).
    2. Hem unblated (MTZ-) hem de ablated (MTZ+) 6 delikli plakalar ve PTU (MTZ-) veya 10 mM MTZ çözeltisi (MTZ+) içermeyen tatlı sistem suyunun konik tüplere uygun hacimleri için gerekli farmakolojik ve araç kontrol işlemlerinin hacmini belirleyin. Bu, dört tedavi koşulu sağlayacaktır: 1)% 0.06 v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) % 0.06 v / v DMSO, MTZ +; ve 4) 15 μM IWR-1, MTZ +.
    3. IWR-1 ve DMSO stok çözümlerini adım 5.3.2'de gerçekleştirildiği şekilde ilgili konik tüplere ekleyin. Vorteks ile iyice karıştırın ve bileşiklerin çözünmesini görsel olarak onaylayın.
    4. 1.5x PTU'da (adım 5.3.2) %0.06 v/v DMSO ve 15 μM IWR-1 tedavilerini, belirlenmiş unblated (MTZ-) ve ablated (MTZ+) 6 delikli plakalardan çıkarın ve adım 5.4.3'te yapılan uygun tedavilerle doldurun.
    5. Tam 24 saat sonra 10 mM MTZ çözeltisinde %0,06 v/v DMSO ve 15 μM IWR-1 işlemlerini kesin ve PTU'suz tatlı sistem suyunda arıtmalarla yenileyin. %0,06 v/v DMSO ve 15 μM IWR-1 arıtmalarını, unblated (MTZ-) 6 delikli plaka(lar)da PTU içermeyen tatlı sistem suyunda doldurun.
  5. Adım 4'te belirtildiği gibi ablasyon sonrası larva bakımını takip edin ve PTU'suz sistem suyunda günlük% 0.06 v / v DMSO veya 15 μM IWR-1 işlemlerini yenileyin.
  6. Larvaları 9 dpf (yaş uyumlu MTZ ile muamele edilmiş kardeşler için 4 dpi) üzerinde, hayvanları 0.3 g / L trikain çözeltisine (ölümcül doz aşımı) batırarak en az 20 dakika30 boyunca hızlı soğutma (örneğin, Petri kaplarını buzun üzerine yerleştirin) ile birleştirerek ötenazileştirin. Larvaların, oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da (adım 1.5) 3 saat boyunca dokunmaya ve sabitlemeye yanıt vermediğinden emin olun.
  7. Fiksasyon sonrası larva dokusunu konfokal mikroskopta daha önce 5,31'de ve burada Temsili Sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi işleyin. Adım 6 ve 7'deki analiz, en azından, nükleer işaretleyicinin (örneğin, DAPI) ve parlak alan z-yığını görüntülerinin elde edilmesini gerektirecektir.

6. FIJI'de konfokal mikroskop z-stack görüntü ön işleme (ImageJ)

  1. FIJI 32 kullanarak konfokal mikroskop z-stack görüntülerini içe aktarın vebiçimlendirin.
    1. Biyo-Biçimler İçe Aktarma Seçenekleri'ni kullanarak mikroskop görüntülerini açın, Yığını şu şekilde görüntüle: Köprü ve Renk modu: Gri tonlamalı.
    2. Görüntü | seçerek içe aktarılan mikroskop görüntüsünün maksimum yoğunluk projeksiyonunu oluşturun Yığınlar | Z Projesi. ZProjection penceresinde, Dilimi Başlat ve Dilimi Durdur'u bu görüntünün tüm dilimlerini içerecek şekilde ayarlayın. Örneğin, toplam 18 dilimi olan bir z-yığını için Başlangıç Dilimi: 1 ve Dilimi Durdur: 18 olarak ayarlayın. Projeksiyon Türü: Maksimum Yoğunluk'u seçin ve Tamam'a tıklayın.
    3. Görüntü | seçeneğini belirleyerek maksimum yoğunluk projeksiyon dosyasını 8 bitlik bir görüntüye (zaten değilse) dönüştürün Tip | 8 bit.
    4. Görüntü seçilerek görüntüyü dorsal taraf yukarı ve distal (yani lens) bırakılacak şekilde yeniden | Dönüştürme | Yatay Çevir (son komut için, o görüntü için gereken yönselliğe en uygun seçeneği belirleyin). Çok kanallı bir görüntü için, İşlem Yığını'nda Evet? penceresi, tüm kanalları yeniden yönlendirmek için kullanılır.
      NOT: Bu adım kritiktir, ancak görüntü zaten sırt yukarı, distal sol yöndeyse gerekli değildir. İşleme için doğru yöndelikte gözleri olan görüntüler için Şekil 3A-D ve Şekil 4'e bakın.
    5. Dosya |'i seçerek 8 bit maksimum yoğunluk projeksiyonunu etiketli görüntü dosyası biçimi (TIF) dosyası olarak kaydedin Farklı Kaydet | Tiff....
  2. FIJI kullanarak RPE ilgi alanı (ROI) oluşturun.
    1. Adım 6.1'de açıklandığı gibi oluşturulan 8 bitlik bir TIF görüntüsünü açın. Yatırım getirisi Yöneticisi'ni Analiz Et'i seçerek | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi.
    2. Resim | Kullan RPE'nin apikal tarafının dış sınırlayıcı membranın (OLM) ucuna bitişik olduğu noktaları tanımlamak için DAPI ve parlak alan kanallarını yakınlaştırın ve bunlar arasında geçiş yapın (Şekil 3B', B", D', D"; mavi ok uçları). Bu anatomik dönüm noktasını yatırım getirisi başlangıç noktası olarak kullanın.
    3. Hem DAPI hem de parlak alan görüntü kanallarını ve yakınlaştırma işlevini (Görüntü | kullanarak Poligon Seçimleri aracıyla (FIJI araç çubuğunda) RPE yatırım getirisini oluşturun Zoom) apikal ve bazal RPE sınırlarını tanımlamak için. ROI'nin dorsal ve ventral uçlarını (yani, ROI'nin RPE'nin apikalden bazal tarafına geçtiği yer) köreltmek veya yuvarlamak yerine keskin bir noktaya getirin (Şekil 3B', B", D', D"; macenta çizgileri).
      NOT: Sivri uçlu bir yatırım getirisi ucu oluşturmak, RpEGEN kullanarak uç nokta algılamasını optimize etmek için kritik bir adımdır ve Tartışma bölümünde ele alınmıştır.
    4. YG Yöneticisi'nde Ekle'ye tıklayarak YG'yi ekleyin. YG'yi gerektiği gibi ayarlayın ve YG Yöneticisi'nde Güncelle'ye tıklayın.
    5. Diğer'i seçerek yatırım getirisi dosyasını kaydedin >> | Kurtarmak... ROI Yöneticisi içinde. Eşleşen YG ve TIF görüntü dosyaları için aynı adları kullanın (ör. [dosya adı].tif ve [dosya adı].roi).
  3. Her koşul için 8 bit TIF ve ROI dosyalarını tek bir klasörde birleştirin. Örneğin, DMSO_9dpf klasör, 9 dpf unblated (MTZ-) %0,06 v/v DMSO ile muamele görmüş larva grubu için eşleşen tüm TIF ve ROI dosyalarını içerir.

7. RpEGEN betikleri kullanılarak RPE rejenerasyonunun nicelleştirilmesi ve görselleştirilmesi

  1. RpEGEN komut dosyalarını kurun ve hazırlayın.
    1. GitHub deposundan (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) Kod | tıklayarak en son RpEGEN betiklerini indirin ZIP'i indirin.
    2. Klasörün sıkıştırmasını açın ve istediğiniz çalışma alanı konumuna (ör. Masaüstü) yerleştirin.
    3. MATLAB'ı açın.
    4. Geçerli Klasör bölmesinde (genellikle sol tarafta) RpEGEN klasörüne gidin.
    5. RpEGEN klasörüne sağ tıklayın ve Yola Ekle'yi seçin | Seçili Klasörler ve Alt Klasörler. Bu, klasörü MATLAB yoluna ekler, böylece klasördeki tüm komut dosyalarını otomatik olarak bulabilir ve çalıştırabilir.
    6. Tüm alt klasörleri ve M dosyalarını göstermek için Geçerli Klasör bölmesindeki RpEGEN klasörüne çift tıklayın.
    7. Düzenleyici bölmesinde açmak için RpEGEN.m dosyasına çift tıklayın.
    8. RpEGEN.m dosyasının KULLANICI TANIMLI DEĞİŞKİLER bölümünün altında, yatırım getirisi dosyalarını (.roi), görüntü dosyalarını (.tif) içeren klasörlerin dizin konumlarını ve çıktı dosyalarının kaydedilmesi gereken yerleri girin. Dışa aktarılacak .mat dosyasının grup adını (ör. DMSO_9dpf, DMSO_4dpi vb.) ve TIF görüntü yığınındaki parlak alan kanalının konumunu (ör. parlakalan görüntü yığınındaki üçüncü kanalsa 3) girin. Görüntü dosyası yalnızca parlak alan görüntüsünü içeriyorsa, bu 1'e eşit olmalıdır.
  2. RpEGEN.m komut dosyasını çalıştırın ve sonuçları doğrulayın.
    NOT: RpEGEN, çalışması için Görüntü İşleme Araç Kutusu, Eğri Sığdırma Araç Kutusu ve İstatistik ve Makine Öğrenimi Araç Kutusu'nun kullanıcı MATLAB lisansında etkinleştirilmesini gerektirir. Ek olarak, FIJI YG'lerini MATLAB'a aktarmak için ücretsiz olarak kullanılabilen ReadImageJROI araç kutusu33 gereklidir; ancak, herhangi bir etkinleştirme gerektirmeyen diğer işlev M dosyalarıyla birlikte RpEGEN klasöründe sağlanır.
    1. MATLAB'ın üst kısmındaki Düzenleyici menüsündeki Çalıştır düğmesine tıklayarak komut dosyasını çalıştırın.
      NOT: Başlatıldığında, Komut penceresi komut dosyasının ilerlemesini gösteren ayrıntılı çıktı sağlar. Ayıklanan verileri içeren MAT dosyasını kaydettikten sonra, üç panelli bir şekil görünecek ve her görüntü çalıştırması için çıktı dizinine PDF olarak kaydedilecektir. Bunlar, her şeyin düzgün çalıştığından emin olmak için kalite kontrol (QC) rakamlarıdır ve şunları içerir: 1) YG tarafından üst üste bindirilmiş parlak alan görüntüsü (Şekil 4A); 2) merkez çizgisi ve ilişkili açısal mesafe (derece) ile yatırım getirisi (Şekil 4G); ve 3) merkez çizgisi medyan yoğunluk değerlerine sahip yatırım getirisi (0-255, 8 bit renk ölçeği) (Şekil 4H). Bir sonraki adıma geçmeden önce QC PDF'leri çıktı klasörüne kaydedilene ve son rakam kaybolana kadar bekleyin.
    2. Çıktı klasörüne dışa aktarılan PDF'leri tek tek herhangi bir PDF görüntüleyicide açın ve tüm YG'lerin parlak alan görüntüleriyle eşleştiğini, merkez çizgisi değerlerinin YG'lerin merkezinin makul yaklaşımları olduğunu ve medyan yoğunluk değerlerinin verilerle uygun şekilde doldurulduğunu doğrulayın (yani, tüm merkez çizgisinde aynı değerin tümü değil).
      NOT: RpEGEN.m tarafından MAT dosyasına kaydedilen her değişkenin ayrıntılı bir açıklaması ve yapısı Tablo 1'de bulunabilir.
  3. RpEGEN_PermPlot.m komut dosyasını çalıştırın.
    NOT: RpEGEN_PermPlot.m betiği, iki grubun medyanlarının permütasyon simülasyonunu kullanarak istatistiksel karşılaştırmalar yapmak için RpEGEN.m çıktısını kullanır ve ayrıca RpEGEN klasörüne de dahil edilmiş olan serbestçe kullanılabilen GRAMM araç kutusu34'ü kullanarak bu makaledeki grafikleri yeniden üretmek için kod sağlar.
    1. Yeni bir Düzenleyici sekmesinde açmak için RpEGEN_PermPlot.m dosyasına çift tıklayın.
    2. RpEGEN_PermPlot.m dosyasındaki BÖLÜM 1 - KULLANICI TANIMLI DEĞİŞKİLER altında, RpEGEN.m çalıştıran MAT dosyalarını içeren çıktı klasörünün dizin konumunu girin ve yüklenecek her MAT dosya adını girin (örneğin, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. MATLAB'ın üst kısmındaki Düzenleyici menüsündeki Çalıştır Bölümü'nü tıklatarak komut dosyasının bu bölümünü çalıştırın.
    4. Bölüm 2'de, data_A ve data_B değişkenlerde istatistiksel karşılaştırma için iki grubun adlarını girin (bunlar, permütasyon simülasyonu kullanılarak medyanların türetileceği gruplardır). bin_sz değişkeninde, veri kümeleri için medyan yoğunluk değerlerinin tümleştirileceği derece sayısını girin (varsayılan değer 1 derecelik bölmelerdir).
      NOT: reps değişkeni, bir olasılık dağılımı oluşturmak için kullanılacak permütasyon sayısını gösterir ve herhangi bir sayıya ayarlanabilir (varsayılan değer 20.000'dir). Genel olarak, daha fazla sayıda tekrar istatistiksel olarak daha sağlam olacaktır, ancak işlem süresini artıracaktır.
    5. MATLAB'ın üst kısmındaki Düzenleyici menüsündeki Çalıştır Bölümü'nü tıklatarak komut dosyasının bu bölümünü çalıştırın. Bu bölümün tamamlanması, belirtilen yineleme sayısına bağlı olarak biraz zaman alabilir, ancak komut penceresinde sürekli bir durum güncelleştirmesi sağlar.
    6. HEATMAP FIGURE ve GROUP RESULTS AND P-VALUES bölümlerini Çalıştır Bölümünü kullanarak bağımsız olarak çalıştırın. "VERİLERİ BURAYA GİRİN" ile yorumlanan bölümlerdeki veri değişkenlerini düzenleyin. Bu şekillerin PDF'leri her biri için otomatik olarak kaydedilir ve herhangi bir vektör yazılımı son işleminde kolayca değiştirilebilir.
      NOT: RpEGEN_PermPlot.m dosyasında oluşturulan grafikler geçicidir ve büyük olasılıkla her kullanıcının özel verilerine ve görselleştirme gereksinimlerine göre değişiklikler gerektirecektir. Bununla birlikte, rakamlar hem MATLAB hem de GRAMM web siteleri kullanılarak kolayca kişiselleştirilebilecek sağlam bir temel sağlar.

Sonuçlar

Kanonik Wnt sinyal yolunu inhibe etmenin, protokol3'te açıklanan genetik ablasyon paradigması (rpe65a: nfsB-eGFP) ve farmakolojik manipülasyon metodolojisi (IWR-1) kullanılarak zebra balığı RPE rejenerasyonunu önemli ölçüde bozduğu bilinmektedir. Bu deney, pigmentasyona dayalı zebra balığı RPE rejenerasyonunu ölçmek için otomatik bir yöntemi doğrulamak için burada tekrarlandı. Aşağıda özetlenen sonuçlar, döllenme gününden (0 dpf) RpEGEN kullanarak RPE rejen...

Tartışmalar

Bu protokol, RPE'yi genetik olarak ablate etmek ve larval yaşlı zebra balıklarında dejenerasyon ve rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için metodolojiyi açıklamaktadır. Bu protokol yetişkin zebra balığı3'te de başarıyla gerçekleştirilmiştir, ancak daha az kapsamlı karakterizasyona sahiptir, bu nedenle larvalar burada odak noktasıdır. Protokolün bu bölümünün kritik yönleri (adım 1-4) şunları içerir: 1) melanogenezin başlamasından önce embriyolara 1.5x PTU eklen...

Açıklamalar

L.L.L., insan pluripotent kök hücrelerinden retinal pigment epiteli elde etmek için hızlandırılmış bir yöntemi tanımlayan ABD Patent #9,458,428'in ortak mucididir; bunun buradaki içerikle ilgisi yoktur. J.M.G. ve G.B.F.'nin açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Burada açıklanan çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri (RO1-EY29410'dan J.M.G'ye ve NIH CORE Grant P30-EY08098'den Oftalmoloji Bölümü'ne) tarafından desteklenmiştir; UPMC Bağışıklık Nakli ve Terapi Merkezi (L.L.L. ve J.M.G.'ye); ve E. Ronald Salvitti Oftalmoloji Araştırmaları Kürsüsü (J.M.G.'ye). Wiegand Oftalmoloji Bursu'ndan (L.L.L.'ye), Pittsburgh Göz ve Kulak Vakfı'ndan ve New York, NY'daki Körlüğü Önleme Araştırması'ndan sınırsız bir hibe alındı. Yazarlar ayrıca teknik yardım için Amanda Platt'a ve mükemmel hayvan bakımı desteği için Dr. Hugh Hammer ve su sporları personeline teşekkür etmek istiyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-well platesFisher Scientific07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific05-539-13Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing penFisher Scientific50-254-51Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %Fisher ScientificBP231Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)Fisher Scientific3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)LabnetI5110A
Fluorescence stereo microscopeZeissAxio Zoom.V16Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-4Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)Fisher ScientificBP117-100Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)Millipore SigmaM3761Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)Millipore SigmaP7629Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol freeFisher ScientificAA433689MChemical waste, proper disposal required
Petri dishesFisher ScientificFB087571210 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)Millipore SigmaP3813Used to make 10 X PBS stock
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Shaking incubatorBenchmarkH2010Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscopeLeicaS9iOr similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forcepsFine Science Tools91150-20Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shakerScilogexSK-D1807-E
Transfer pipetteMillipore SigmaZ1350033.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tosMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlToolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB supportMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

Referanslar

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. . Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Hammer, H. S. . Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. . Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. . GitHub - ReadImageJROI Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021)
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 181zebra balretinal pigment epitelinitrored ktazmetronidazolgenetik ablasyonrejenerasyonpigmentasyonfarmakolojik bile iklerRpEGEN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır