JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה להסרה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) באמצעות מודל של דגי זברה מהונדסים. התאמת הפרוטוקול לשילוב אפנון מסלול איתות באמצעות תרכובות פרמקולוגיות מפורטת בהרחבה. פלטפורמת MATLAB לכימות התחדשות RPE המבוססת על פיגמנטציה פותחה והוצגה ונדונה.

Abstract

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) שוכן בחלק האחורי של העין ומבצע פונקציות החיוניות לשמירה על בריאותן ושלמותן של רקמות הרשתית וכלי הדם הסמוכות. נכון לעכשיו, יכולת התיקון המוגבלת של RPE של יונקים, המוגבלת לפציעות קטנות, עיכבה את ההתקדמות להבנת תהליכי התחדשות in vivo RPE. כאן, מתודולוגיה מפורטת מסופקת כדי להקל על המחקר של תיקון in vivo RPE תוך שימוש בדגי הזברה, מודל של בעלי חוליות המסוגל להתחדשות רקמות חזקה. פרוטוקול זה מתאר פרדיגמת פציעה מהונדסת בתיווך ניטרורדוקטאז/מטרונידזול (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), אשר גורמת לאבלציה של שני השלישים המרכזיים של ה-RPE לאחר טיפול של 24 שעות ב-MTZ, עם התאוששות רקמות לאחר מכן. הפוקוס מושם על אבלציות RPE בדגי זברה זחליים ומתווות גם שיטות לבדיקת ההשפעות של תרכובות פרמקולוגיות על התחדשות RPE. כמו כן נדון ביצירה ובאימות של RpEGEN, סקריפט MATLAB שנוצר כדי להפוך את הכימות של התחדשות RPE לאוטומטית המבוססת על פיגמנטציה. מעבר למנגנוני תיקון RPE פעילים, ניתן להרחיב פרוטוקול זה למחקרים על ניוון RPE ותגובות פציעה, כמו גם על ההשפעות של נזקי RPE על רקמות רשתית וכלי דם סמוכות, בין תהליכים תאיים ומולקולריים אחרים. מערכת דגי זברה זו טומנת בחובה הבטחה משמעותית בזיהוי גנים, רשתות ותהליכים המניעים התחדשות RPE ומנגנונים הקשורים למחלות RPE, במטרה ארוכת טווח ליישם ידע זה על מערכות יונקים, ובסופו של דבר, לקראת התפתחות טיפולית.

Introduction

המתודולוגיה המתוארת כאן מפרטת פרוטוקול להפחתה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) תוך שימוש בדגי זברה זחליים. ה-RPE משתרע על גב העין ושוכן בין השכבות המרובדות של הרשתית העצבית לבין שכבת כלי הדם המרכיבה את הכורואיד. תמיכה טרופית, ספיגת אור פוטוטוקסי ושמירה על חלבוני מחזור הראייה הם רק חלק מהפונקציות הקריטיות שה-RPE מבצע, החיוניות לשמירה על הבריאות והשלמות של הרקמות הסמוכות הללו1. נזק ל- RPE של יונקים ניתן לתיקון כאשר הנגעים קטנים2; עם זאת, נזק שנגרם על ידי פציעות גדולות יותר או מחלה ניוונית מתקדמת הוא בלתי הפיך. בבני אדם, מחלות ניווניות RPE (למשל, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ומחלת סטארגרדט) מובילות לאובדן ראייה קבוע, ועם מעט אפשרויות טיפול זמינות, ירידה באיכות החיים של המטופלים. היכולת המוגבלת של יונקים RPE לתקן את עצמם יצרה פער ידע בתחום התהליכים הרגנרטיביים של RPE. בהתחשב ביכולת ההתחדשות החזקה של דגי הזברה בסוגי רקמות רבים ושונים, פרוטוקול זה פותח כדי להקים מערכת חוליות in vivo כדי להקל על מחקרים על RPE מתחדש במהותו ולחשוף מנגנונים המניעים תגובה זו. באמצעות פרדיגמת האבלציה המתוארת כאן, מסלול האיתות הקנוני Wnt3, מסלול mTOR4 ותגובות הקשורות למערכת החיסון5 זוהו כמתווכים קריטיים של התחדשות RPE, ככל הנראה עם פונקציות חופפות.

בפרדיגמה זו של אבלציה גנטית, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 דגי זברה מבטאים את הגן nitroreductase שמקורו בחיידקים (NTR/nfsB)6 שהתמזג עם eGFP תחת שליטה של אלמנט משפר RPE, rpe65a7. אבלציה מושגת על ידי הוספת הפרודרוג, metronidazole (MTZ), למערכת מים המאכלסת דגי זברה. הפעלה תוך-תאית של MTZ על-ידי ניטרו-רדוקטאז גורמת להצלבת דנ"א ולאפופטוזיס בתאים המבטאים NTR/nfsB 8,9. טכנולוגיה זו נמצאת בשימוש נרחב בדגי זברה כדי לנטרל תאים של הרשתית 10,11,12,13 ורקמות אחרות 8. יחד, רכיבים אלה מאפשרים ביטוי ממוקד (rpe65a) של מתודולוגיית אבלציה של תאים אינדוקטיביים (NTR/MTZ)8,9 וסמן פלואורסצנטי (eGFP) להדמיה.

קיימים גם מודלים מעניינים אחרים של in vivo שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הפוטנציאל הרגנרטיבי של RPE14. אלה הם רחבים וכוללים טרנסדיפרנציה של RPE לרשתית לאחר כריתת רטין בדו-חיים, שבה תאי RPE שאבדו לצמיחה מחדש של הרשתית מוחלפיםב-15,16; שחזור RPE לאחר פציעה בעכבר MRL /MpJ "סופר מרפא"17; וגירוי אקסוגני של התפשטות RPE במודל חולדות של RPE ספונטני וניוון רשתית18, בין היתר. כמו כן פותחו מודלים במבחנה, כגון תאי גזע RPE אנושיים בוגרים (RPESCs)19. מודלים אלה הם כולם כלים חשובים הפועלים לחשיפת התהליכים התאיים הקשורים להתחדשות RPE (למשל, התפשטות, התמיינות וכו '); עם זאת, דג הזברה הוא ייחודי ביכולתו לתקן RPE פנימי לאחר אבלציה.

בעוד שהמתודולוגיה כאן נכתבה כדי להתמקד בהבנת המנגנונים המניעים את התחדשות ה-RPE, ניתן להשתמש בקו Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) ובפרוטוקול אבלציה גנטי זה כדי לחקור תהליכים תאיים אחרים כגון אפופטוזיס RPE, ניוון RPE והשפעת פגיעה ב-RPE על רקמות רשתית וכלי דם סמוכות. ניתן גם לשנות את פרוטוקול האבלציה כך שיכלול מניפולציה פרמקולוגית, שהיא אסטרטגיה ראשונית נוחה לסינון מסלולי איתות מעניינים. לדוגמה, חסימת מסלול Wnt הקנוני באמצעות מעכב של Wnt Response-1 (IWR-1)20, הוכחה כפגיעה בהתחדשות RPE3. זה חזר על עצמו כאן כדי להדריך משתמשים בניסוי מניפולציה פרמקולוגית ולשמש הוכחת היתכנות לאימות סקריפט MATLAB (RpEGEN) שנוצר כדי לכמת התחדשות RPE בהתבסס על שחזור של פיגמנטציה. בדומה לקו המהונדס ולפרוטוקול האבלציה, סקריפטי RpEGEN ניתנים להתאמה וניתן להשתמש בהם כדי לכמת סמנים/תהליכים תאיים אחרים בתוך ה-RPE.

Protocol

כל המתודולוגיות המפורטות כאן תואמות את הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת פיטסבורג.

1. הכנה לפני איסוף עוברים של דגי זברה

  1. הגדר את חממת העוברים ל-28.5 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו תמיסת מלאי פי 25 של מעכב המלנוגנזה, N-פנילתיאוריאה (PTU)21,22. תמיסת מלאי זו משתנה ממתכון נפוץ22 ו-1x שווה ל-0.003% משקל לנפח (% w/v) (לדוגמה, 0.003 גרם אבקת PTU ל-100 מ"ל של ממס נוזלי).
    1. כדי ליצור תמיסת PTU גדולה של 25x, הוסיפו 0.75 גרם של אבקת PTU ל-1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה מטוהרים (להלן dH2O) וערבבו היטב בטמפרטורת החדר (כ-25 מעלות צלזיוס) באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לתקופה של עד 3 חודשים מוגנים מפני אור.
      הערה: קשה לגרום ל- PTU להיכנס לתמיסה מימית וייתכן שיהיה צורך בערבוב ממושך בן לילה.
      אזהרה: PTU הוא מסוכן, ויש להקפיד על מניעת בליעה, שאיפה ו/או מגע עם העור או העיניים. אבקת PTU וכל הנגזרות הנוזליות של PTU המתוארות כאן עשויות להיות מסולקות כפסולת כימית בהתאם לתקנות המדינה והמוסדיים. אישור על שיטות סילוק פסולת PTU נאותות, אם בכלל, מומלץ לפני השימוש.
    2. כדי ליצור תמיסת עבודה של 1.5x PTU (להלן 1.5x PTU), הוסיפו 60 מ"ל של תמיסת מלאי PTU של 25x ל-940 מ"ל של מי מתקן לשיכון דגי זברה (להלן מי מערכת). תוארו23 פרמטרים אופטימליים לאיכות המים עבור דגי זברה, ומתקנים ימיים צריכים לכלול נהלי ניטור מים סטנדרטיים. אחסן 1.5x PTU בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך שבוע-שבועיים מוגן מפני אור.
      הערה: פרוטוקול זה מבוצע באופן שגרתי באמצעות ריכוזי PTU, ממסים ופרמטרים של אחסון המתוארים בשלב 1.2. כאמצעי זהירות, יש לצפות בעוברים/זחלים כל 1-2 ימים בזמן שהם נמצאים ב-PTU כדי לאמת את היעילות ולאשר דפיגמנטציה מתמשכת. יש לייעל את תנאי הפירוק ו/או האחסון אם יש חשד לירידה במסיסות/יעילות PTU.
  3. הכינו תמיסת מלאי של 0.05% w/v מתילן כחול, מעכב גדילה פטרייתי, על ידי הוספת 0.05 גרם של אבקת מתילן כחולה ל-100 מ"ל של dH2O. ערבבו היטב באמצעות מוט ערבוב וערבוב צלחת. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. הכינו פיפטות למניפולציה של עוברים/זחלים (למשל, הזזת עוברים/זחלים בין צלחות פטרי, הפרדת זחלים במהלך סריקה פלואורסצנטית, איסוף זחלים מורדמים לצינורות מיקרוצנטריפוגה לקיבוע וכו') על ידי חיתוך הקצה המחודד של פיפטת פסטר זכוכית באמצעות עט שרבוט קצה יהלום. חרטו סביב היקף הפיפטה עם עט היהלומים ומשכו או הצמדו בעדינות את הקצה כדי לבצע הפסקה נקייה.
    הערה: הפה של הפיפטה צריך להיות חלק ורחב מספיק כדי לקלוט בקלות עובר שעדיין נמצא בתוך המקהלה מבלי לגזוז. השתמש בפיפטת העברת משיכה של נורה כחלופה. פיפטות מוכנות יכולות לשמש גם להסרת נוזלים במהלך החלפת מים (במקום לשפוך) כדי למזער את אובדן העובר/זחל.
  5. הכינו תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-1x תמיסת מלח ביציאת פוספט (PBS) (למשל, הוסיפו 10 מ"ל של 16% PFA ל-4 מ"ל של 10x PBS ו-26 מ"ל של dH2O). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות מוגנים מפני אור.
    אזהרה: Paraformaldehyde הוא כימיקל מסוכן ויש לטפל בו במכסה אדים כימי ולהיפטר ממנו כראוי. יש להקפיד, וללבוש ציוד מגן אישי (PPE), כדי למנוע בליעה, שאיפה ו/או מגע עם העור או העיניים.

2. איסוף ותחזוקה של עוברים של דגי זברה לפני אבלציה גנטית (0-5 ימים לאחר ההפריה)

  1. שמור על דגי זברה בוגרים כפי שתואר קודם לכן 3,4,5. בשעות אחר הצהריים/ערב שלפני איסוף העוברים, מפרידים בין דגי זברה בוגרים למכלי רבייה להשרצה.
  2. למחרת בבוקר (0 ימים לאחר ההפריה (dpf)), לאסוף עוברים לתוך צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ במי המערכת ולהסיר את כל הביציות שאינן ניתנות להשגה או לא מופרות, אשר ייראו אטומות ו/או יציגו ציטופלסמה לא סדירה וביקוע כושל24.
    הערה: אירועי ביקוע והיערכות התפתחותית תקינים יתבררו בעוברים בריאים כמתואר25. יש לשמור על צלחות פטרי מלאות בשלושה רבעים (כ-30 מ"ל למנה בקוטר 10 ס"מ) לאורך כל הפרוטוקול.
    1. מוסיפים שתי טיפות של 0.05% w/v מתילן כחול לכל צלחת פטרי, מערבבים בעדינות ומאחסנים עוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך שארית הפרוטוקול.
  3. כ-6 שעות לאחר הפריה (hpf) 4,5,26, החליפו את מי המערכת בצלחות פטרי עובריות ב-1.5x PTU (תמיסת עבודה שנעשתה בשלב 1.2.2) ומלאו מחדש את מתילן בכחול.
    הערה: יש להוסיף PTU לעוברים לפני הופעת הפיגמנטציה (כלומר, לפני 24 כ"ס)25 מכיוון שרקמות פיגמנטיות שכבר אינן מתפרקות עם הוספת PTU21. עם זאת, יש לציין כי ירידה בגודל העיניים, ליקויים בעיניים ובקרניופציאליים, ושיבושים של מסלולי איתות מסוימים (למשל, איתות בלוטת התריס) דווחו בדגי זברה שטופלו ב-PTU 27,28,29. נראה כי הרעילות ההתפתחותית של PTU תלויה בריכוז ובתזמון של תוספת PTU27,29. כפי שצוין לעיל לצורך אימות יעילות PTU (שלב 1.2), יש גם לעקוב בקפידה אחר סימנים של רעילות PTU, ואם יש לחשוד, יש לייעל את ריכוז העבודה ו/או את זמן הוספת ה-PTU.
  4. על 2-3 dpf, dechorionate עוברים באמצעות תמיסת פרונאז טרי.
    1. ממיסים את הפרונאז ב-1.5x PTU בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל על ידי מערבולת.
      אזהרה: Pronase ארוז כאבקה עדינה מאוד והוא מגרה. יש לנקוט באמצעים למניעת שאיפה ו/או מגע עם העור, העיניים וכו'.
    2. הפרד את העוברים הבוקעים מעוברים שלא נקעו, וטפל רק בעוברים שלא נקעו.
    3. החלף 1.5x PTU בתמיסת פרונאז של 2 מ"ג/מ"ל המיוצרת בשלב 2.4.1 והשאר על עוברים לא מרוסקים למשך 4-5 דקות עם תסיסה עדינה (למשל, על רוטציה/שייקר שולחנית או על ידי מערבולת ידנית).
    4. יוצקים את תמיסת הפרונאז ושוטפים מיד עם PTU טרי של 1.5x. טריטורציה עדינה של 1.5x PTU לשטוף את העוברים עם פיפטת העברת נורה למשוך.
    5. חזור על שטיפת PTU שנייה של 1.5x כדי להשליך את כל פסולת הכוריאון, ולאחר מכן מלא 1.5x PTU לצורך תחזוקה.
      הערה: ניתן גם להפריד את העוברים באופן ידני באמצעות מלקחיים עדינים. במקרה זה, יש להסיר פסולת כוריון ולחדש 1.5x PTU לאחר dechorionation ידני.
  5. עקוב אחר בריאות העובר/הזחל ומלא את מלאי ה-PTU פי 1.5 כל 1-2 ימים. עוברים/זחלים נשמרים ב-PTU פי 1.5 עד אבלציה ב-5 dpf.
    הערה: החשיבות של שלבים 2.3 ו- 2.4 מטופלת בהמשך בסעיף הדיון.

3. בדיקת זחלי דגי זברה עבור rpe65a:nfsB-eGFP ובלציה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (5-6 ימים לאחר ההפריה)

  1. הכינו תמיסה טרייה של 10 mM metronidazole (MTZ) ב-5 dpf (יום של אבלציה). תהליך זה לוקח 2 שעות להשלים.
    1. הוסיפו אבקת MTZ למי המערכת ללא PTU וערבבו היטב על ידי רעידות נמרצות (למשל, 250 סיבובים לדקה) במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. תמיסת MTZ קירור 10 מ"מ לשעה נוספת בטמפרטורת החדר על מסובב/שייקר שולחני ותבטיחו פירוק מלא לפני הוספת כלי פטרי עם זחלים.
      הערה: סינון פלואורסצנטי והפרדת זחלי eGFP+ (שלב 3.2) יכולים להתבצע במהלך דגירות של 37 מעלות צלזיוס וטמפרטורת החדר.
      אזהרה: MTZ הוא מסוכן, ויש להקפיד על מניעת בליעה, שאיפה ו/או מגע עם העור או העיניים. ייתכן שיהיה צורך להשליך את אבקת MTZ ואת כל נגזרות הנוזלים המתוארות כאן כפסולת כימית בהתאם לתקנות המדינה והמוסדות. אישור על שיטות סילוק פסולת MTZ מתאימות, אם בכלל, מומלץ לפני השימוש.
  2. זחלי דג זברה מסך עבור rpe65a:nfsB-eGFP טרנסג'ין.
    1. מרדימים זחלים עם 0.168 גרם/ליטר של טריקאין (MS-222) וזחלים מהונדסים נפרדים (eGFP+) (איור 1) מזחלים לא מהונדסים (eGFP-) באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי עם לייזר/מסנן עירור של 488 ננומטר.
      הערה: יש להוסיף טריקאין לתמיסות PTU ו/או תרכובות פרמקולוגיות של 1.5x, שכן הזחלים צריכים להישאר שקועים בטיפול בזמן שהם נבדקים ל-eGFP. דגירה של זחלים בטרקאין רק למשך ההקרנה (למשל, ≤10 דקות לצלחת פטרי אחת בקוטר 10 ס"מ המכילה 50 זחלים).
    2. הזחלים המוקרנים התעוררו מיד על ידי צנרת ישירות לתוך צלחת פטרי עם PTU טרי של 1.5x ללא טריקאין.
    3. עם השלמת ההקרנה, מפרידים עוד יותר את הזחלים eGFP+ לשתי קבוצות של צלחות פטרי: קבוצה אחת שתקבל טיפול MTZ (אבלציה/MTZ+) וקבוצה אחת שתהיה השליטה הבלתי מעורערת (MTZ-).
  3. ביטול אפיתל פיגמנט הרשתית.
    1. יש להסיר 1.5x PTU מכלי הבקרה ללא הפרעה (MTZ-) ולהוסיף מי מערכת מתוקים ללא PTU.
    2. יש להסיר 1.5x PTU ממנות הטיפול באבלציה (MTZ+) ולהוסיף את תמיסת ה-10 mM MTZ הטרייה (שלב 3.1).
    3. הסר את תמיסת MTZ של 10 mM לאחר 24 שעות בדיוק (המיועדת ליום אחד לאחר הפציעה (dpi)) והוסף מים מתוקים למערכת ללא PTU. החליפו את מי המערכת המתוקה ללא PTU ב-MTZ- dish(es). הזחלים לא ייחשפו שוב ל-PTU למשך שארית הפרוטוקול.
      הערה: ייתכן שיהיה קשה לטפטף או לשפוך את כל 1.5x PTU (שלבים 3.3.1 ו- 3.3.2) או 10 mM MTZ (שלב 3.3.3) בין חילופי תמיסות ללא אובדן זחלים מכיוון שבעלי חיים שוחים באופן פעיל מסביב. במקרה זה, ניתן להוסיף שטיפות של מי מערכת ללא PTU כדי להבטיח חילופי פתרונות מוצלחים.

4. תחזוקת הזחל לאחר אבלציה גנטית (6+ ימים לאחר ההפריה)

  1. בדקו את הזחלים וחידשו את מי המערכת ללא PTU מדי יום עד להמתת חסד (שלב 5.6) או חזרו למתקן הדיור של דגי הזברה.
  2. עקוב אחר ההצלחה וההיקף של אבלציה in vivo ב- 2 dpi (7 dpf) באמצעות תאורת אור המועברת במיקרוסקופ סטריאו (איור 2).

5. שילוב טיפול תרופתי בפרוטוקול אבלציה של פיגמנט הרשתית של דגי זברה

הערה: כפי שבוצע בעבר3, טיפול בבקרת רכב 15 μM IWR-1 או דימתיל סולפוקסיד (DMSO) תואמת נפח המתחילה ב- 4 dpf מתואר כאן כניסוי לדוגמה לבדיקת RpEGEN. הריכוזים ולוחות הזמנים עשויים להשתנות עם תרכובות פרמקולוגיות שונות והמלצות לאימות מינון-תגובה, משך הטיפול, הקרנה והיבטים אחרים של תכנון ניסיוני למחקרי מניפולציה פרמקולוגית מטופלות בפרק הדיון. בצע את השלבים 6 ו- 7 אם נדרש ניתוח תמונה.

  1. לאסוף ולתחזק עוברים כמתואר בשלב 2. נקה עוברים על 2 dpf.
  2. זחלי eGFP+ מסך על 4 dpf כמתואר בשלב 3.2. במקום צלחות פטרי, הכניסו את הזחלים eGFP+ לתוך צלחות של 6 בארות בצפיפות של n ≤ 10 זחלים לכל 6-באר לטיפול תרופתי. ייעדו לוחות נפרדים בני 6 בארות לזחלים שלא יבוטלו (MTZ-) וזחלים שיהיו אבלים (MTZ+).
    הערה: האות eGFP נראה ב- 4 dpf אך נראה עמום יותר מעוצמת האות ב- 5 dpf.
  3. Pretreat 4 dpf eGFP+ זחלים עם 15 μM IWR-1 או בקרת רכב DMSO תואמת נפח במשך 24 שעות בדיוק לפני אבלציה גנטית עם תמיסת MTZ 10 mM.
    הערה: לעתים קרובות, מעט מאוד תרכובת נדרשת לניסויים טיפוליים פרמקולוגיים. כדי להימנע משקולת כמויות קטנות של אבקת IWR-1, תרכובת פרמקולוגית זו נרכשת כבר בתמיסת DMSO, בריכוז של 25 מ"מ, ומועברת לנפחים קטנים יותר עם ההגעה כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
    1. קבעו את נפח הטיפולים הפרמקולוגיים והבקרה ברכב הדרושים והכניסו 1.5x PTU לצינורות חרוטיים בהתאם. מומלץ להשתמש בנפח של 5 מ"ל/באר של צלחת בעלת 6 בארות.
    2. הוסף מלאי IWR-1 ל- 1.5x PTU לריכוז סופי של 15 μM IWR-1 (לדוגמה, 3 μL של 25 mM IWR-1 לכל 5 מ"ל של 1.5x PTU). הוסף נפח תואם של מלאי DMSO ל- 1.5x PTU (לדוגמה, 3 μL ≥ 99.7% DMSO לכל 5 מ"ל של 1.5x PTU). כאן, זה יניב בסופו של דבר ריכוז סופי של 0.06% נפח / נפח (% v / v) DMSO. מערבבים היטב על ידי מערבולות ומאשרים חזותית פירוק של תרכובות.
      אזהרה: ייתכן שיהיה צורך להיפטר מ-DMSO, IWR-1 ותרכובות וממסים פרמקולוגיים אחרים כפסולת כימית בהתאם לתקנות המדינה והמוסדיים. אישור רמת הסיכון ושיטות פינוי פסולת נאותות לתרכובות אלה, אם ישנן, מומלץ לפני השימוש.
    3. הסר 1.5x PTU מהזחלים eGFP+ בצלחות של 6 בארות והוסף 5 מ"ל / באר של 0.06% v / v DMSO טריים או 15 μM IWR-1 טיפולים משלב 5.3.2.
  4. ב-5 dpf, בטלו את ה-RPE. בנוסף לטיפול המקדים של 24 שעות (שלב 5.3), הזחלים יישארו שקועים בטיפולים פרמקולוגיים ובקרת כלי רכב במהלך 24 שעות של אבלציה גנטית עם 10 mM MTZ ובמהלך התאוששות לאחר אבלציה, עד לקיבוע (למשל, מ-4-9 dpf).
    1. צור תמיסת MTZ של 10 mM 2 שעות לפני ביצוע אבלציה גנטית (שלב 3.1).
    2. קבעו את נפח הטיפולים הפרמקולוגיים והבקרה ברכב הדרושים הן עבור לוחות 6-בארות ללא ספיגה (MTZ-) והן עבור לוחות 6-בארות (MTZ+) ונפחים מתאימים של מי מערכת מתוקים ללא PTU (MTZ-) או תמיסת MTZ של 10 mM MTZ (MTZ+) לתוך צינורות חרוטיים. זה יניב ארבעה מצבי טיפול: 1) 0.06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 מיקרומטר IWR-1, MTZ-; 3) 0.06% v/v DMSO, MTZ+; ו-4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. הוסף פתרונות מלאי IWR-1 ו- DMSO לצינורות החרוטיים המתאימים כפי שבוצעו בשלב 5.3.2. מערבבים היטב על ידי מערבולות ומאשרים חזותית פירוק של תרכובות.
    4. הסר 0.06% v/v DMSO ו-15 μM IWR-1 טיפולים ב-1.5x PTU (שלב 5.3.2) מצלחות ייעודיות ללא הפרעה (MTZ-) ו-Ablated (MTZ+) 6-well וחדש עם הטיפולים המתאימים שנעשו בשלב 5.4.3.
    5. הסר 0.06% v/v DMSO ו- 15 μM IWR-1 טיפולים בתמיסת 10 mM MTZ לאחר 24 שעות בדיוק ומלא את חידוש הטיפולים במים מתוקים של המערכת ללא PTU. מלאו 0.06% v/v טיפולים ב-DMSO ו-15 μM IWR-1 במים מתוקים של המערכת ללא PTU על צלחות הבאר (MTZ-) הבלתי מעורערות (MTZ-) בעלות 6 הבארות.
  5. עקוב אחר תחזוקת הזחל לאחר אבלציה כמתואר בשלב 4 ומלא 0.06% v /v DMSO או 15 μM IWR-1 טיפולים מדי יום במי מערכת ללא PTU.
  6. המתת זחלים על 9 dpf (4 dpi עבור אחים שטופלו ב-MTZ המותאם לגיל) על ידי טבילת בעלי חיים בתמיסת טריקאין 0.3 גרם/ל' (מנת יתר קטלנית) יחד עם צינון מהיר (למשל, הניחו צלחות פטרי על קרח) למשך 20 דקות לפחות30 דקות. בדוק כדי לוודא שהזחלים אינם מגיבים למגע ולתקן ב-4% PFA (שלב 1.5) למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  7. לעבד רקמת זחל לאחר קיבוע לרכישת תמונה z-stack במיקרוסקופ קונפוקלי כפי שתואר קודם לכן 5,31 וכאן בסעיף תוצאות מייצגות. ניתוח בשלבים 6 ו-7 ידרוש, לכל הפחות, רכישה של סמן גרעיני (לדוגמה, DAPI) ותמונות z-stack של Brightfield.

6. מיקרוסקופ קונפוקלי z-stack עיבוד תמונה מקדים בפיג'י (ImageJ)

  1. ייבוא ועיצוב תמונות z-stack של מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות FIJI32.
    1. פתח תמונות מיקרוסקופ באמצעות אפשרויות ייבוא ביו-פורמטים המוגדרות לתצוגת מחסנית עם: מצב Hyperstack ו - Color: גווני אפור.
    2. צור הקרנה בעוצמה מרבית של תמונת המיקרוסקופ המיובאת על ידי בחירה בתמונה | ערימות | פרויקט Z. בחלון ZProjection , הגדר התחל פרוסה ו-Stop Slice כך שיכללו את כל הפרוסות עבור תמונה זו. לדוגמה, הגדר התחל פרוסה: 1 ו - Stop Slice: 18 עבור מחסנית z הכוללת בסך הכל 18 פרוסות. בחר סוג הקרנה: עוצמה מרבית ולחץ על אישור.
    3. המרת קובץ ההקרנה בעוצמה המרבית לתמונה של 8 סיביות (אם עדיין לא כבר) על-ידי בחירה בתמונה | סוג | 8 סיביות.
    4. כיוון מחדש את התמונה כך שהצד הגבי יהיה למעלה ודיסטלי (כלומר, העדשה) יישאר על ידי בחירה בתמונה | שינוי | הפוך אופקית (עבור הפקודה האחרונה, בחר את האפשרות המתאימה ביותר לכיווניות הדרושה לתמונה זו). לקבלת תמונה רב-ערוצית, לחץ על כן במחסנית התהליכים? חלון כדי לכוון מחדש את כל הערוצים.
      הערה: שלב זה הוא קריטי, אך אינו נחוץ אם התמונה כבר נמצאת בכיוון הגב למעלה, הדיסטלי השמאלי הדיסטלי. ראו איור 3A-D ואיור 4 לתמונות עם עיניים בכיוון הנכון לעיבוד.
    5. שמור את ההקרנה בעוצמה המרבית של 8 סיביות כקובץ בתבנית קובץ תמונה מתויגת (TIF) על-ידי בחירה בקובץ | שמור כ| טיף....
  2. צור אזור עניין RPE (ROI) באמצעות FIJI.
    1. פתח תמונת TIF של 8 סיביות שנוצרה כמתואר בשלב 6.1. התחל את מנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי בחירה באפשרות נתח | כלים | מנהל החזר ההשקעה.
    2. שימוש | תמונה התקרבו והתחלפו בין תעלות ה-DAPI לתעלות השדה הבהיר כדי לזהות את הנקודות שבהן הצד האפי של ה-RPE צמוד לקצה הממברנה המגבילה החיצונית (OLM) (איור 3B', B", D', D"; ראשי חץ כחולים). השתמש בנקודת ציון אנטומית זו כנקודת ההתחלה של החזר ההשקעה.
    3. צור את החזר ההשקעה של RPE באמצעות הכלי בחירות מצולעים (בסרגל הכלים של FIJI) באמצעות ערוצי התמונה DAPI ו- Brightfield ופונקציית הזום (תמונה | Zoom) לזיהוי גבולות RPE אפיים ובסיסיים. הביאו את הקצוות הגביים והגחוניים של ההחזר על ההשקעה (כלומר, כאשר ההחזר על ההשקעה עובר מהצד האפי לבסיסי של ה-RPE) לנקודה חדה במקום להקהות או לעגל (איור 3B', B", D', D', D"; קווי מג'נטה).
      הערה: יצירת קצה ROI מחודד היא שלב קריטי למיטוב זיהוי נקודות הקצה באמצעות RpEGEN והיא מטופלת במקטע הדיון.
    4. הוסף את ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על הוסף את מנהל ההחזר על ההשקעה. התאם את ההחזר על ההשקעה לפי הצורך ולחץ על עדכן במנהל ההחזר על ההשקעה.
    5. שמור את קובץ ההחזר על ההשקעה על-ידי בחירה באפשרות 'עוד>> | שמר... בתוך מנהל ההחזר על ההשקעה. השתמש בשמות זהים עבור קבצי תמונה תואמים של ROI ו- TIF (לדוגמה, [שם הקובץ].tif ו-[שם הקובץ].roi).
  3. שלב קבצי TIF ו- ROI של 8 סיביות עבור כל תנאי בתיקיה אחת. לדוגמה, התיקיה, DMSO_9dpf, תכיל את כל קבצי ה- TIF וה- ROI התואמים עבור קבוצת הזחלים 9 dpf ללא הבחנה (MTZ-) 0.06% v/v שטופלה ב- DMSO.

7. כימות והדמיה של התחדשות RPE באמצעות סקריפטים של RpEGEN

  1. התקן והכן סקריפטים של RpEGEN.
    1. הורד את הסקריפטים האחרונים של RpEGEN ממאגר GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) על ידי לחיצה על קוד | הורד את ZIP.
    2. פתח את התיקיה והצב אותה במיקום הרצוי של סביבת העבודה (לדוגמה, שולחן עבודה).
    3. פתח את MATLAB.
    4. נווט אל התיקיה RpEGEN בחלונית התיקיה הנוכחית (בדרך כלל בצד שמאל).
    5. לחץ לחיצה ימנית על התיקיה RpEGEN ובחר הוסף לנתיב | תיקיות ותיקיות משנה נבחרות. פעולה זו מוסיפה את התיקיה לנתיב MATLAB כך שהיא יכולה למצוא ולהפעיל באופן אוטומטי את כל קבצי ה- Script בתיקייה.
    6. לחץ פעמיים על התיקיה RpEGEN בחלונית התיקיה הנוכחית כדי להציג את כל תיקיות המשנה וקבצי M.
    7. לחץ פעמיים על הקובץ RpEGEN.m כדי לפתוח בחלונית העורך .
    8. תחת המקטע משתנים המוגדרים על-ידי המשתמש בקובץ RpEGEN.m, הזן את מיקומי הספריות עבור התיקיות המכילות את קבצי ההחזר על ההשקעה ( .roi ), קבצי התמונה (.tif) והיכן יש לשמור קבצי פלט. הזן את שם הקבוצה עבור קובץ ה- .mat לייצוא (לדוגמה, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi וכו ') ואת המיקום של ערוץ brightfield במחסנית התמונות של TIF (לדוגמה, 3, אם brightfield הוא הערוץ השלישי בערימת תמונות). אם קובץ התמונה מכיל רק את תמונת השדה הבהיר, אז זה צריך להיות שווה ל-1.
  2. הפעל את סקריפט RpEGEN.m ואמת את התוצאות.
    הערה: RpEGEN דורש שארגז הכלים לעיבוד תמונה, ארגז הכלים להתאמת עקומה וארגז הכלים לסטטיסטיקה ולמידת מכונה יופעלו ברישיון MATLAB למשתמש כדי לפעול. בנוסף, ארגז הכלים ReadImageJROI הזמין באופן חופשי33 נדרש לייבא FIJI ROIs לתוך MATLAB; עם זאת, הוא מסופק בתיקיית RpEGEN יחד עם קבצי M פונקציה אחרים שאינם דורשים כל הפעלה.
    1. הפעל את הסקריפט על-ידי לחיצה על לחצן הפעלה בתפריט העורך בחלק העליון של MATLAB.
      הערה: לאחר ההפעלה, חלון הפקודה יספק פלט מילולי המציין את התקדמות קובץ ה- Script. לאחר שמירת קובץ MAT המכיל את הנתונים שחולצו, יופיע איור בן שלושה פאנלים וישמר כקובץ PDF בספריית הפלט עבור כל הפעלת תמונה. אלה הם נתוני בקרת איכות (QC) כדי לוודא שהכל פועל כראוי וכוללים: 1) תמונת Brightfield שמעליית ה-ROI (איור 4A); 2) ההחזר על ההשקעה עם קו האמצע והמרחק הזוויתי המשויך (מעלות) (איור 4G); ו-3) ההחזר על ההשקעה עם ערכי העוצמה החציונית של קו האמצע (0-255, סולם צבעים של 8 סיביות) (איור 4H). המתן עד שמסמכי PDF QC יישמרו בתיקיית הפלט והנתון האחרון ייעלם לפני שתמשיך לשלב הבא.
    2. פתחו את מסמכי PDF בודדים המיוצאים לתיקיית הפלט בכל מציג PDF וודאו שכל ה-ROIs תואמים לתמונות הבהירות, שערכי קו האמצע הם קירובים סבירים של מרכז ה-ROIs, ושהערכים בעוצמה החציונית מאוכלסים כראוי בנתונים (כלומר, לא כולם באותו ערך לאורך כל קו האמצע).
      הערה: תיאור ומבנה מפורטים של כל משתנה שנשמר בקובץ MAT על-ידי RpEGEN.m ניתן למצוא בטבלה 1.
  3. הפעל את הסקריפט RpEGEN_PermPlot.m.
    הערה: סקריפט RpEGEN_PermPlot.m משתמש בפלט של RpEGEN.m כדי להריץ השוואות סטטיסטיות באמצעות סימולציית תמורה של החציון של שתי קבוצות וגם מספק את הקוד לשחזור העלילות במאמר זה באמצעות ארגז הכלים GRAMM34 הזמין באופן חופשי, שנכלל גם בתיקיית RpEGEN.
    1. לחץ פעמיים על הקובץ RpEGEN_PermPlot.m כדי לפתוח בכרטיסייה עורך חדש.
    2. תחת סעיף 1 - משתנים המוגדרים על-ידי המשתמש בקובץ RpEGEN_PermPlot.m, הזן את מיקום הספרייה עבור תיקיית הפלט המכילה את קבצי ה- MAT מהפעלת RpEGEN.m והזן כל שם קובץ MAT לטעינה (לדוגמה, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. הפעל מקטע זה של קובץ ה- Script על-ידי לחיצה על לחצן הפעל מקטע בתפריט העורך בחלק העליון של MATLAB.
    4. בסעיף 2, הזן את שמות שתי הקבוצות לצורך השוואה סטטיסטית במשתנים data_A data_B (אלה הקבוצות שמהן ייגזרו החציון באמצעות סימולציית התמורות). במשתנה bin_sz, הזן את מספר המעלות שבהן ניתן לשלב את ערכי העוצמה החציונית עבור מערכי הנתונים (ברירת המחדל היא סלים של מעלה אחת).
      הערה: משתנה החזרות מציין את מספר התמורות שיש להשתמש בהן לבניית התפלגות הסתברות וניתן להגדירו לכל מספר (ערך ברירת המחדל הוא 20,000). באופן כללי, מספר גבוה יותר של חזרות יהיה חזק יותר מבחינה סטטיסטית אך יגדיל את זמן העיבוד.
    5. הפעל מקטע זה של קובץ ה- Script על-ידי לחיצה על לחצן הפעל מקטע בתפריט העורך בחלק העליון של MATLAB. השלמת מקטע זה עשויה להימשך זמן מה בהתאם למספר החזרות שצוינו, אך היא מספקת עדכון מצב רציף בחלון הפקודה.
    6. הפעל את המקטעים 'איור מפת חום' ו'תוצאות קבוצתיות' ו'ערכי P' באופן עצמאי באמצעות לחצן 'הפעל מקטע '. ערוך משתני נתונים בכל מקטעי ההערה עם "הזן נתונים כאן". מסמכי PDF של נתונים אלה נשמרים באופן אוטומטי עבור כל אחד מהם וניתן לשנותם בקלות בכל עיבוד של תוכנה וקטורית לאחר עיבוד.
      הערה: החלקות שנוצרו בקובץ RpEGEN_PermPlot.m הן אד-הוק וסביר להניח שידרשו שינויים בהתבסס על הנתונים הספציפיים של כל משתמש וצרכי ההדמיה. עם זאת, הנתונים מספקים בסיס איתן שניתן להתאים אותו אישית בקלות באמצעות אתרי MATLAB ו-GRAMM.

תוצאות

עיכוב מסלול האיתות הקנוני של Wnt ידוע כפוגע באופן משמעותי בהתחדשות RPE של דגי זברה באמצעות פרדיגמת האבלציה הגנטית (rpe65a:nfsB-eGFP) ומתודולוגיית המניפולציה הפרמקולוגית (IWR-1) המתוארת בפרוטוקול3. ניסוי זה חזר על עצמו כאן כדי לאמת שיטה אוטומטית לכימות התחדשות RPE של דגי זברה המבוססת על...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להפחתה גנטית של ה-RPE וחקר מנגנונים של התנוונות והתחדשות בדגי זברה בגיל הזחל. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה גם בדגי זברה בוגרים3 אך עם אפיון פחות נרחב, ולכן הזחלים הם המוקד כאן. היבטים קריטיים של חלק זה של הפרוטוקול (שלבים 1-4) כוללים: 1) הוספת 1.5x PTU לעוברים לפנ?...

Disclosures

L.L.L. הוא הממציא השותף של פטנט אמריקאי #9,458,428, המתאר שיטה מזורזת להפקת אפיתל פיגמנט רשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים; זה לא קשור לתוכן כאן. ל-J.M.G ול-G.B.F אין מה לחשוף.

Acknowledgements

העבודה המתוארת כאן נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (RO1-EY29410 ל- J.M.G, ומענק הליבה של NIH P30-EY08098 למחלקה לרפואת עיניים); המרכז להשתלות וטיפול חיסוני UPMC (ל- L.L.L. ו- J.M.G.); והקתדרה ע"ש א. רונלד סלוויטי לחקר רפואת עיניים (ל-J.M.G.). תמיכה נוספת התקבלה ממלגת ויגנד ברפואת עיניים (ל-L.L.L), מקרן העין והאוזניים של פיטסבורג, ומענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, ניו יורק, ניו יורק. המחברים רוצים גם להודות לאמנדה פלאט על הסיוע הטכני ולד"ר יו האמר ולצוות האקוואטיקה על תמיכה מצוינת בטיפול בבעלי חיים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-well platesFisher Scientific07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific05-539-13Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing penFisher Scientific50-254-51Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %Fisher ScientificBP231Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)Fisher Scientific3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)LabnetI5110A
Fluorescence stereo microscopeZeissAxio Zoom.V16Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-4Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)Fisher ScientificBP117-100Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)Millipore SigmaM3761Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)Millipore SigmaP7629Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol freeFisher ScientificAA433689MChemical waste, proper disposal required
Petri dishesFisher ScientificFB087571210 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)Millipore SigmaP3813Used to make 10 X PBS stock
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Shaking incubatorBenchmarkH2010Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscopeLeicaS9iOr similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forcepsFine Science Tools91150-20Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shakerScilogexSK-D1807-E
Transfer pipetteMillipore SigmaZ1350033.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tosMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlToolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB supportMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. . Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Hammer, H. S. . Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. . Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. . GitHub - ReadImageJROI Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021)
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181RpEGEN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved